Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum (thunb ) makino

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------------

VŨ VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC
HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM
GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------------

VŨ VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC
HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM
GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. HDC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG

2. HDP: PGS.TS. TỪ BÌNH MINH

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phƣơng Thiện Thƣơng và
PGS.TS Từ Bình Minh đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong
suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu và các
anh chị, các bạn công tác tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng với nhiều máy
móc, trang thiết bị hiện đại.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá
khóa K24, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm Hoá phân tích khóa K24 đã giúp
đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia
sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, tháng 03 năm 2016
Học viên

Vũ Văn Tuấn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU………………………………………………………………………..

01

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................

03

1.1.Tổng quan về dƣợc liệu Giảo cổ lam…...…………………………………... 03
1.1.1. Đặc điểm thực vật…...……………………………………………...

03

1.1.2. Phân bố và sinh thái.……………………………………………….

04

1.1.3. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam………………………………

05

1.1.4. Công dụng và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam……..…………... 07
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học…………….

08

1.2.1. Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu …… 08
1.2.2. Phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu Giảo cổ lam ………....

09

1.2.3. Kiểm nghiệm dƣợc liệu Giảo cổ lam.………………………………

12

1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu…………………………………….

13

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM....................................................................................

14

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………...

14

2.2. Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị………………………………………………. 16
2.2.1. Chất chuẩn………………………………………………………….. 16
2.2.2. Hóa chất…...………………………………………………………..

16

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ…...……………………………………………….

16

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.…………...……………………………………...

17

2.3.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn…………………....……………….. 17
2.3.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu...…………………………………………..

17

2.3.3. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………... 18
2.4. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích…………

19

2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho quá trình phân
tích HPLC……….………………………………………………………… 19


2.4.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích...…………………………………

19

2.4.3. Phân tích mẫu thực tế………………………………………………. 21
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................

22

3.1. Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký……………...

22

3.1.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu….…..

22

3.1.2. Khảo sát thành phần pha động……………………………………...

24

3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 29
3.1.4. Điều kiện tối ƣu cho quá trình tách hai hợp chất Rutin và

31

Ginsenoside Rb1…………………………………………………………..
3.1.5. Định tính các hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo

31

cổ lam……………………………………………………………………...
3.2. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng………………….

32

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn…………….

32

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng…………………………. 34
3.2.3. Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………….. 36
3.3. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………………….

39

3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết………………………………………. 39
3.3.2. Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………….. 40
3.3.3. Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu………………………………..

42

3.3.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam…………………...

44

3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích…………………………………………..

45

3.4.1. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp………………………………..

45

3.4.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……………………………………. 48
3.5. Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………. 52
BÀN LUẬN…………………………………………………………………….. 56
KẾT LUẬN……………………………………………………………………..
TÀI LIỆU THAM KHẢO

58


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích………………………………………….

15

Bảng 2.2: Chƣơng trình dung môi rửa giải…………………………………………. 19
Bảng 3.1: Chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH–nƣớc………...

24

Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với
từng chƣơng trình gradient………………………………………………………….

25

Bảng 3.3: Các chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động ACN–nƣớc…...…

26

Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với
từng chƣơng trình gradient………………………………………………………...

26

Bảng 3.5: Chƣơng trình gradient tối ƣu với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit
photphoric………………..................................................................................

28

Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử với pha
động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric ………………………..……..

28

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột…………….

30

Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất………………………

32

Bảng 3.9: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các chất………………………………..

34

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các chất……………….. 35
Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng
chuẩn Rutin…………………………………………………………………….......

36

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn
của Rutin...................................................................................................................

38

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi chiết……………………….

40

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết siêu âm……………….. 41
Bảng 3.15: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết siêu âm………………. 42

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết hồi lƣu………………... 43
Bảng 3.17: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết và số lần chiết………..

44


Bảng 3.18: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp
phân tích Rutin……………………………………………………………………..

46

Bảng 3.19: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp phân tích
Ginsenoside Rb1……………………………………………………………………. 46
Bảng 3.20: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thêm chuẩn… 47
Bảng 3.21: Các đại lƣợng thống kê…………………………………………………

47

Bảng 3.22: Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất…………………..

48

Bảng 3.23: Kết quả hàm lƣợng Rutin và Ginsenoside Rb1 tìm lại đƣợc bằng
phƣơng pháp thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau………….……………….

49

Bảng 3.24: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân
tích tiến hành bởi ba kỹ thuật viên khác nhau………………………………………

50

Bảng 3.25: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp lại của phƣơng pháp phân tích………..

51

Bảng 3.26: Kết quả phân tích mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam………………..………..

52


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Dƣợc liệu Giảo cổ lam………………….……………………………….. 03
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của một vài saponin và flavonoid có trong Giảo cổ
lam .………………………………………………………………………………… 06
Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu Giảo cổ lam và sản phẩm trà Giảo cổ lam………….

15

Hình 3.1: Phổ UV-VIS của hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1………..……..

22

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chƣơng trình gradient thử nghiệm với
hệ dung môi MeOH–nƣớc………………………………………………………...

25

Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC đối với các chƣơng trình gradient thử nghiệm với
hệ dung môi ACN–nƣớc…………………………………………………………..

26

Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC của các cấu tử ứng với chƣơng trình gradient thử
nghiệm với hệ dung môi ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric……………....

29

Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo cổ lam

32

Vĩnh Phúc……………………………………………………………..……………
Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……………………………………………………….

33

Hình 3.7: Đƣờng chuẩn các chất…………………………………………………...

34

Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng Rutin và Ginsenoside Rb1 trong
các mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam..………………………………………..

54


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
ACN

Abs
AS
EtOH
GC
HPLC
HPLC-ESI-MS/MS
HPLC-DAD/FLD
HPLC-DADAPCI/MSn
LOD
LOQ
MeOH
PDA
ppm
ppb
ppt
R
RS
RP-HPLC
% RSD
% RSDR
SD
tR
UV-VIS
VWD
IR

Tên đầy đủ
Acetonitril
Absorbance: Độ hấp thụ quang
Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic

Etanol
Gas chromatography: Sắc ký khí
High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu
năng cao
Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ
Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và phát quang
Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và khối phổ với hệ ion hóa
hóa học ở áp suất khí quyển
Limit of Detection: Giới hạn phát hiện
Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng
Metanol
Photo-diode-array: Mảng điot điện tử
Parts per million: Phần triệu
Parts per billion: Phần tỷ
Parts per trillion: Phần nghìn tỷ
Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan
Resolution: Độ phân giải
Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo
% Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối
% Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái lặp
tƣơng đối
Standard deviation: Độ lệch chuẩn
Retention time: Thời gian lƣu
Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến
Variable Wavelength Detector
Infrared: Hồng ngoại


MỞ ĐẦU
Theo số liệu thống kê của Viện Dƣợc liệu, hiện nay ở nƣớc ta có gần 5000 loài

thực vật đã đƣợc ngƣời dân sử dụng trong y học cổ truyền, y học dân gian, chiếm gần
1/3 tổng số loài thực vật đã biết ở Việt Nam. Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma
pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một trong các cây thuốc quý hiếm đƣợc ngƣời dân
sử dụng trong việc điều trị các bệnh biến chứng về tim mạch, làm tan các cục máu
đông, chống huyết khối, hạ mỡ máu. Uống nƣớc từ cây thuốc Giảo cổ lam hàng ngày
giúp giảm căng thẳng, tăng cƣờng sức khỏe, chống lại quá trình lão hóa, hạ đƣờng
huyết, bảo vệ tế bào gan, tăng tiết mật, tăng cƣờng chức năng giải độc cho gan, hỗ trợ
điều trị bệnh ung thƣ. Thậm chí ở Nhật Bản và Trung Quốc, ngƣời ta còn coi Giảo cổ
lam nhƣ một phƣơng thuốc trƣờng sinh. Theo các nghiên cứu đã công bố thì hai nhóm
hoạt chất chính và có tác dụng trong Giảo cổ lam là flavonoid và saponin.
Nƣớc ta hiện có 05 loài thuộc chi Gynostemma [3]. Các loài này có đặc điểm
hình thái rất giống nhau. Các dƣợc liệu không phải loài Gynostemma pentaphyllum vẫn
đƣợc các thƣơng gia gọi với tên "Giảo cổ lam" và quảng cáo những tác dụng chữa bệnh
của dƣợc liệu Giảo cổ lam. Trên thị trƣờng hiện nay, vị thuốc quý này chủ yếu đƣợc
bán dƣới dạng túi trà, các sản phẩm từ Giảo cổ lam không rõ nguồn gốc đang đƣợc bày
bán rất nhiều. Điều này không những ảnh hƣởng đến hiệu quả điều trị, sức khỏe và
quyền lợi của ngƣời bệnh mà còn gây mất lòng tin của ngƣời tiêu dùng khi sử dụng
thuốc từ dƣợc liệu nói chung và Giảo cổ lam nói riêng. Ngoài ra, thành phần hóa học,
hàm lƣợng các hoạt chất của Giảo cổ lam ở các vùng có điều kiện thổ nhƣỡng, khí hậu
khác nhau thì cũng khác nhau. Đây cũng là một vấn đề cần phải nghiên cứu.
Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV (2009) chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam
[3]. Do đó, việc kiểm soát, đánh giá chất lƣợng của các mẫu Giảo cổ lam và các sản
phẩm từ dƣợc liệu này gặp nhiều khó khăn. Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa
học Giảo cổ lam đã công bố ở trong nƣớc chỉ dừng ở mức định tính hoặc là xác định
một nhóm chất [9], [10], [12]. Các nghiên cứu đã công bố ở nƣớc ngoài sử dụng các kỹ

1


thuật, hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn

vị kiểm nghiệm và sản xuất trong nƣớc. Các phƣơng pháp xử lý mẫu tốn kém, tốn
nhiều thời gian [25], [31], [38]. Ngoài ra, thành phần hóa học của các mẫu này cũng
khác so với nguyên liệu Giảo cổ lam ở trong nƣớc. Do đó, việc xây dựng một phƣơng
pháp định lƣợng (khẳng định tính đúng và đánh giá chất lƣợng) của dƣợc liệu Giảo cổ
lam là hết sức cần thiết. Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, Rutin và
Ginsenoside Rb1 là hai hợp chất chính trong Giảo cổ lam và có nhiều tác dụng tốt đối
với sức khỏe con ngƣời [23], [40].
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng
phƣơng pháp định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma
pentaphyllum (Thunb.) Makino” với các mục tiêu
- Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất Rutin và Ginsenoside
Rb1 trong dƣợc liệu Giảo cổ lam bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
- Xác định đƣợc hàm lƣợng của hai hoạt chất này trong dƣợc liệu Giảo cổ lam
thu hái tại các vùng khác nhau, các mẫu thu mua trên thị trƣờng và sản phẩm chế biến
từ dƣợc liệu Giảo cổ lam.

2


Chƣơng I - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dƣợc liệu Giảo cổ lam
Giảo cổ lam hay còn gọi là Cổ yếm, Thƣ tràng năm lá có tên khoa học là
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [6],
[15]. Theo nghiên cứu đã công bố, ở Việt Nam hiện nay có 05 loài thuộc chi
Gynostemma bao gồm Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), Cổ
yếm lá bóng (Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.), Giảo cổ lam Miến Điện
(Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.), Giảo cổ lam bảy lá (Gynostemma
longipes C. Y. W), Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X. X. Chen & D.
R. Liang [3]. Trong các loài kể trên, loài Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) là

loài đƣợc quan tâm nghiên cứu hơn cả. Các tác dụng của dƣợc liệu Giảo cổ lam đã
đƣợc chứng minh qua rất nhiều các nghiên cứu cả ở trong và ngoài nƣớc. Trong phạm
vi của luận văn, chúng tôi sử dụng dƣợc liệu này làm đối tƣợng để nghiên cứu.

Hình 1.1. Dƣợc liệu Giảo cổ lam
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, thân và nhánh mảnh, có góc-rãnh, nhẵn hoặc có lông tơ rải rác. Lá kép
chân vịt 3-7 lá chét, có lông tơ hoặc nhẵn; lá chét hình trứng-thuôn hoặc mác, lá chét
giữa 3-12 × 1,5-4 cm, lá chét bên nhỏ hơn, cả hai mặt đôi khi có lông cứng, gân bên 6-

3


8 đôi, gốc hẹp dần vào cuống, mép khía tai bèo, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn ngắn;
cuống lá chét 1-5 mm. Tua cuốn dạng chỉ, 2 nhánh. Hoa đực trong cụm hoa chùy,
cuống cụm hoa dạng chỉ, 10-15 (-30) cm, rất nhiều nhánh; cuống hoa dạng chỉ, 1-4
mm; lá bắc hình giùi; ống đài rất ngắn; thùy đài hình tam giác, khoảng 0,7 mm, đỉnh
nhọn; tràng màu xanh lá cây nhạt hoặc trắng; thùy tràng hình trứng-mác, 2,5-3×
khoảng 1 mm, 1 gân, đỉnh có mũi nhọn dài. Hoa cái: cụm hoa chùy ngắn hơn cụm hoa
đực; đài và tràng giống hoa đực; bầu hình cầu, 2 hoặc 3 ô; vòi nhụy 3; núm nhụy 2
thùy; nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, đen khi trƣởng thành, hình cầu, đƣờng kính 56 mm; 2-3 hạt, nhẵn hoặc dày đặc lông cứng và lông tơ. Hạt nâu, trứng-tim, đƣờng
kính khoảng 4 mm, dẹt, hai mặt có nhú, gốc tim, đỉnh tù. Hoa tháng 3-11, quả tháng 412. [3], [15]
1.1.2. Phân bố và sinh thái
Giảo cổ lam là cây ƣa ẩm, ƣa sáng đồng thời cũng hơi chịu bóng. Cây thƣờng
mọc ở trong rừng, lùm bụi hoặc ven đƣờng ở sƣờn núi, độ cao từ 100 đến hơn 3000 m
[6].
Giảo cổ lam có ở nhiều quốc gia nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Triều Tiên,
Nhật Bản. Ở nƣớc ta, cây phân bố ở một số tỉnh nhƣ Lào Cai (Sapa), Cao Bằng, Lạng
Sơn, Quảng Ninh (Móng Cái, Hà Côi), Hòa Bình, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Quảng Bình
(Vƣờn Quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng), Kon Tum, Đồng Nai [3]. Giảo cổ lam sinh

trƣởng mạnh trong mùa mƣa ẩm, từ tháng 4 đến tháng 8. Cây ra quả hàng năm. Do trữ
lƣợng tự nhiên hạn chế, lại bị tìm kiếm khai thác mạnh, nên Giảo cổ lam đã đƣợc đƣa
vào tài liệu “Danh lục đỏ các cây thuốc Việt Nam (2006)” và tài liệu “Sách đỏ Việt
Nam, phần II-Thực vật (2007)” nhằm khuyến cáo bảo vệ. Thời gian gần đây, để phục
vụ nhu cầu sử dụng cao của ngƣời dân, cây đã đƣợc đƣa vào trồng ở một số địa phƣơng
miền núi và cho kết quả tốt [6], [15].

4


1.1.3. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam
Các nghiên cứu đã đƣợc công bố ở trong và ngoài nƣớc chỉ ra rằng thành phần
hóa học chính và có tác dụng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là
saponin và flavonoid [30], [35], [36], [37]. Ngoài ra còn một số nhóm chất khác.
1.1.3.1. Nhóm Saponin
Saponin là thành phần hóa học chính trong Giảo cổ lam. Hàm lƣợng saponin
toàn phần tính theo Ginsenoside Rb1 trong 3 mẫu thu hái tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc),
Hòa Bình và Đà Lạt lần lƣợt là 4,12%; 5,10% và 4,12% [2], [12]. Các saponin có trong
Giảo cổ lam thuộc nhóm saponin triterpen có khung dammaran tƣơng tự nhƣ trong
Nhân sâm (Panax gisneng) với nhiều tác dụng quý đã đƣợc chứng minh [26]. Cho đến
nay đã có khoảng trên 100 saponin đƣợc phân lập từ loài Giảo cổ lam (Gynostemma
pentaphyllum (Thunb.) Makino). Trong đó, có một vài các saponin khung
protopanaxadiol của loài Panax ginseng nhƣ Ginsenoside Rb1 (Gypenoside III),
Ginsenoside Rc, Ginsenoside Rb3 (Gypenoside IV), Ginsenoside Rd (Gypenoside
VIII), Ginsenoside Rg3, Ginsenoside malonyl- Rb1 và Ginsenoside malonyl-Rd [20],
[29], [25], [38]. Hợp chất Ginsenoside Rb1 có hàm lƣợng cao trong các mẫu Giảo cổ
lam thu hái tại Trung Quốc dao động trong khoảng từ 0,08-0,15% [28]. Hợp chất này
cũng đƣợc sử dụng làm chất đánh dấu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay”
bằng 02 phƣơng pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dƣợc liệu
Giảo cổ lam [40].

1.1.3.2. Nhóm flavonoid
Cùng với sapomin, flavonoid là một trong hai nhóm chất chính có trong Giảo cổ
lam. Các flavonoid có trong loài Gynostemma pentaphyllum chủ yếu là các flavonol.
Một số flavonoid đã đƣợc tìm thấy trong loài này ở Việt Nam nhƣ: Ombuin,
Ombuoside, Rutin, Quercetin, Quercetin-4,7-dimetylete [1]. Ngoài ra sự có mặt của
các hợp chất nhƣ Vitexin, Quercetin-3-O-β-D-glucosid và Kaempferol-3-O-rutinosid
trong Giảo cổ lam cũng đã đƣợc công bố trong các nghiên cứu trƣớc đây [25], [30],

5


[37]. Trong các flavonoid nói trên, hợp chất Rutin là hợp chất có hàm lƣợng cao và đã
đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02
phƣơng pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dƣợc liệu Giảo cổ
lam [23], [28], [40].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một vài saponin và flavonoid có trong Giảo cổ lam
1.1.3.3. Các thành phần khác
Ngoài 02 nhóm hoạt chất chính là saponin và flavonoid, trong loài Giảo cổ lam
còn chứa các sterol bao gồm ergostanol, β-sitosterolvà stigmasterol [33], các nguyên tố
vô cơ bao gồm: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag, polysaccharid,
vitamin, khoáng chất và các amino axit [29].

6


1.1.4. Công dụng và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam
Theo Y học dân gian, Giảo cổ lam có tác dụng tăng cƣờng sinh lực, thanh nhiệt,
giải độc. Ở Trung Quốc, Giảo cổ lam đƣợc dùng làm thuốc bổ và đƣợc xếp vào 10 loại
thảo dƣợc có tác dụng bổ nhất ở Trung Quốc. Lá loài này đƣợc dùng làm trà thuốc gọi

là trà dƣỡng não. Thân và lá còn đƣợc sử dụng để chữa bệnh đái tháo đƣờng. Ngoài ra,
Giảo cổ lam còn đƣợc sử dụng để chữa viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong
thấp, đau nhức xƣơng khớp, các bệnh về tim mạch, béo phì [6], [15].
GS.TS Phạm Thanh Kỳ (Đại học Dƣợc Hà Nội) là nhà khoa học nghiên cứu đầu
tiên và chuyên sâu về cây Giảo cổ lam ở Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu của GS.TS
Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã công bố cho thấy, dịch chiết cồn tỷ lệ 1:1 (1 ml dịch
chiết tƣơng đƣơng 1 g dƣợc liệu) của Giảo cổ lam có tác dụng hạ cholesterol máu trong
cả hai khảo nghiệm gây tăng cholesterol máu thực nghiệm bằng cách cho thỏ uống
cholesterol (Cơ chế ngoại sinh) và gây tăng cholesterol máu thực nghiệm bằng cách
tiêm tween 80 (Cơ chế nội sinh). Trong thử nghiệm gây tăng cholesterol ngoại sinh, sử
dụng Giảo cổ lam với liều uống 10 g dƣợc liệu/kg thể trọng chuột trong 10 ngày, có tác
dụng ức chế sự tăng cholesterol 71% so với nhóm đối chứng. Trong thử nghiệm gây
tăng cholesterol nội sinh, cao chiết ethanol của Giảo cổ lam với liều 5g dƣợc liệu /kg
thể trọng thỏ có tác dụng hạ cholesterol máu 82% so với nhóm đối chứng [5], [7]. Kết
quả có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, tác dụng tăng lực, tác dụng bảo vệ tế bào gan,
tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng u, tăng cƣờng miễn dịch của dƣợc liệu Giảo
cổ lam thu hái ở Việt Nam cũng đã đƣợc chứng minh qua các nghiên cứu khoa học
thực nghiệm [5], [7], [8].
Ở trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu các tác dụng dƣợc lý của loài Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum). Các kết quả nghiên cứu cho thấy, tác dụng của dƣợc
liệu Giảo cổ lam chủ yếu do hai thành phần là flavonoid và saponin (Gypenoside) có
trong thành phần của nó mang lại. Nghiên cứu tác dụng sinh học của loài Giảo cổ lam
chủ yếu do các nhà khoa học Trung Quốc công bố [19], [22], [34], [39]. Ngoài các tác

7


dụng đã liệt kê ở trên, dƣợc liệu Giảo cổ lam còn đƣợc chứng minh có tác dụng hạ
đƣờng huyết, tác dụng tốt với hệ tim mạch, cải thiện trí nhớ, chống độc, giúp an thần,
hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày [35]. Vì có rất nhiều tác dụng quý đối với sức khoẻ con

ngƣời nên dƣợc liệu Giảo cổ lam đƣợc gọi là cây trƣờng sinh [17].
Trong các nghiên cứu định tính cũng nhƣ định lƣợng dƣợc liệu Giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum), hai hợp chất đƣợc lựa chọn làm chất đối chiếu là
Ginsenoside Rb1 và Rutin (một hợp chất saponin và một hợp chất flavonoid) [23],
[28], [40]. Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy hai hợp chất này có rất nhiều
tác dụng sinh học đáng quý. Hợp chất Rutin đã đƣợc chứng minh là có tác dụng chống
oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đƣờng, bảo vệ gan, hạ lipid máu, điều trị bệnh
Alzheimer, tăng lực, hạ huyết áp, kháng u [16]. Hợp chất Ginsenoside Rb1 có tác dụng
tăng cƣờng sức đề kháng, bảo vệ gan, hạ cholesterol máu [26], [27]. Nhƣ vậy có thể
thấy rằng, Ginsenoside Rb1 và Rutin là hai hợp chất chính trong Giảo cổ lam và có
nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngƣời. Vì vậy, trong khuôn khổ của đề tài,
chúng tôi sẽ tiến hành xây dựng một phƣơng pháp định lƣợng đồng thời hai hợp chất
Rutin và Ginsenoside Rb1 nhằm đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Giảo cổ lam, một cây
thuốc quý ở Việt Nam.
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của dƣợc liệu
1.2.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu
Dƣợc liệu là đối tƣợng phân tích có thành phần nền phức tạp. Thông thƣờng,
trong dƣợc liệu chứa không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau
mà thƣờng chứa một nhóm chất có các tính chất tƣơng đối giống nhau (flavonoid,
anthraquinon, saponin, coumarin…). Các chất trong cùng một nhóm có khung cơ bản
giống nhau, chỉ khác nhau về nhóm thế dẫn đến không có sự sai khác nhiều về tính
chất hóa học cũng nhƣ tính chất vật lý. Chính vì vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp
nhƣ UV-VIS, IR, huỳnh quang để phân tích, định lƣợng một thành phần trong dƣợc
liệu gặp khó khăn và gần nhƣ là không thể thực hiện đƣợc.

8


Sắc ký là một trong những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng hoạt chất thông
dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lƣợng hóa học,

phƣơng pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp,
phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dƣợc liệu. Ngƣời ta có thể định lƣợng một
chất hoặc nhiều chất đồng thời nếu lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký phù hợp. Các
phƣơng pháp sắc ký hay đƣợc sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí
(GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản [4]. Trong các phƣơng pháp kể
trên, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp có nhiều ứng dụng trong
nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dƣợc liệu nói riêng. Ƣu
điểm lớn nhất của phƣơng pháp là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên
khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với phƣơng pháp sắc ký khí (thƣờng dùng với
các đối tƣợng dễ bay hơi). Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ phân cực tới
không phân cực, từ các chất dễ bay hơi đến khó bay hơi, từ các chất trung tính tới các
chất điện ly… Trong lĩnh vực dƣợc liệu, HPLC thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong định
lƣợng riêng lẻ các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dƣợc liệu bằng việc
so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích [4]. Với mục tiêu
của nghiên cứu là xây dựng phƣơng pháp định lƣợng các hợp chất thuộc hai nhóm là
flavonoid và saponin trong dƣợc liệu Giảo cổ lam, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp
nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.2.2. Phân tích thành phần hóa học của dược liệu Giảo cổ lam
Có rất nhiều kỹ thuật ghép nối với hệ thống HPLC đã đƣợc sử dụng để phân tích
các hợp chất thuộc hai nhóm flavonoid và saponin nhƣ HPLC-ESI-MS/MS, HPLCDAD/FLD, HPLC-DAD-APCI/MS…Các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết
bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất. Kỹ
thuật HPLC-UV/VIS khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên, vì vậy chúng tôi lựa
chọn phƣơng pháp này để phân tích các thành phần hóa học trong dƣợc liệu Giảo cổ
lam.

9


Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu phân tích thành phần hóa học trong dƣợc
liệu Giảo cổ lam. Các nghiên cứu này sử dụng hoạt chất Ginsenoside Rb1 làm chất đối

chiếu. Mặc dù vậy, các nghiên cứu cũng chỉ dừng lại ở việc định tính nhóm saponin
bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng [9], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10], định
lƣợng saponin toàn phần bằng phƣơng pháp đo quang [12]. Chƣa có nghiên cứu nào
định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu Giảo cổ lam đƣợc công bố.
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu, phân tích thành phần hóa học của loài
Gynostemma pentaphyllum.
Năm 2007, nhóm tác giả ngƣời Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu xây dựng
"dấu vân tay" HPLC của các hợp chất flavonoid trong loài Gynostemma pentaphyllum.
Nghiên cứu sử dụng pha tĩnh là cột pha đảo C18 TURNER Kromasil (250 x 4,6 mm; 5
µm), pha động là hỗn hợp axit photphoric 0,4%, MeOH và ACN, tốc độ dòng 0,5
ml/phút, bƣớc sóng phát hiện ở 280 nm. Kết quả phân tích cho thấy, 10 flavonoid đã
đƣợc phát hiện. Hình ảnh sắc ký đồ của nghiên cứu có thể đƣợc sử dụng để kiểm tra
chất lƣợng (tính đúng) của dƣợc liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) [32].
Năm 2008, nhóm tác giả Kao và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp HPLC-MS để
xác định các saponin và flavonoid trong các mẫu Giảo cổ lam thu mua tại các cửa hàng
kinh doanh dƣợc liệu ở Đài Loan. Đầu tiên các hợp chất flavonoid và saponin có trong
dƣợc liệu đƣợc chiết với MeOH, tiếp theo làm giàu các hoạt chất trên bằng việc cho
cắn chiết qua cột C18 rửa giải gradient với hỗn hợp MeOH và axit formic 0,1%. Sau
đó, các hợp chất trong dịch chiết đƣợc phân tách trên hệ thống HPLC-MS của hãng
Agilent, pha tĩnh là cột pha đảo C18 Phenomenex Gemini. Để phân tích các hợp chất
saponin có trong Giảo cổ lam, nhóm tác giả sử dụng hai chất chuẩn Ginsenoside Rb3
và Ginsenoside Rd, rửa giải gradient với hệ dung môi axit formic 0,1% (A) và ACN
(B). Tƣơng tự, để phân tích các hợp chất flavonoid, chất chuẩn nội đƣợc sử dụng là
Kaempferol, hai chất chuẩn là Rutin và Kaempferol-3-O-rutinosid, pha động đƣợc sử
dụng là hỗn hợp axit formic 0,1% (A) và ACN (B) rửa giải gradient. Nghiên cứu đã

10


xác định đƣợc 18 saponin và 7 flavonoid. Hàm lƣợng flavonoid và saponin tƣơng ứng

trong loài Gynostemma pentaphyllum dao động trong khoảng từ 170,7 µg/g - 2416,5
µg/g và từ 491,0 µg/g - 89888,9 µg/g [25].
Áp dụng phƣơng pháp phân tích đã đƣợc xây dựng của tác giả Kao [25], năm
2010, nhóm tác giả Tsai YC đã tiến hành phân tích, xác định hàm lƣợng của các
flavonoid và saponin trong mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Puli, Đài Loan [38]. Ngoài ra
hàm lƣợng của axit caffeic trong loài này cũng đã đƣợc báo cáo. Các flavonoid đƣợc
phát hiện ở bƣớc sóng UV-280 nm, trong khi đó các saponin đƣợc phát hiện ở hai bƣớc
sóng 202 nm hoặc 210 nm. Kết quả phân tích phát hiện 30 saponin trong đó xác định
đƣợc 17 saponin. Bên cạnh đó, 8 flavonoid cũng đã đƣợc phát hiện. Hàm lƣợng của các
flavonoid cũng nhƣ saponin trong loài Gynostemma pentaphyllum ở nghiên cứu này
thấp hơn khá nhiều so với nghiên cứu của nhóm tác giả Kao mặc dù các điều kiện phân
tích gần nhƣ tƣơng tự [25].
Năm 2013, nhóm tác giả của Trung Quốc đã sử dụng hai phƣơng pháp là
UPLC−Q-TOF-MS và HPLC−ELSD để phân tích đánh giá chất lƣợng của 22 mẫu trà
Giảo cổ lam thu mua ở các tỉnh của Trung Quốc và một mẫu thu mua ở Nhật Bản.
Phƣơng pháp UPLC−Q-TOF-MS đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng của các
Ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, và F2. Trong khi đó phƣơng pháp HPLC-ELSD đƣợc sử
dụng để định lƣợng hợp chất 20(S)-panaxadiol trong dịch chiết của loài Gynostemma
pentaphyllum sau khi thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho biết, hàm lƣợng của các
Ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, và F2 và hợp chất 20(S)-panaxadiol trong dịch chiết sau
khi thủy phân của các mẫu trà ngọt Giảo cổ lam cao hơn đáng kể so với các mẫu trà
đắng Giảo cổ lam. Trong cùng một mẫu trà thì hàm lƣợng của Ginsenoside Rb1 >
Ginsenoside Rb3 > Ginsenoside F2 > Ginsenoside Rd [31].
Cũng trong năm 2013, Liao đã đã sử dụng phƣơng pháp là UV-HPLC để phân
tích đánh giá chất lƣợng của các mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam. Ba hợp chất đƣợc lựa
chọn làm hợp chất đối chiếu bao gồm Rutin, Quercetin và Ginsenoside Rb1. Trong

11

nghiên cứu này, bƣớc sóng đƣợc sử dụng để định lƣợng hợp chất Ginsenoside Rb1 là
203 nm và bƣớc sóng để định lƣợng 02 hợp chất flavonoid còn lại là 257 nm. Các mẫu
dƣợc liệu đƣợc xử lý bằng chiết hồi lƣu ở 600C với MeOH. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, hàm lƣợng Ginsenoside Rb1 trong các mẫu dƣợc liệu dao động trong khoảng
0,08-0,15%, hàm lƣợng Rutin và Quercetin lần lƣợt dao động trong khoảng từ 0,020,04% và 0,02-0,03% [28]. Hai hợp chất Ginsenoside Rb1và Rutin cũng đƣợc sử dụng
làm chất đánh dấu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02 phƣơng pháp
là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lƣợng (tính đúng)
của dƣợc liệu Giảo cổ lam. Tài liệu này sử dụng MeOH làm dung môi chiết xuất. Pha
động trong phƣơng pháp HPLC là hỗn hợp H 3PO4 0,01% và ACN với chế độ rửa giải
gradient [40].
1.2.3. Kiểm nghiệm dược liệu Giảo cổ lam
Dƣợc điển là tài liệu chính thống, thƣờng đƣợc các đơn vị nghiên cứu, kiểm
nghiệm và sản xuất áp dụng để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Giảo cổ lam ở
Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới.
Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam [3]. Do
đó, chƣa có quy chuẩn để đánh giá chất lƣợng của dƣợc liệu Giảo cổ lam cũng nhƣ các
sản phẩm có nguồn gốc từ dƣợc liệu này.
Dƣợc điển Trung Quốc (2010) cũng chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam [18].
Dƣợc điển Hồng Kông (2012), quy định hai hợp chất Ombuoside và Rutin làm
hai chất đối chiếu trong chỉ tiêu định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng. Bên
cạnh đó, thì sự có mặt của 4 flavonoid bao gồm Rutin, Ombuoside, Quercetin, Ombuin
trong Giảo cổ lam cũng đƣợc quy định trong tiêu chí định tính "dấu vân tay" HPLC
[23].
1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phƣơng pháp định lƣợng
đó là phƣơng pháp xử lý mẫu. Thông thƣờng đối với các mẫu thực vật, sử dụng dung

12

môi hữu cơ hoặc nƣớc để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật, quá trình đó gọi là chiết
xuất. Sản phẩm của quá trình này là một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi,
gọi là dịch chiết [4], [14]. Có nhiều phƣơng pháp chiết, phƣơng pháp phổ biến là chiết
nóng bằng nƣớc. Tuy nhiên, trong thực vật có rất nhiều các chất không tan trong nƣớc.
Khi đó, ta phải thay thế bằng các dung môi hữu cơ nhƣ EtOH, MeOH, cloroform…
Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt
độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào…[4], [14].
Có rất nhiều kỹ thuật chiết xuất khác nhau. Trong phòng thí nghiệm, một số
phƣơng pháp chiết xuất cổ điển thƣờng đƣợc sử dụng ở quy mô phân tích nhƣ: chiết
Soxhlet, chiết hồi lƣu, chiết siêu âm…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học
công nghệ, có nhiều phƣơng pháp chiết tiên tiến đƣợc sử dụng với mục đích giảm
lƣợng dung môi, hóa chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi trƣờng
nhƣ: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn.. Tuy nhiên các kỹ thuật này đều
tƣơng đối phức tạp và kinh phí tốn kém. Do đó, khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn
vị kiểm nghiệm [14].
Với mục đích định lƣợng hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1, các nghiên
cứu đã công bố đều sử dụng dung môi MeOH làm dung môi chiết xuất với các phƣơng
pháp chủ yếu là chiết hồi lƣu và chiết siêu âm [23], [25], [28], [40]. Điều này hoàn
toàn phù hợp do 02 hợp chất nghiên cứu là các hợp chất phân cực do đó phải sử dụng
các dung môi phân cực để chiết xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiến hành
khảo sát các điều kiện chiết xuất nhƣ dung môi, thời gian chiết, số lần chiết, phƣơng
pháp chiết, từ đó lựa chọn đƣợc phƣơng pháp xử lý mẫu.

13


CHƢƠNG II - THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu Giảo cổ lam đã đƣợc xác định tên khoa học đều có 02 thành phần là
Rutin và Ginsenoside Rb1. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn mẫu dƣợc liệu

Giảo cổ lam thu hái tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc) để tiến hành khảo sát nhằm xây dựng
phƣơng pháp phân tích. Từ đó, tiếp tục định lƣợng Rutin và Ginsenoside Rb1 trong các
mẫu Giảo cổ lam thu hái tại các vùng khác, mỗi vùng lấy 03 mẫu để phân tích. Ngoài
ra, chúng tôi còn tiến hành phân tích 02 mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu mua trên thị
trƣờng và mẫu sản phẩm trà Giảo cổ lam của Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh.
Dƣợc liệu Giảo cổ lam dùng làm mẫu nghiên cứu đƣợc thu hái tại các vùng khác
nhau ở Việt Nam. Mẫu đƣợc lấy là phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam. Các mẫu
thu hái tự nhiên đều đã đƣợc xác định tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino, họ Bầu bí (Curcubitaceae) bởi các chuyên gia thực vật của Viện
Dƣợc liệu. Mẫu thu hái đƣợc rửa sạch, sấy trong tủ sấy chân không ở 600C đến khô và
bảo quản trong túi nilon kín. Các mẫu nghiên cứu đƣợc lƣu giữ tại Khoa Hóa phân
tích-Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Mỗi mẫu phân tích đƣợc lấy đồng đều, nghiền thành
bột mịn, kích thƣớc 1mm, đủ dùng cho nghiên cứu.
Mẫu sản phẩm trà Giảo cổ lam của công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh từ
dƣợc liệu Giảo cổ lam cũng đƣợc thái nhỏ, sấy khô chuẩn bị cho nghiên cứu (Xem hình
2.1 và Bảng 2.1).

14


A

B

Hình 2.1. Hình ảnh dƣợc liệu Giảo cổ lam (A) và sản phẩm trà Giảo cổ lam (B)
Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu phân tích
STT

Tên mẫu

1

GCL-Vĩnh Phúc

2

GCL Quảng
Bình

3

GCL-Hòa Bình

4

GCL-Lào Cai

5

6

7

GCL thị trƣờng
1
GCL thị trƣờng
2
GCL-BM

Nơi thu

Tam Đảo, Vĩnh Phúc
Vƣờn Quốc gia Phong Nha–Kẻ
Bàng, Quảng Bình
Khu bảo tồn thiên nhiên Ngọc
Sơn–Ngổ Luông, Hòa Bình
Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc
Sapa, Viện Dƣợc liệu
Chợ Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội
Chợ Lãn Ông, Hoàn Kiếm, Hà
Nội
Công ty cổ phần dƣợc phẩm Bình
Minh

15

Ngày lấy

Độ ẩm

mẫu

(%)

15/7/2015

11,17

23/10/2015

9,48

18/6/2015

10,72

21/8/2015

11,56

17/8/2015

12,34

17/8/2015

10,09

06/09/2015

6,08


2.2. Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị
2.2.1. Chất chuẩn
- Chất chuẩn Ginsenoside Rb1 của hãng Shyuanye–Trung Quốc, độ tinh khiết 98,0%;
Công thức phân tử: C54H92O3; Khối lƣợng phân tử: 1109,29 ĐvC.
- Chất chuẩn Rutin của hãng Sigma–Aldrich, độ tinh khiết 95,0%; Công thức phân tử:
C27H50O16; Khối lƣợng phân tử: 610,52 ĐvC.
2.2.2. Hóa chất
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhƣ MeOH, ACN của

hãng Merck.
- Axit photphoric (H3PO4) của hãng Merck (Đức).
- Các dung môi hóa chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích (P.A.)
- Nƣớc cất sử dụng là nƣớc cất hai lần đã đƣợc deion hóa.
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ
* Thiết bị
- Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC–20AD, bộ tiêm mẫu tự động
SIL–20AHT, detector UV-VIS, phần mềm Labsolution để điều khiển chƣơng trình,
truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC.
- Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ Supelguard
Ascentis C18 (20 mm × 4,0 mm; 5 µm).
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.
- Máy đo pH MP220K của hãng Toledo với điện cực thủy tinh và điện cực calomen
bão hòa.
- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Power Sonic 405.
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) UV 1800 của hãng Shimadzu, Nhật Bản.
* Dụng cụ
- Bình cầu đáy bằng có nút nhám, dung tích 100 ml của hãng Isolab - Đức.

16