nhan giong vo tinh dong vat

I. LỜI MỞ ĐẦU
Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng
di truyền của cây trồng, vật nuôi...nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả
sản xuất nông nghiệp. Trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu
sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen của sinh
vật. Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được qua lai
tạo và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ
hợp hai bộ nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái. Một
hạn chế nữa là việc lai tạo tự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể
trong loài. Lai xa, lai khác loài gặp nhiều khó khăn, con lai thường bất
thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về số lượng lẫn hình thái
giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học... giữa
các loài không phù hợp với nhau. Gần đây, nhờ những thành tựu trong
lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép
khắc phục những trở ngại nói trên. Nó cho phép chỉ đưa những gen
mong muốn vào động vật, thực vật...để tạo ra những giống vật nuôi,
cây trồng mới..., kể cả việc đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa
gen của loài này vào loài khác.
Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu trên của công nghệ sinh học hiện đại, vào
năm 1982 Palmiter và cộng sự đã chuyển được gen hormone sinh
trưởng của chuột cống vào chuột nhắt, tạo ra được chuột nhắt “khổng
lồ“. Từ đó đến nay hàng loạt động vật nuôi chuyển gen và nhân bản vô
tính đã được tạo ra như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá ...Trong hướng này
các nhà nghiên cứu tập trung vào những mục tiêu: tạo ra động vật
chuyên sản xuất protein quí phục vụ y học; tạo ra động vật có sức
chống chịu tốt (chống chịu bệnh tật, sự thay đổi của điều kiện môi
trường...); tạo ra các vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng
thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt. Ðộng vật
chuyển gen và động vật nhân bản vô tính còn được sử dụng làm mô
hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra
các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư,

AIDS, thần kinh, tim mạch..
II. NỘI DUNG
1. Công nghệ tạo động vật chuyển gen
1.1. Khái niệm
Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển)
xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được
truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển
gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại
cho thế hệ sau.
1.2. Lịch sử phát triển
Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được thực hiện
với các tế bào ung thư biểu bì phôi và các tế bào ung thư quái thai để
tạo nên chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz và Illmensee, 1975;
Bradley, 1984). Trong các động vật thể khảm này, các tế bào nuôi cấy
lấy từ một dòng chuột được đưa vào phôi của một dòng chuột khác
bằng quần tụ phôi trực tiếp (direct embryo aggregation) hoặc bằng
cách tiêm vào phôi ở giai đoạn phôi nang (blastocyst).
Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực hiện
bằng cách tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã được nuôi cấy trước
(Jeanish và Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thông tin di truyền của virus
được chuyển một cách hiệu quả vào genome của động vật nhận và sau
đó ít lâu kỹ thuật sử dụng retrovirus làm vector cho các đoạn DNA
ngoại lai đặc biệt đã được phát triển (Stuhmann, 1984). Sử dụng
retrovirus như là vật truyền trung gian đối với việc chuyển gen đã tạo
nên hiện tượng khảm ở mức độ cao.
Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo động vật chuyển
gen khác đã được công bố: phương pháp chuyển gen bằng cách sử
dụng tế bào gốc phôi (Grossler,1986), phương pháp chuyển các đoạn
nhiễm sắc thể nguyên (ví dụ như chuột “transomic“, Richa và Lo,
1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ tinh in vitro

(Lavitrano, 1989). Tuy nhiên, phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân
của hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rãi
nhất để tạo động vật chuyển gen.
Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb
của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương sống
hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào genome của
động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả tế bào sinh dưỡng
và tế bào sinh sản.
Ở Việt Nam, ghép gene vào động vật khó khăn hơn nhiều so với thực
vật. Việc ghép gene vào trứng động vật chỉ tiến hành được khi trứng
vừa thụ tinh trong vòng 2-3 giờ. Với các loài cá là nhóm thụ tinh
ngoài, người ta có thể chủ động thực hiện việc thụ tinh nhân tạo và bổ
sung gene. Còn trên các động vật khác, việc này rất khó. Một buồng
trứng cá có thể có hàng vạn trứng để thí nghiệm, nhưng với bò, không
thể kích thích hàng nghìn con cùng rụng trứng để thí nghiệm được. Do
đó, công nghệ này hiện tại chỉ áp dụng trên cá, và bước đầu trên chuột
mà thôi.
1.3. Các phương pháp tiến hành
1.3.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu
hiện trong tế bào động vật
1.3.1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế
hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công cụ sử dụng để
tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA
(enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và tế bào vật
chủ. Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và
vector thường được sử dụng là plasmid.
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu
chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu chứa gen

mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme
hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong
muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA
mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ
ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các plasmid tái tổ hợp được
biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn tiến
hành sinh trưởng.
Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen
mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy
trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng triệu
bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ được tách ra
khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết. Phương
pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen mong muốn mà
không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có nguồn gốc từ
genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các đoạn intron không mã
hoá.
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm
biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động
của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn
(single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung
mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA bổ sung
(complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các
intron mà chỉ bao gồm các exon. Hoặc từ sản phẩm protein, có thể suy
ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin
trong phân tử protein. Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò
tìm đoạn gen mong muốn.
1.3.1.2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các
vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau
có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng

enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành phần của gen có thể được
tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện.
Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng cách
bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme
hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có thể xen vào cấu
trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò
điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở
trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter,
có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.
Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như
methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-
lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian virus
(SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...
enhancer: gen tăng cường.
1.3.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen.
Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là
trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh
trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ
hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ
hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia
và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có
mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành
sau này.
Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương
pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi
loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó
thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.
Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế
bào. Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng

phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau thai của
người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép...), rồi thụ tinh nhân tạo.
1.3.3. Chuyển gen vào động vật.
Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được
sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử
dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus...
1.3.4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)
Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống
nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi
(blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi
có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được cấy chuyển vào con
nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể
con. Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này.
Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion)
dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi
kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng.
Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi
tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác. Ðể khắc phục các nhược
điểm này, người ta có thể tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai
đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột.
1.3.5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen
Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không,
người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di
truyền của động vật trưởng thành hay không và sản phẩm của gen lạ có
được tổng hợp ra hay không.
Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử
trên pha rắn (Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR.
Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai
mức độ: phiên mã và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng
phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương

pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để
phát hiện protein lạ trong động vật. Theo dõi các thế hệ sau của động
vật chuyển gen (F1, F2, F3, ...) để xác định gen lạ có di truyền hay
không.
1.3.6. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục.
Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến
hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen.
1.4. Ưu nhược điểm của phương pháp chuyển gen động vật
1.4.1. Ưu điểm:
- Tạo ra sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, mang lại hiệu
quả cao.
- Rất chủ động để tạo ra giống cây con mang đặc tính mong muốn
mà không cần mất nhiều thời gian chọn lọc, theo dõi ở đời con như
phương pháp lai tạo thông thường, có thể biết trước một cách khá
chính xác các tính trạng cần tạo ra ở đời con
- Có thể tạo giống cây trồng từ nhiều nguồn vật liệu rất xa nhau
về mặt di truyền mà rất khó thành công bằng phương pháp lai thông
thường
- Tiết kiệm rất nhiều diện tích thí nghiệm đồng ruộng để duy trì
nguồn vật liệu chọn tạo
- Nhanh chóng tạo ra sản phẩm ở qui mô công nghiệp
1.4.2. Nhược điểm:
- Yêu cầu có kiến thức và hiểu biết sâu sắc về công nghệ gen,
công nghệ tế bào.
- Chi phí ban đầu tốn kém, thiết bị và hoá chất đắt tiền
- Sự hiểu biết của người tiêu dùng về GMO còn rất hạn chế, do đó
không nhận được sự ủng hộ của người tiều dùng.
- Chính phủ các nước còn có nhiều quan điểm khác nhau về
GMO, nhiều quốc gia rất dè dặt trong việc phát triển GMO.
- Nhiều tổ chức NGO phản đối GMO

1.4.3. Mục đích:
Chuyển gen ở động vật để tạo
+ Giống mới
+ Nâng cao chất lượng sản
phẩm
+ Tạo khả năng chống bệnh
+ Nâng cao khả năng chống
chịu và hấp thụ dinh dưỡng tạ
năng suất
Bò sữa được chuyển gen tạo sữa
có hàm lượng protein cao
1.5. Những thành tựu về động vật chuyển gen
Năm 1981,
Warner và CTV
(ĐH. Ohio) đã cấy
gen B – globulin của
thỏ vào phôi chuột
thành công. Từ năm
1985, nhiều công trình tạo ra động vật chuyển gen thành công trên thỏ,
cừu, lợn, bò… Những ứng dụng của nó trong nông nghiệp ngày càng
mạnh mẽ khi có nhiều động vật nuôi cho thịt được tạo ra. Nhiều gen
kháng bệnh cho lợn, cừu đã được nghiên cứu. Gần đây, người ta đã tạo
ra cừu chuyển gen cho sản lượng lông cao, bò chuyển gen cho sữa có
tỷ lệ béo thấp, hàm lượng protein cao trong sữa… đem lại nhiều lợi
nhuận cho người chăn nuôi.
Trong 10 năm qua, nhiều công ty dược phẩm đã phát triển các
động vật chuyển gen để sản xuất các protein trị liệu, các mô – cơ quan
để cấy ghép cho người bệnh. Sử dụng động vật biến đổi gen có nhiều
ưu điểm: chúng có khả năng sinh sản bình thường để phát triển các thế
hệ động vật chuyển gen tiếp theo; chúng có khả năng sản xuất rất linh

hoạt, sản lượng sản phẩm cao và đáp ứng đúng yêu cầu của con người.
Đối với nhiều nước, động vật chuyển gen đang trở thành một
hướng nghiên cứu mạnh để sản xuất dược phẩm, thay vì chỉ sản xuất
thực phẩm thông thường. Nhu cầu to lớn đối với các dược phẩm đặc
hiệu của thị trường thế giới chỉ có thể đáp ứng bằng các động vật
chuyển gen. Protein ngoại lai trong sữa của động vật chuyển gen được
công bố đầu tiên năm 1987. Các con chuột chuyển gen đã sản xuất tác
nhân hoạt hoá plasminogen mô người trong sữa. Đến nay đã có khoảng
29 protein trị liệu được sản xuất bởi động vật chuyển gen. Hầu hết
protein này có trong sữa, một số khác có trong máu, nước tiểu và
trứng. Hemoglobin thu từ lợn chuyển gen là một protein được tạo ra
thành công và thu được từ máu. Điều này mở ra hướng tìm nguồn máu
thay thế cho con người. Các nhà khoa học đã tạo ra cừu chuyển gen mà
trong sữa của chúng có chứa protein Lactoferrin có tác dụng như một
chất kháng sinh. Tạo ra dê chuyển gen mà trong máu của chúng có
chứa yếu tố antitrombine, một glucoprotein có chức năng điều hoà sự
đông máu. Sở dĩ người ta sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất
protein trị liệu vì đây là những protein có cấu hình đúng, đảm bảo hoạt
tính cần thiết. Sử dụng protein từ động vật chuyển gen an toàn hơn là
sử dụng protein được tách chiết từ mô người vì nguy cơ lây nhiễm
bệnh. Nếu chỉ khai thác sữa để tách protein thì không ảnh hưởng xấu
tới sức khoẻ của động vật sản xuất sữa. Những loài được sử dụng để
thu nhận protein trị liệu là gà, dê, cừu, thỏ, bò…
Triển vọng của động vật chuyển gen hầu như không có giới hạn
trong nhiều lĩnh vực: y học, dược phẩm, nông nghiệp… và chắc chắn
chúng mang lại nhiều lợi nhuận. Ví dụ, để phục vụ nông nghiệp, đã có
21 tính trạng của vật nuôi (số liệu năm 2006) được biến đổi gen nhằm
làm tăng sản lượng và chất lượng các sản phẩm chăn nuôi.
\ Về sản xuất thịt - Nhiều nghiên cứu ban đầu về vật nuôi chuyển
gen nhằm thúc đẩy sự tăng trưởng các gen mã hoá cho hocmôn tăng

trưởng của người, cừu lợn và bò đã được chèn vào nhiễm sắc thể tế
bào cừu, lợn, bò và thỏ. Các con vật này cho tăng trưởng nhanh, tăng
tỷ lệ nạc/mỡ và tăng chuyển hoá thức ăn… Tuy nhiên, chi phí tương
đối cao khi tạo ra các giống vật nuôi chuyển gen. Hơn nữa, chúng dễ bị
bệnh, như lợn chuyển gen hocmôn tăng trưởng đã lớn rất nhanh nhưng
sau chúng bị loét dạ dày, hư thận và gan, nhạy cảm với viêm phổi, dễ
bị viêm da và mất khả năng sinh sản. Cừu chuyển gen tăng trưởng
người và bò cũng dễ bị bệnh tiểu đường, dẫn đến chết sớm.