NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM 2 LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS, ASPERGILLUS PARASITICUS VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC KHIẾM THỰC (SEMEN EURYALES) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN QUỲNH ANH

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM 2 LOÀI
ASPERGILLUS FLAVUS,
ASPERGILLUS PARASITICUS VÀ
AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC
KHIẾM THỰC (SEMEN EURYALES)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN QUỲNH ANH
MÃ SINH VIÊN: 1401040

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM 2 LOÀI
ASPERGILLUS FLAVUS,
ASPERGILLUS PARASITICUS VÀ
AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC
KHIẾM THỰC (SEMEN EURYALES)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Trịnh Công
2. TS. Nguyễn Quỳnh Lê
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Vi sinh & Sinh học
2. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng chân thành và biết ơn sâu sắc đến
người thầy của tôi là TS. Trần Trịnh Công – Giảng viên Bộ môn Vi sinh và Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã định hướng, luôn sát sao, tận tình
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Quỳnh Lê đã động viên và đã hỗ trợ
tôi rất nhiều trong nghiên cứu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên
của Bộ môn Vi sinh và Sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học
Dược Hà Nội, những người thầy luôn nhiệt huyết và yêu nghề đã truyền cho tôi kiến
thức và cảm hứng trong suốt thời gian học tập dưới mái trường Dược thân yêu.
Cũng xin chân thành cảm ơn những người bạn tuyệt vời của tôi, tôi đã không
thể đi hết hành trình đại học của mình một cách thuận lợi và tốt đẹp, nếu như thiếu đi
những người bạn tuyệt vời luôn cùng đồng hành bên cạnh.
Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, những người thân của tôi,
vì đã luôn là chỗ dựa vững chắc nhất cho tôi trong mỗi bước đi trong cuộc sống,
không gì có thể so sánh với tình yêu thương mà họ dành cho tôi.

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Trần Quỳnh Anh


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 2
1.1. Một vài nét về chi Aspergillus ..............................................................................2
1.1.1. Aspergillus flavus ..........................................................................................4
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của A.flavus ............................................................4
1.1.1.2. Điều kiện sinh trưởng và sinh bào tử của A. flavus ...............................4
1.1.2. Aspergillus parasiticus...................................................................................5
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái của A. parasiticus ....................................................5
1.1.2.2. Điều kiện sinh trưởng và sinh bào tử của A. parasiticus ........................7
1.2. Độc tố afaloxin .....................................................................................................7
1.2.1. Vài nét giới thiệu về aflatoxin .......................................................................7
1.2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người ........................................8
1.2.3. Phương pháp phân tích aflatoxin .................................................................10
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ở trong và ngoài
nước. ..........................................................................................................................11
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ở ngoài nước.
...........................................................................................................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ở trong nước.
...........................................................................................................................13


1.4. Phương pháp phân lập và phân loại nấm mốc ....................................................14
1.4.1. Phương pháp đặt trực tiếp ............................................................................15
1.4.2. Phương pháp pha loãng ...............................................................................15
1.4.3. Phương pháp phân loại ................................................................................15
1.5. Tổng quan về Khiếm thực ..................................................................................16
1.5.1. Một vài nét về vị thuốc Khiếm thực ............................................................16

1.5.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và aflatoxin trên Khiếm thực ở trong nước
...........................................................................................................................17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ............................................................................................................................. 18
2.1. Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu ..................................................................18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................18
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc .................................................18
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................18
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................19
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ..................................................................................19
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu ...................................................20
2.3.3. Phương pháp phân lập nấm mốc: ................................................................20
2.3.4. Phương pháp phân loại nấm mốc: ...............................................................20
2.3.5. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm ......................................................21
2.3.6. Phương pháp phân tích aflatoxin bằng HPLC trong vị thuốc Khiếm thực .21
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 24


3.1. Hàm ẩm của các mẫu khiếm thực nghiên cứu ....................................................24
3.2. Mức độ nhiễm 2 loài Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên vị thuốc
khiếm thực .................................................................................................................24
3.3. Mức độ nhiễm aflatoxin trên các mẫu khiếm thực nghiên cứu ..........................32
3.3.1. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống ................................................32
3.3.2. Kết quả nghiên cứu khoảng nồng độ tuyến tính của aflatoxin ....................32
3.3.3. Kết quả xác định hàm lượng aflatoxin trong các mẫu khiếm thực ..............33
BÀN LUẬN ................................................................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................................ 37
1.

Kết luận..............................................................................................................37

2.

Đề xuất ...............................................................................................................37

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADM (AFPA) : Aspergillus Differentiation Medium Base
AOAC

: Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Chemist)

A. flavus

: Aspergillus flavus

A. fumigatus

: Aspergillus fumigatus

A. niger

: Aspergillus niger

A. paraciticus : Aspergillus paraciticus

A. penicillioides: Aspergillus penicillioides
A. terreus

: Aspergillus terreus

A. ustus

: Aspergillus ustus

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

DGM

: Dichloran Glycerol Medium Base

FQ

: Tần suất xuất hiện loài (Isolation Frequency)

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IARC

: Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế
(International Agency for Research)

LÔ

: Lãn Ông

MEA

: Malt Extra Agar

PDA

: Potato Dextrose Agar

RD

: Mật độ loài (Relative Fungal Density)


TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TRC

: Toronto Research Chemicals


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus ....................... 6

Bảng 1.2. Con đường bệnh do aflatoxin ở người ............................................ 9
Bảng 2.1. Các aflatoxin chuẩn ....................................................................... 21
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu khiếm thực nghiên cứu .............................. 24
Bảng 3.2. Mức độ nhiễm 2 loài A. flavus, A. parasiticus và một số loài chủ
yếu khác từ 10 mẫu khiếm thực nghiên cứu ............................................................. 25
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài chi Aspergillus phân lập được
từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu ........................................................................... 26
Bảng 3.4. Đặc điểm vi học của 2 loài A. flavus, A. parasiticus và một số loài
chủ yếu khác phân lập được từ các mẫu khiếm thực ................................................ 27
Bảng 3.5. Nồng độ chuẩn aflatoxin ............................................................... 32
Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống ................................. 32
Bảng 3.7. Kết quả biểu thị sự phụ thuộc giữa diện tích pic (A) và nồng độ
aflatoxin (C) .............................................................................................................. 32
Bảng 3.8. Kết quả định lượng aflatoxin trong các mẫu khiếm thực thu được từ
các hiệu thuốc đông dược ............................................................................................ 34


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus ......................................... 2
Hình 1.2. Hình ảnh về Aspergillus flavus ........................................................ 4
Hình 1.3. Hình ảnh về Aspergillus parasiticus ............................................... 5
Hình 1.4. Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus mọc trên đĩa môi
trường Czapek được phân lập từ mẫu hạt ................................................................... 6
Hình 1.5. Công thức phân tử của một số loại aflatoxin ................................... 8
Hình 1.6. Tác dụng gây ung thư của aflatoxin B1 trên gan chuột................. 10
Hình 3.1. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ............................. 28
Hình 3.2. Loài A. parasiticus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ..................... 29
Hình 3.3. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc khiếm thực............................... 30
Hình 3.4. Loài A. terreus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ............................ 31

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ
aflatoxin..................................................................................................................... 33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thảo dược nói chung, các dạng quả, hạt nói riêng thường dễ bị nấm mốc xâm
nhiễm và phát triển, nhất là 2 loài nấm có khả năng sinh độc tố aflatoxin là Aspergillus
flavus và Aspergillus parasiticus trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam.
Khi bị mốc các sản phẩm thảo dược này ngoài việc giảm hiệu quả điều trị (do bị biến
đổi thành phần hoá học) còn gây nguy hại cho người tiêu dùng do bị nhiễm các độc tố
nấm, đặc biệt là aflatoxin. Các độc tố này có thể gây ra các bệnh khác nhau cho người
và động vật (mycotoxicoses), với các tác động từ cấp tính đến mạn tính, có thể dẫn đến
quái thai, ung thư, suy giảm hệ miễn dịch và nhạy cảm với sự lây nhiễm vi khuẩn và
nấm [4], [16], [18], . Khiếm thực (Semen Euryales) là thảo dược dạng hạt thường được
sử dụng trong đông y để chữa trị các bệnh đau nhức dây thần kinh, tê thấp, đau lưng,
mỏi gối. Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng bổ tỳ, ích thận, chỉ tả, sáp tinh; chữa di tinh,
mộng tinh, bạch đới đại tiện lỏng, tiêu chảy lâu ngày, tiểu tiện không chủ động [1],
[19]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn có rất ít công trình trong nước nghiên cứu về mức độ
nhiễm 2 loài A. flavus, A. parasiticus và aflatoxin trên vị thuốc này. Để góp phần đảm
bảo chất lượng thuốc và an toàn cho người sử dụng dược thảo nói chung, vị thuốc
khiếm thực nói riêng đề tài: “Nghiên cứu mức độ nhiễm 2 loài Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus và aflatoxin trên vị thuốc khiếm thực (Semen Euryales)” đã
được triển khai với 2 mục tiêu sau:
1.

Phân lập, phân loại các chủng thuộc 2 loài Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực.
2.

Xác định mức độ nhiễm aflatoxin trên các mẫu vị thuốc khiếm thực

nghiên cứu.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Một vài nét về chi Aspergillus
Chi Aspergillus do Micheli mô tả năm 1729, sau đó đến năm 1832 được Fries
chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức
mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Sau này Fries lại xem xét bổ sung nên được
mang tên Aspergillus Fries ex Fries [7].
Về mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm sau: Khuẩn lạc
thường phát triển nhanh, có màu trắng, vàng, nâu vàng, nâu tới màu đen, hoặc ngả
màu xanh lá cây, chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp dày của các conidiophore thẳng
đứng. Conidiophore (thường không phân nhánh) được cấu tạo bởi một giá đỡ (stipe)
không phân nhánh, với phần đỉnh phồng to gọi là bọng (vesicle). Thể bình (phialide)
được sinh trực tiếp trên bọng được gọi là thể bình một tầng (uniseriate phialide),
hoặc trên cuống thể bình (metula) là thể bình hai tầng (biseriate phialide). Bọng, thể
bình, cuống thể bình (nếu có mặt) và conidi hình thành một khối conidi (conidial
head, hình 1.1). Khối conidi có thể hình thành dạng cột (columnar), dạng phóng xạ
(radiate) hoặc dạng cầu (globose). Conidi (conidium) chỉ gồm một tế bào, bề mặt
nhẵn hoặc xù xì, có gai, không màu hoặc có màu. Một số loài có bào tử túi
(ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium), thể quả có thể nằm trong đệm
nấm dạng hạch cứng (sclerotium) là các khối sợi thường có dạng hình cầu, cứng [5],
[8], [9].

Hình 1.1. Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus [5]
2

Các loài của chi Aspergillus là những tác nhân lây nhiễm phổ biến trên nhiều
cơ chất khác nhau, đặc biệt là trên các loại hạt lương thực, các loại cơ chất chết có
nguồn gốc thực vật [27]. Một số loài của chi nấm này được dùng trong công nghiệp
lên men, hoặc ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ (acid citric, acid
glucomic) hoặc các enzym (amylase, protease) . Mặc khác, một số loài có khả năng
gây bệnh ở người và động vật [42] hoặc có khả năng sinh các chất chuyển hóa thứ
cấp độc (mycotoxin) [36].
Việc phân loại chi Aspergillus chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái. Hệ
thống phân loại chi Aspergillus của Raper & Fennell (1965) [32] gồm 18 nhóm
(group) và có 132 loài với 18 thứ. Samson (1979, 1992, 1994a & b) đã công bố sưu
tập dữ liệu của các loài, thứ đã được mô tả từ 1965 và chỉ ra sự bất hợp lý của một số
taxon đã được công bố. Đến nay, số lượng các loài của chi đã được phát hiện lên tới
trên 200 loài, trong đó có khoảng trên 70 loài là các trạng thái hữu tính .
Các chỉ dẫn để nhận diện các loài của chi Aspergillus chủ yếu dựa trên các
đặc điểm hình thái và khuẩn lạc, đã được nhiều tác giả công bố như Pitt & Hocking
(1985), Klich & Pitt (1988a), Tzean & cộng sự (1990).
Nuôi cấy để nhận diện: các chủng đã phân lập được cấy đơn bào tử tại 3
điểm trên môi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 25oC. Đối với các loại nấm ưa khô
như A. penicillioides, trạng thái hữu tính Eurotium và một số loài khác có thể sử
dụng các môi trường Czapek và MEA với 20-40% đường kính. Các chủng thuộc 2
loài A. flavus và A. parasiticus được nuôi cấy xác định trên môi trường ADM. Trong
điều kiện nuôi cấy trên các môi trường, sử dụng các đĩa Petri thủy tinh tốt hơn là sử
dụng các đĩa Petri bằng chất dẻo. Hầu hết các loài hình thành bào tử trong vòng 7
ngày. Đặc điểm và cấu trúc của khối conidi được quan sát bằng kính hiển vi. Do một
số loài của chi Aspergillus có thể gây bệnh ở người (đặc biệt là A. fumagatus), nên
cần có biện pháp phòng tránh hít phải bào tử [42].

3

1.1.1. Aspergillus flavus
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của A.flavus
Loài A. flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón cục
của tán. Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình thành
những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài. Các thể chai hoặc
đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một lớp thể
trung gian (thể bình hai lớp), đôi khi cả 2 kiểu đồng thời tồn tại. Các bào tử có kích
thước khá lớn (đường kính từ 5-7 μm) hình cầu, vàng nâu đến hơi lục, hơi sần sùi.
[10], [26].

Hình 1.2. Hình ảnh về Aspergillus flavus [38]
1.1.1.2. Điều kiện sinh trưởng và sinh bào tử của A. flavus
Aspergillus flavus độc đáo ở chỗ nó là một loại nấm chịu nhiệt, vì vậy có thể
tồn tại ở nhiệt độ mà các loại nấm khác không thể. A. flavus thích hợp với điều kiện
nóng, khô [26]. Tốc độ sinh trưởng cao nhất trên môi trường nuôi cấy phòng thí
nghiệm khoảng 30-35oC. Đặc biệt thuận lợi khi môi trường có hàm lượng đường
sacaroza cao (30-200 g/l) và hàm lượng nitrat cao (3-6 g/l).
Độ ẩm thích hợp cho A. flavus phát triển là 80-85%; chúng bị chết sau một
tháng ở độ ẩm 75%, trong khi đó thì 40% số bào tử vẫn sống được 6 tháng ở độ ẩm
85%. A. flavus tăng trưởng phổ biến ở các nước nhiệt đới [38]. Nếu sự tăng trưởng
của A. flavus thấp nhất ở môi trường có pH=3,9 thì nó lại tối ưu ở pH=10.

4


Các cơ chất thường gặp: thường gặp trên lạc, các loại gia vị từ thực vật, các
loại hạt có dầu, các loại hạt ngũ cốc, các loại quả khô và thảo dược,…
1.1.2. Aspergillus parasiticus

1.1.2.1. Đặc điểm hình thái của A. parasiticus
A. parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A.flavus song bào tử của

A.parasiticus thường có màu xanh lục.

Hình 1.3. Hình ảnh về Aspergillus parasiticus [25]
Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn
tìm thấy được một số khác biệt nhỏ giữa A.flavus và A.parasiticus.
Sự khác biệt giữa hai chủng này có thể tóm tắt trong bảng dưới đây:

5


Bảng 1.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus [25], [12]

Đại
thể

Vi

Đặc điểm

A.flavus

A.parasiticus

Đường kính

d = 3-5 cm

d = 2-3 cm

Màu sắc

Bông

thể

Ban đầu hơi vàng cuối xanh lục

Khóm nấm màu xanh

hoặc vàng lục. Đôi khi hóa nâu

lục, hơi vàng. Không

khi già

bao giờ hóa nâu khi già

Lớn, cầu, tỏa tia, đôi khi tạo cột

Nhỏ, cầu hoặc tỏa tia

không rõ
Bọng

Cầu – gần cầu

Hình gần cầu

Thể bình

1 hoặc 2 tầng

1 tầng

Vách cuống

Xù xì

Xù xì

Hạt đính

Cầu đến gần cầu, trơn hoặc có gai

Cầu có vách gai

Hình 1.4. Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus mọc trên đĩa môi trường
Czapek được phân lập từ mẫu hạt [25]
6


1.1.2.2. Điều kiện sinh trưởng và sinh bào tử của A. parasiticus
Nhiệt độ tăng trưởng trung bình của loại nấm này dao động trong khoảng 1242°C với nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 32°C và không tăng trưởng ở 5°C
[31]. Độ pH tăng trưởng dao động từ 2,4-10,5 với mức tăng trưởng tối ưu nằm trong
khoảng 3,5-8 [31]. Để nấm phát triển tốt nhất, hàm lượng carbon và nitơ là 1:1 và
pH=5,5 [14]. Các cơ chất thường gặp: các loại hạt ngũ cốc, các loại quả hạch, trong
đất.

1.2. Độc tố afaloxin
1.2.1. Vài nét giới thiệu về aflatoxin
Ðã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả
các nước tiên tiến có đời sống cao. Nhưng có vài sự kiện có liên quan ngộ độc khi ăn
ngũ cốc bị mốc đã được chú ý.
Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ
nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh
bạch cầu không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc.
Năm 1960, một vụ dịch lớn gây chết hàng loạt gà tây ở nước Anh. Chỉ ít lâu sau, các
nhà khoa học đã tìm ra thủ phạm là một chất có “màu xanh da trời” được đặt tên là
aflatoxin, một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus, A. parasiticus và
A.fumagatus, có nguồn gốc từ lạc khô mốc. Phát hiện này đã làm cho các nhà khoa
học nhận thức được những mối đe dọa tiềm tàng của các chất nhiễm trong thực phẩm
và thức ăn gia sức có nguồn gốc từ nấm mốc. Chúng có thể gây ra nhiều loại bệnh,
thậm chí có thể gây tử vong cho cả người và động vật [5].
Có khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau nhưng có 4 nhóm hay gặp nhất là B 1
và B2, G1 và G2, trong đó độc nhất là B1 > G1 > B2 > G2. Aflatoxin B1, B2 là sản
phẩm của A. flavus, A. parasiticus. Aflatoxin G1, G2 là sản phẩm của A. parasiticus.
Trong môi trường có cả A. flavus và A. parasiticus M1, M2, B2A, G2A [4], [25], [23].

7


Hình 1.5. Công thức phân tử của một số loại aflatoxin [23]
1.2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người
Aflatoxin là một chất độc nguy hiểm, có độc tính cao với gan, thận và đặc biệt
là chất gây ung thư gan, gây đột biến, gây quái thai và gây ức chế miễn dịch và được
phân loại là chất gây ung thư nhóm 1 ở người theo tổ chức Ung thư Quốc tế (IARC).
Con người đã có nhiều biểu hiện về sự ngộ độc aflatoxin, điều này là do ăn phải các
thức ăn bị nhiễm các sản phẩm do sự phát triển của nấm sinh ra. Các trường hợp ngộ

độc mãn tính do nấm mốc gây ra vẫn tồn tại cả ở các nước phát triển đã cấm lưu
hành các loại lương thực, thực phẩm bị nhiễm nhiều nấm mốc. Điều này là do tiêu
thu các loại thực phẩm bị nhiễm aflatoxin ở nồng độ thấp trong một thời gian dài [5].
Năm 1961, ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn
thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung
8


thư gan. Robinson nghiên cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc kí
lớp mỏng, ông đã tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và
trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan. Ngoài ra, aflatoxin còn có trong một số
dịch chuyển hóa của cơ thể như huyết thanh, nước tiểu, sữa mẹ..
Người và gia súc ăn phải thức ăn nhiễm aflatoxin ở nồng độ thấp kéo dài thì
độc tố này sẽ tích lũy ở một số cơ quan trong cơ thể như gan, thận, tụy, nếu nhẹ thì
chậm lớn, còi cọc, nặng hơn thì bị sưng gan, hoại tử gan. Trẻ ăn mỗi ngày 70-100g
bột lạc bị nhiễm aflatoxin với hàm lượng 0,5-1 ppm ăn kéo dài trong 10 tháng sẽ
xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan. Bên cạnh gan, các cơ quan khác
như: phổi, thận, mạc treo, túi mật... cũng bị tổn thương ít nhiều. Gây viêm sưng nặng
nề dẫn đến hoại tử các tổ chức và nội tạng [27].
Bảng 1.2. Con đường gây bệnh do aflatoxin ở người [23]

9


Các điều kiện làm tăng nguy cơ về các bệnh do aflatoxin cấp tính ở người bao
gồm một số hữu hạn các yếu tố sẵn có ở thực phẩm và môi trường. Các yếu tố này
tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm trên các loại hạt. Ngoài ra, việc
thiếu các qui chế, qui định, các hệ thống luật nhằm giám sát và kiểm tra aflatoxin
cũng góp phần làm tăng nguy cơ của bệnh aflatoxin cấp tính [5].
Aflatoxin đặc biệt là aflatoxin B1 là nguyên nhân gây ung thư ở nhiều động

vật nghiên cứu và đây là nhân tố được quan tâm ngay cả ở nồng độ thấp, là độc tố
ảnh hưởng quan trọng nhất đến sức khỏe của con người [5].

Hình 1.6. Tác hại gây ung thư của aflatoxin B1 trên gan chuột [5]
1.2.3. Phương pháp phân tích aflatoxin
a. Phương pháp sắc lý lớp mỏng (TLC )
Đây là một trong những kỹ thuật tách được ứng dụng rộng rãi nhất trong phân
tích aflatoxin. Từ 1990, phương pháp này đã được AOAC ( Association of Official
Analytical Chemist) xem là phương pháp chính thức và là phương pháp lựa chọn để
phân tích định tính và định lượng aflatoxin ở các nồng độ thấp khoảng 1 ng/g (1ppb).
Phương pháp sắc ký lớp mỏng cũng đã được dùng để kiểm tra các kết quả thu được
bằng các kỹ thuật mới và nhanh hơn [5]
b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

10


Sắc ký lỏng nói chung (liquid chromatography) và sắc ký lỏng hiệu năng cao
nói riêng tương tự sắc ký lớp mỏng ở nhiều khía cạnh như ứng dụng, pha tĩnh, pha
động. Hệ thống phân tích HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định
lượng aflatoxin [5].
c. Các phương pháp miễn dịch hóa học
Phương pháp sắc ký lớp mỏng và các phương pháp sắc ký lỏng dùng để xác
định aflatoxin trong thực phẩm thường tốn nhiều công sức và thời gian; người thực
hiện yêu cầu phải có kinh nghiệm trong lĩnh vực sắc ký. Nhờ các tiến bộ về kỹ thuật
sinh học, các phương pháp dựa trên nền kháng thể đặc hiệu cao hiện đang được sử
dụng. Các kỹ thuật này có thể định tính và định lượng aflatoxin trong thực phẩm
trong khoảng thời gian chưa đầy 10 phút [5].
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dƣợc ở trong và
ngoài nƣớc.

1.3.1. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ở ngoài nước.
Dược thảo đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền và cũng
là nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng. Mặc dù các
thuốc kháng sinh đã được đưa vào sử dụng từ những năm 1940, nhưng vẫn có tới
80% dân số tin dùng các cây thuốc bản địa trong điều trị bệnh. Các bài thuốc dược
thảo gia truyền được sử dụng để phòng tránh, trị liệu và cứu chữa các rối loạn và
nhiều bệnh khác nhau từ thời cổ xưa. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này chưa đáp
ứng được các yêu cầu về chất lượng, độ an toàn và tính hiệu quả. Trong quá trình thu
hoạch, vận chuyển, bảo quản và phân phối, các dược thảo là mục tiêu lây nhiễm của
nhiều loại nấm mốc khác nhau, và có thể là nguyên nhân của sự hư hỏng và tạo
thành mycotoxin. Việc sử dụng ngày một tăng các thực vật làm thuốc tạo ra mối
nguy cơ về sức khỏe cho cộng đồng do thiếu các nghiên cứu cần thiết về cách sử
dụng, tính hiệu quả, độc tính, và chất lượng của các sản phẩm tự nhiên này. Khi
nguồn dược thảo được sử dụng tăng cao có thể dẫn đến việc tăng lượng mycotoxin
đưa vào cơ thể. Bởi vậy, dược thảo nhiễm mycotoxin có thể góp phần tạo ra các vấn
đề bất lợi đối với sức khỏe con người, và có thể dẫn đến rủi ro nguy hiểm đến tính
11


mạng. Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều mycotoxin trong các loại thực vật làm thuốc
và các dược thảo truyền thống đã được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới như Tây
Ban Nha, Trung Quốc, Đức, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, … [15], [37], [22].
Các sản phẩm có nguồn gốc thực vật, khi được bảo quản lâu (thường trên 48
giờ) sẽ nhạy cảm với sự phát triển của nấm mốc và hình thành mycotoxin. Sự lây
nhiễm có thể xuất hiện trước thu hoạch, hoặc giai đoạn sau thu hoạch [20]. Khí hậu
nhiệt đới ẩm hoặc điều kiện bảo quản kém là các yếu tố môi trường thuận lợi cho
nấm mốc phát triển và sinh độc tố. Sự hình thành độc tố nấm mốc có thể tăng lên khi
gặp các điều kiện khác như khô hạn, tổn hại do côn trùng, do thu hoạch bằng máy
móc trong quá trình bảo quản [15]. Ở các điều kiện khác nhau thì tình trạng nhiễm
nấm và hình thành mycotoxin cũng khác nhau. Khả năng nhiễm nấm tăng lên ở

những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [15], [22].
Mahajan và cộng sự [29] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên 15 mẫu dược
liệu có nguồn gốc từ 3 cây: Saraca indica, Terminalia arjuna và Hemidesmus
indicus được thu thập từ các chợ ở vùng Agra và lân cận (Ấn Độ) giai đoạn 20132014, kết quả cho thấy: 93% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm 13 loài nấm khác nhau.
Trong đó, Aspergillus là chi nấm phổ biến nhất (71,95%). Hầu hết các loài phân lập
được của các chi Aspergillus, Penicillium, và Alternaria đều có khả năng sinh độc tố
như aflatoxin, ochratoxin, citrinin, altertoxin và acid tennuazonic. Sự có mặt của
nhiều loài nấm bảo quản (storage fungi) cho thấy nấm mốc có khả năng lây nhiễm
trên thảo dược thô (chưa chế biến) trong quá trình thu hoạch, sau thu hoạch (nhất là
trong quá trình làm khô, bảo quản, vận chuyển và chế biến). Trên cơ sở kết quả của
nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận rằng: Sự lây nhiễm nấm trên các nguyên liệu
thực vật làm thuốc là đáng báo động, và các nguyên liệu này cần phải được nghiên
cứu kỹ trước khi được chuyển đến các nhà máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử
dụng.
Điều tra mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 50 mẫu dược liệu là lá khô của
2 loài thực vật (Azadirachta indica và Justica adhatoda) được thu thập từ các hiệu
bán buôn và bán lẻ của 8 quận thuộc bang Jammu & Kashmir (Ấn Độ) bằng kỹ thuật
12


rửa bề mặt (surface washing technique), TLC và HPLC. Kết quả cho thấy: có tổng số
50 loài, thuộc 30 chi đã được phân lập. Sự đa dạng của các loài nấm trên 2 mẫu lá
tương đối giống nhau (có thể do nguồn dinh dưỡng phong phú và không khác nhau
nhiều). Các loài nấm phân lập được có khả năng sinh mycotoxin quan trọng. Kết quả
phân tích độc tố cho thấy: các aflatoxin B1, B2 đã được phát hiện trên các mẫu lá khô
của Azadirachta indica, và aflatoxin B1, B2 cũng được phát hiện ở các mẫu lá cây
Justica adhatoda. Trong các mycotoxin được phát hiện, aflatoxin có trên cả 2 loại lá
(do sự có mặt các chủng sinh độc tố loài A. flavus) [40] .
Đánh giá mức độ nhiễm nấm và khả năng sinh độc tố trên 152 mẫu dược liệu
thô có nguồn gốc từ 56 loài thảo dược, được thu thập từ 13 cơ sở sản xuất của

Achentina [34], bằng các phương pháp phân lập, nhận diện chuẩn cho thấy: có 52%
mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài của chi Aspergillus. Trong số này, nhóm loài
A.flavus chiếm 27% và 25% thuộc nhóm loài A. niger. Ngoài ra, 16% tổng số mẫu đã
bị nhiễm các loài của chi Fusarium. Các loài A. flavus và A. parasiticus phân lập
được nhiều nhất, với 50% trong số 40 chủng phân lập được có khả năng sinh độc tố,
và nồng độ aflatoxin xác định được dao động trong khoảng 10-2000 ng/g. Trái lại,
chỉ có 26% số chủng của nhóm loài A. niger phân lập được có khả năng sinh độc tố
ochratoxin A ở nồng độ thấp, trong khoảng 0,12-9,0 ng/g. Qua tỷ lệ nhiễm các loài
nấm có khả năng sinh độc tố trên các mẫu thảo dược nghiên cứu, cho thấy sự cần
thiết phải điều tra mức độ nhiễm tự nhiên của mycotoxin. Trên cơ sở đó mới có thể
xác định được giới hạn hợp lý về các loại độc tố, giúp quản lý hiệu quả nguồn
nguyên liệu thảo dược, tránh rủi ro về sức khỏe của cộng đồng người sử dụng.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ở trong nước.
Việt Nam là một trong những quốc gia sử dụng lượng thảo dược lớn hàng
năm, lại có khí hậu nóng nẩm, phương pháp thu hoạch, chế biến, bảo quản còn lạc
hậu, chủ yếu theo kinh nghiệm, … Điều này làm cho nguồn nguyên liệu và chế phẩm
dược thảo rất dễ bị nấm mốc xâm nhiễm, phát triển và sinh độc tố.
Kết quả từ nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ gây ung thư gan nguyên phát của
nhóm tác giả Bùi Thị Thanh Hà (Bệnh viện Hữu Nghị), Phan Thị Kim (Bộ Y tế),
13


Phạm Thị Thu Hà (Trường Đại học Y Hà Nội) nhận định: “Tỷ lệ aflatoxin B1 trong
tổ chức gan của 83,3% bệnh nhân ung thư gan nguyên phát được điều trị tại Bệnh
viện Hữu Nghị cho thấy ung thư gan nguyên phát ở Việt Nam có liên quan chặt chẽ
với aflatoxin B1 qua đường ăn uống”.[11]
Ngoài ra, đáng chú ý là công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và
aflatoxin của tác giả Trần Trịnh Công và cộng sự [5] trên 9 vị thuốc gồm: Hạt sen
(Semen Nelumbinis); Ngũ vị tử (Fructus Kadsurae), Ý dĩ (Semen coicis, Nhân sâm
(Radix ginseng), Đẳng sâm (Radix Codonopsis), Sa sâm (Launae pinnatifida Cass.),

Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae), Bạch truật (Rhizoma Atractylodis macrocephalae) và Hoàng kỳ (Radix Astragali membranacei), được thu thập từ các hiệu
thuốc đông dược ở Hà Nội, Hải Dương, Bắc Ninh. Kết quả cho thấy, các chủng nấm
phân lập được chủ yếu thuộc chi Aspergillus. Trong đó, các loài có khả năng sinh
độc tố như A. flavus, A. parasiticus, A. niger thường chiếm tỷ lệ cao trên các thảo
dược dạng quả, hạt: 10/20 mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm 2 loài A. flavus và A.
parasiticus với số lượng chủng phân lập được dao động 4-18 chủng/mẫu (60 hạt);
20/70 mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm loài A. flavus với tỷ lệ chủng dao động từ 1060 chủng/mẫu (60 hạt). Kết quả phân tích độc tố cho thấy: 13/20 bị nhiễm aflatoxin
toàn phần (tổng của B1, B2, G1 và G2) dao động trong khoảng 2,2-364,3 ppb; trong
đó, có 12 mẫu vượt quá 4 ppb (5,3-364,3 ppb). Với vị thuốc ý dĩ: 6/10 mẫu phân tích
độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 3,3-24,1 ppb; trong đó có 5 mẫu
vượt qua 4 ppb (8,8-24,1). Vị thuốc ngũ vị tử có 5/10 mẫu phân tích độc tố bị nhiễm
aflatoxin toàn phần dao động từ 0,1- 0,9 ppb. Với kết quả thu được cho thấy nguồn
nguyên liệu thảo dược này cần phải được giám sát chặt chẽ trước khi chuyển đến các
nhà máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử dụng bởi việc sử dụng các dược liệu này là
rất thường xuyên và kéo dài.
1.4. Phƣơng pháp phân lập và phân loại nấm mốc
Để nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên các thảo dược (dạng quả, hạt, củ, thân,
cành, lá, hoa, …) thường sử dụng 2 phương pháp phân lập: Phương pháp đặt trực
tiếp (Direct plating) và phương pháp pha loãng (Dilution plating) [31], [36] .

14


1.4.1. Phương pháp đặt trực tiếp
Các mẫu thảo dược được đặt trực tiếp trên môi trường thạch. Trong hầu hết
các trường hợp các mẫu thảo dược phải được tiệt trùng bề mặt (thường sử dụng dung
dịch NaOCl 1-5%) trước khi được đặt trực tiếp lên môi trường nuôi cấy để loại bỏ
các lây nhiễm thường xảy ra do bụi và các nguồn khác trên bề mặt thảo dược, cho
phép phát hiện lượng nấm mốc thực sự phát triển trong mẫu dược thảo [39], [43].
Quá trình này cung cấp thước đo mức độ nhiễm nấm đặc trưng tự nhiên có trong

thảo dược và cho phép đánh giá khả năng nhiễm các độc tố nấm tiềm tàng có thể gây
hại cho sức khỏe người tiêu dùng của thảo dược. Với phương pháp phân lập nấm
bằng cách đặt trực tiếp cho chúng ta có hình ảnh trực quan về mức độ nhiễm nấm
mốc trên thảo dược. Kết quả của việc phân lập, phân loại nấm bằng phương pháp đặt
trực tiếp được đánh giá bằng phần trăm các mẫu thảo dược bị nhiễm nấm. Với tỷ lệ
nhiễm nấm cao của các mẫu sẽ tương quan với rủi ro cao về sự xuất hiện của các độc
tố nấm trên thảo dược [30].
1.4.2. Phương pháp pha loãng
Pha loãng hỗn dịch bào tử là một phương pháp thích hợp để phân tích nấm
trên các thảo dược dạng bột. Đây cũng là phương pháp được áp dụng cho các thảo
dược sẽ được chế biến thành dạng bột hoặc các trường hợp khác khi tổng lượng nấm
lây nhiễm trên thảo dược có liên quan [30], [35]. Một điều lưu ý rằng kết quả phân
tích nấm thu được bằng phương pháp pha loãng (dilution plating) không thể so sánh
trực tiếp với kết quả thu được bằng phương pháp đặt trực tiếp (directly plating) [30].
1.4.3. Phương pháp phân loại
Về phương pháp phân loại nấm hoại sinh (nấm trên các cơ chất chết), hiện
nay đang sử dụng 2 phương pháp chủ yếu: Phương pháp hình thái và phương pháp
sinh học phân tử.
Định danh bằng phương pháp hình thái dựa trên cơ sở: các đặc điểm nuôi cấy
(đặc điểm đại thể) và đặc điểm vi học của nấm trên các môi trường chuẩn như
Czapek Dox, MEA, PDA … Các đặc điểm nuôi cấy hay khuẩn lạc (colony) như kích
thước, màu sắc, cấu trúc bề mặt, chất tiết (mặt trước, sau) và mép của khuẩn lạc. Các
15