NGUYỄN THỊ THOA xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG một số THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC RI

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THOA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG MỘT SỐ
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG
HPLC-RI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THOA
Mã sinh viên: 1401585

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG MỘT SỐ
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG
HPLC-RI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. ThS. Lê Hồng Dũng
Nơi thực hiện:

Khoa Hoá thực phẩm-Viện Dinh dưỡng Quốc gia

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng Inulin
trong một số thực phẩm chức năng bằng HPLC-RI” đã được hoàn thành. Để có được
kết quả này, ngoài nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp
đỡ từ phía nhà trường, bộ môn, nơi em thực hiện đề tài- Viện Dinh dưỡng Quốc gia, gia
đình và bạn bè.
Trước tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Lâm
Hồng, cô đã tận tình định hướng, chỉ bảo, đóng góp ý kiến và động viên em trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Lê Hồng Dũng, người đã trực tiếp
hướng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện
khóa luận. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn đến các anh chị ở khoa Hóa thực
phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện rất nhiều cho em thực hiện khóa luận này.
Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết mình nhưng sẽ không
tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến chỉ bảo, góp ý từ các
thầy cô để khóa luận của em tiếp tục được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Thoa

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ................................................................vi
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1 TỔNG QUAN VỀ INULIN.................................................................................2
1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .................................5
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ...........................................................................5
1.2.2. Chất nhồi cột .................................................................................................6
1.2.3. Detetor RI ......................................................................................................8
1.2.4. Một số phương pháp phân tích Inulin hiện nay .......................................10
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................13
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU........................................................................................13
2.2.1. Chất chuẩn ..................................................................................................13
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ..................................................................13
2.2.3. Chuẩn bị dung dịch placebo ......................................................................14
2.2.4. Dung môi, hoá chất ....................................................................................14
2.2.5. Dụng cụ, thiết bị .........................................................................................14
2.2.6. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................15
ii


2.3.1. Khảo sát điều kiện HPLC ...........................................................................15
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu.....................................................................15

2.3.3. Thẩm định quy trình...................................................................................16
2.3.4. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Inulin trong một số
thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường. ......................................17
2.4. XỬ LÝ KẾT QUẢ ............................................................................................18
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................18
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .......................................................18
3.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ..........................................................................18
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ...................................................................20
3.1.3. Kết quả ........................................................................................................21
3.1.4. Quy trình phân tích Inulin trong thực phẩm chức năng .........................22
3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ......................................................................23
3.2.1. Độ ổn định hệ thống ...................................................................................23
3.2.2. Tính chọn lọc ..............................................................................................24
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng...............................................26
3.2.4. Khoảng tuyến tính ......................................................................................27
3.3.5. Độ lặp lại .....................................................................................................28
3.2.6. Độ đúng .......................................................................................................29
3.3. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG TRÊN THỊ TRƯỜNG ...................................................................31
3.4. BÀN LUẬN .......................................................................................................32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36
PHỤ LỤC .....................................................................................................................39

iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AOAC

Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hoá phân tích
communityes

FODMAP

Fermentable

chính thức
oligo-,

di-,

saccharides and polyols
HPLC

mono- Các loại saccharid có thể lên
men

performance Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High
Liquidchromatography

HPTLC

High

performance

thin

layer Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

chromatography
HL

Hàm lượng

HLTN

Hàm lượng trên nhãn

LOD

Limit of detection

Giới hạn định tính

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

RI

Refractive index

(Detetor) chỉ số khúc xạ

RSD%

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SCFAs

Short chain fatty acids

Các acid béo chuỗi ngắn

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Đặc điểm cột trong một số phân tích Inulin trên thế giới ..............................7
Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích Inulin ..........................................................10
Bảng 2.1: Thành phần trong 3g mẫu placebo (nền mẫu rắn) .......................................14
Bảng 2.2: Hệ pha động khảo sát ...................................................................................15
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian chiết và kỹ thuật chiết trên nền mẫu rắn ...........22
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại hệ thống ............................................................23
Bảng 3.3: Giá trị S/N của các pic nạp chuẩn và kết quả LOQ, LOD ...........................26
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Inulin ............................................27
Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lặp lại đối với Inulin ....................................................28
Bảng 3.6: Kết quả xác định độ thu hồi ở mức nạp chuẩn nồng độ thấp .......................29
Bảng 3.7: Kết quả xác định độ thu hồi ở mức nạp chuẩn nồng độ trung bình .............30
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn ở nồng độ cao ..................30
Bảng 3.9: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên thị trường..................................31

v


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Inulin............................................................................2
Hình 1.2: Một số tác dụng của GLP-1 ............................................................................4
Hình 1.3: Một số thực phẩm chức năng bổ sung Inulin ..................................................5
Hình 1.4: Mô phỏng hiện tượng khúc xạ .........................................................................8

Hình 1.5: Sơ đồ của detector RI ......................................................................................9
Hình 3.1: Sắc ký đồ trên cột Shodex OHpack SB-806M HQ ........................................18
Hình 3.2: Sắc ký đồ cột Shodex OHpack SB-806M HQ nối với cột Supelcosil LC-NH2
.......................................................................................................................................19
Hình 3.3: Sắc ký đồ trên hệ ghép nối tiếp 2 cột Shodex OHpack SB-806M HQ ..........19
Hình 3.4: Sắc ký đồ trên hệ pha động NaNO3 0,1M .....................................................20
Hình 3.5: Sắc ký đồ trên hệ pha động nước khử ion 18mΩ ..........................................20
Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến ..........................................................................21
Hình 3.7: Biểu đồ khảo sát thời gian chiết và kỹ thuật chiết ........................................21
Hình 3.8: Quy trình xử lý mẫu.......................................................................................23
Hình 3.9: Sắc ký đồ các dung dich chuẩn Inulin 1000 ppm khi chồng lên nhau ..........24
Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu trắng ....................................................................................25
Hình 3.11: Sắc ký đồ chuẩn Inulin 1000 ppm ...............................................................25
Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu placebo ................................................................................25
Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn Inulin 200 ppm ...................................26
Hình 3.14: Giá trị S/N của Inulin trong mẫu nạp chuẩn Inulin 125 ppm .....................27
Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của Inulin .......................................................................................................................28
Hình 3.16: Quy trình xử lý mẫu.....................................................................................34

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội này càng phát triển thì nhu cầu bảo vệ và nâng cao sức khoẻ ngày càng
được quan tâm. Nhiều nhà sản xuất đang có xu hướng nghiên cứu, phát triển và đưa ra
thị trường các thực phẩm chức năng có bổ sung chất xơ và cân bằng dinh dưỡng để góp
phần cải thiện các bệnh như béo phì, tiểu đường, táo bón, …Một trong các sản phẩm ấy
là các thực phẩm chức năng có bổ sung Inulin – một loại chất xơ hoà tan có nguồn gốc
từ thực vật.

Inulin là một loại polymer của fructose, nếu được bổ sung hàng ngày sẽ đem lại
nhiều lợi ích cho người sử dụng. Tuy nhiên, ở nước ta,việc định lượng Inulin vẫn chưa
có phương pháp cụ thế trong khi nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng bổ sung Inulin
ngày một tăng. Trong hoàn cảnh đó, yêu cầu đặt ra cho các nhà quản lý là cần có phương
pháp phân tích, đánh giá chất lượng các thực phẩm chức năng bổ sung Inulin nhằm kiểm
tra, giám sát chất lượng, đem lại sự tin tưởng cho người dùng và đảm bảo chất lượng
cho nhà sản xuất. Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định lượng Inulin trong thực phẩm
chức năng là cần thiết.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khoá luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp định
lượng Inulin trong một số thực phẩm chức năng bằng HPLC-RI” nhằm góp phần kiểm
tra, giám sát chất lượng các chế phẩm có bổ sung Inulin với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Inulin trong một số thực phẩm
chức năng.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức năng
bổ sung Inulin đang lưu hành trên thị trường.

1


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ INULIN
Inulin là nhóm các polymer của fructose, tan trong nước. Các monomer được liên
kết với nhau bằng liên kết β (2-1) glycosid. Vì vậy, Inulin không bị tiêu hoá ở người và
các động vật bậc cao do không có emzym inulinase, tuy nhiên lại được tiêu hoá bởi một
số vi sinh vật đường ruột như L.acidophilus, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có giá trị
[7], [26].
Inulin trong thực vật chứa 2 – 60 đơn vị fructose. Độ dài của chuỗi phụ thuộc vào
loài thực vật và thời điểm trong vòng đời của cây.
Inulin được tìm thấy trong nhiều loài thực vật như: rễ cây rau diếp xoăn (36 –
48%), tỏi (9 – 16%), măng tây (2 – 3%)… Inulin được một số thực vật sử dụng như một

cách dự trữ năng lượng. Hầu hết các loài thực vật tổng hợp và dự trữ Inulin không dự
trữ các cacbonhydrat khác như tinh bột [6].

Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Inulin
- Công thức phân tử: C6nH10n+2O5n+1, n từ 3 – 61.
- Tính chất:
• Bột màu trắng, không mùi, dễ hút ấm
• Tan tốt trong nước, độ tan 120 g/L (25℃)
• Nhiệt độ nóng chảy: 165 – 180 ℃
• Nhiệt độ chuyển kính: 125 – 140 ℃
- Tác dụng dược lý:
2


● Inulin thúc đẩy sự cân bằng của hệ vi khuẩn trong đường ruột. Trên thực tế,
các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Inulin có thể giúp kích thích sự phát triển của vi khuẩn có
lợi [14], [15]. Tăng số lượng vi khuẩn này có thể giúp cải thiện hệ tiêu hoá, miễn dịch
và sức khoẻ tổng thể [26].
● Inulin giúp làm giảm triệu chứng táo bón. Một nghiên cứu cho thấy những
người dùng Inulin đi đại tiện thường xuyên hơn, phân mềm hơn [11]. Nghiên cứu kéo
dài 4 tuần của Marteau P. và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng những người lớn tuổi được
dùng 15 gram Inulin trên ngày ít táo bón hơn và tiêu hoá tốt hơn [25]. Hơn nữa, các nhà
khoa học đã chỉ ra rằng không có sự ảnh hưởng của Inulin đến nhu động ruột [23].
● Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Inulin có khả năng hỗ trợ giảm cân [5],
[10], [18], [28]. Cơ chế của tác dụng này là do sự lên men Inulin bởi các vi sinh vật có
lợi trong đường tiêu hoá tạo ra các acid béo chuỗi ngắn (SCFAs), các sản phẩm này làm
tăng biểu hiện của proglucagon, kích thích tế bào Enteroendocrine L tại ruột sản sinh ra
GLP-1 (Glucagon-like peptid 1) và PYY (Peptid YY) [13]. PYY là một peptid ngắn
gồm 36 acid amin, có tác dụng ức chế thèm ăn thông qua việc giảm nhu động, kéo dài
thời gian tháo rỗng của dạ dày. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về trẻ thừa cân béo phì,

Inulin không có hiệu quả trong việc “thiêu đốt” calo thừa trong cơ thể [23].
● Inulin còn có thể kiểm soát lượng đường trong máu người mắc bệnh tiểu đường
và tiền tiểu đường [12], [18], [19], [30]. Như đã trình bày ở trên, Inulin giúp tăng sinh
GLP-1 (một loại peptid ngắn có 30 – 31 acid amin). GLP-1 kích thích tiết insulin một
cách có lệ thuộc glucose, tức là nó chỉ kích thích tiết insulin khi lượng đường trong máu
tăng cao. Ngoài ra, GLP-1 còn có những tác dụng khác như kéo dài thời gian tháo rỗng
của dạ dày, làm chậm hấp thu tinh bột. Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy, GLP1 có thể kích thích tuỵ tái sinh tế bào β, chống lại sự chết tế bào theo chương trình, cải
thiện được sự sống của các tế bào β [9].

3


Hình 1.2: Một số tác dụng của GLP-1
● Inulin giúp duy trì và phục hồi tổn thương niêm mạc ruột, ngăn ngừa ung thư
đại tràng phát triển [6]. Cơ chế chủ yếu dựa trên vai trò của các SCFAs bao gồm acid
butyric, là sản phẩm trong quá trình lên men Inulin tại trực tràng [24]. Acid butyric là
nguồn năng lượng cho các tế bào ruột kết bình thường nhưng lại ức chế sự tăng sinh của
các tế bào ung thư do ức chế enzym histon deacetylase [16].
● Chế độ ăn bổ sung Inulin đã được chứng minh là giúp tăng hấp thu calci, magie,
muối khoáng ở thanh thiếu niên, chủ yếu thông qua tác dụng tăng hấp thu canci ở ruột
già [3], [6], [17], [21].
● Các nghiên cứu về Inulin cho thấy Inulin an toàn cho hầu hết mọi người. Tuy
nhiên, với những người không dung nạp FODMAP có thể gặp một số tác dụng không
mong muốn như: đầy hơi, phân lỏng và tiêu chảy. Các triệu chứng này sẽ dừng hẳn khi
ngưng việc bổ sung Inulin [8], [35].
4


- Một số thực phẩm chức năng bổ sung Inulin

Hình 1.3: Một số thực phẩm chức năng bổ sung Inulin
1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc: Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất
rắn, pha động là chất lỏng. Các chất phân tích di chuyển qua cột, tốc độ di chuyến khác
nhau liên quan đến ái lực tương đối của chất với pha tĩnh và pha động. Thành phần pha
động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân
tích với thời gian hợp lý [1].
- Phân loại:
● Sắc ký phân bố
● Sắc ký hấp phụ
● Sắc ký trao đổi ion
● Sắc ký rây phân tử
● Sắc ký ái lực
● Sắc ký các đồng phân quang học
Đối tượng của khoá luận này là sắc ký rây phân tử (SEC: size exclution
chromatography) hay còn gọi là sắc ký lỏng trên gel. Nguyên lý tách của các chất dựa
vào kích thước phân tử:

5


● Phân tử có kích thước lớn hơn kích thước cực đại của lỗ xốp trong pha tĩnh, sẽ
bị loại hoàn toàn, được rửa giải ngay lúc ban đầu ở thể tích Vo – thể tích rỗng giữa các
hạt gel ở trong cột.
● Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước nhỏ nhất của lỗ xốp sẽ khuếch
tán hoàn toàn qua pha tĩnh trong thể tích Vt.
● Các phân tử có kích thước trung gian sẽ được tách dần theo mức độ khuếch tán
qua pha tĩnh: phân tử lớn hơn sẽ ra trước, phân tử nhỏ hơn sẽ ra sau trong thể tích Vp
của pha động nằm giữa Vo và Vt .

- Dựa vào pha động, có thể phân loại sắc ký lỏng trên gel thành:
● Sắc ký thấm gel (GPC: gel-permeation chromatography): là sắc ký dùng gel để
tách các polymer hoà tan trong dung môi (organosoluble polymers). Dùng pha động kỵ
nước.
● Sắc ký lọc gel (GFC: gel filtration chromatography): sắc ký dùng gel để tách
các polymer sinh học (biopolymers). Dùng pha động ưa nước [1].
1.2.2. Chất nhồi cột
a. Các loại gel thường dùng
- Trong sắc ký điều chế, hai polymer thường dùng là polysacharid và
polyacrilamid:
● Polysacharid: Thường dùng cellulose và dextran, là polymer của D-glucose.
Để tạo thành lỗ xố có kích thước khác nhau, người ta dùng các chất khác nhau để liên
kết các chuỗi polysacharid như glycerin,… Các nhóm OH trong polysacharid có thể liên
kết với các nhóm chức khác nhau như –(RCH2)3SO3H, -CH2COOH, -CH2N+(CH3)3,…
sẽ tạo ra các chất trao đổi ion.
● Polyacrilamid: Chuỗi polyacrilamid được liên kết với nhau bằng phân tử N, N’
methylenbisacrylamid
- Trong sắc ký lỏng phân tích, thường dùng các hạt hình cầu poly-styren hoặc
polyhydroxymethacrylat với kích thước lỗ xốp dao động trong khoảng từ 5 nm đến vài
µm.
b. Một số chất nhồi cột được sử dụng trong các nghiên cứu phân tích Inulin trên thế
giới.
6


Bảng 1.1: Đặc điểm cột trong một số phân tích Inulin trên thế giới

STT Tên cột
1

Chất nhồi

TLTK

Cột Shim-pack SCR Shimadzu - Polystyren-divinylbenzen, có [37]
(300 x 7,5mm)

các liên kết sulfonate ở các nút
ion Ca2+.
- Kích thước hạt: 10µm

2

Cột Animex HPX-42C (300 x - Polystyren-divinylbenzen, có [38]
7,8mm)

các liên kết sulfonate ở các nút
ion Ca2+, tỷ lệ liên kết chéo 4%
- Kích thước hạt: 25µm

3

Cột SP0801 Pb2+ (300 x 8,0 mm)

- Polystyren-divinylbenzen, có [36]
các liên kết sulfonate ở các nút
ion Pb2+
- Kích thước hạt: 7µm

4

Cột Rezex RCM (300 x 7,8 mm)

- Polystyren-divinylbenzen, có [20]
các liên kết ngang ở các nút ion
Ag+, tỷ lệ liên kết 8%
- Kích thước hạt: 8µm

5

Cột Shodex OHpak SB-804 (300 x - Polyhydroxymethacrylat,
7,9mm)

[22]

- Kích thước hạt: 10µm
- Kích thước lỗ xốp: 2000 Å

Vì Inulin là một loại polymer tan trong nước nên kỹ thuật phân tích thường được
lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel, sử dụng cột có chất nhồi là poly-styren
hoặc polyhydroxymethacrylat. Kết hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành
7


khảo

sát

trên

cột

Shodex

OHpack

SB-806M

HQ

có

chất

nhồi

là

polyhydroxymethacrylat, kích thước hạt 13µm, kích thước lỗ xốp 15000Å, có khả năng
phân tích được các phân tử có trọng lượng 500 đến 20000000 đvC.
1.2.3. Detetor RI
Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi được tách riêng và rửa
giải ra khỏi cột sắc ký. Mỗi chất khi đi qua detector sẽ cho tín hiệu đáp ứng khác biệt
với nền pha động, qua đó cho phép đánh giá định tính, định lượng các thành phần trong
mẫu phân tích. Tùy thuộc vào tính chất lý, hóa của đối tượng chất cần phân tích, detector
sẽ được lựa chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng với detector. Các loại detector
thường được sử dụng trong HPLC: RI, hấp thụ UV-VIS, huỳnh quang, độ dẫn.
Đối tượng nghiên cứu của Khoá luận tốt nghiệp này là Inulin- một loại polymer
của fructose tan trong nước. Do cấu trúc hoá học gồm một chuỗi dài các phân tử fructose
liên kết với một phân tử glucose ở đầu nên Inulin rất ít hấp thụ UV-VIS và không đáp

ứng với detector huỳnh quang. Qua tham khảo tài liệu kết hợp với điều kiện phòng thí
nghiệm, đề tài lựa chọn RI là detector của kỹ thuật sắc ký.

Hình 1.4: Mô phỏng hiện tượng khúc xạ
Nguyên lý phát hiện của detector RI dựa trên sự thay đổi chỉ số khúc xạ. Một tế
bào thuỷ tinh được chia làm hai buồng. Dòng chảy từ cột LC chảy qua “buồng mẫu”,
buồng còn lại chứa đầy pha động. Khi dòng chảy đi qua “buồng mẫu” không có bất kỳ
chất phân tích nào, dung môi bên trong hai buồng giống nhau. Lúc này, tia tới và tia
khúc xạ sẽ hợp với nhau một góc 180o (Hình 1.4A). Tuy nhiên trong trường hợp dòng
chảy chứa bất kì thành phần nào ngoài pha động, tia tới sẽ bị bẻ cong khi đi qua bề mặt
phân cách giữa hai buồng do sự chênh lệch chỉ số khúc xạ giữa hai dung môi (Hình
8


1.4B). Bằng cách đo lường sự thay đổi này, ta có thể định lượng được chất cần phân tích
ban đầu.

Hình 1.5: Sơ đồ của detector RI
- Detector RI có độ nhạy thấp hơn detector UV-VIS. Đó là lý do chính khiến RI
không được sử dụng phổ biến như UV-VIS. Tuy nhiên, detector RI lại có một số lợi thế
hơn sơ với detector UV-VIS:
● Có thể phát hiện tất cả các chất. Các chất không hấp thụ tia UV-VIS như đường,
rượu, ion vô cơ không thể phát hiện bằng detector UV-VIS nhưng lại có thể được phát
hiện bởi detector RI do sự thay đổi chỉ số khúc xạ xảy ra đối với mọi chất phân tích.
● Sử dụng được với các dung môi có khả năng hấp thu tia UV-VIS trong khi
detector UV-VIS không thể sử dụng trong một số phương pháp định lượng cần sử dụng
các dung môi hữu cơ có khả năng hấp thụ tia UV-VIS.
● Có khả năng chỉ ra được mối quan hệ trực tiếp giữa cường độ và nồng độ chất
phân tích. Bởi lẽ, lượng UV-VIS được hấp thụ phụ thuộc vào từng chất phân tích, do đó
cường độ cực đại của detector UV-VIS không cung cấp thông tin về nồng độ chất phân

tích. Trong khi cường độ thu được bởi detector RI tương đương với nồng độ chất phân
tích.
- Bên cạnh những ưu điểm nổi trội so với detector UV-VIS, detector RI cũng có
những mặt hạn chế nhất định:
● Độ nhạy thấp (phạm vi mg/L)

9


● Nhạy cảm với những thay đổi về nhiệt độ. Cả detector và cột đều phải được
điều nhiệt.
● Khó sử dụng trong chế độ gradient vì khó so sánh trị số RI của mẫu và pha
động thành phần rửa giải sẽ bị thay đổi trong quá trình phân tích.
1.2.4. Một số phương pháp phân tích Inulin hiện nay
a. Trên thế giới
Ngay từ những năm 60, những nghiên cứu đầu tiên về Inulin đã ra đời. Ngày nay
phương pháp phổ biến nhất để phân tích Inulin là sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng
detector chỉ số khúc xạ (RI) [34],[36], [37], [38] hoặc sử dụng detector tán xạ bay hơi
(ELSD) [20]. Một số ít nghiên cứu khác cũng sử dụng phương pháp tạo màu đo quang
[27], phương pháp enzym [32] hoặc TLC [33] để phân tích Inulin.
Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích Inulin
STT Mẫu

phân Điều kiện phân tích

Xử lý mẫu

TLTK

tích

Kỹ thuật phân tích HPLC
1

Inulin trong Cột Shim-pack SCR 1g bột rễ cây rau diếp xoăn [37]
rễ
Chicory

cây Shimadzu, 80oC

được ngâm trong EtOH 95%

Detetor RI, 80oC

trong 48 giờ, siêu âm ở nhiệt

Pha động: H2O

độ phòng trong 30 phút, lọc

Tốc độ dòng: 1ml/phút qua màng lọc 0,45µm.

2

Inulin trong Cột Shodex SP0810 0,45g bột rễ khô chiết 3 lần, [29]
rễ
Chicory

cây Pb2+ (300mm x 8,0 mỗi lần 60 phút với EtOH
mm), 85℃

95%, lần 1 và 2 chiết với

Detetor RI, 85℃

40ml, lần 3 chiết với 20ml,

Pha động: H2O

gộp đủ 100ml, lọc qua màng

Tốc độ dòng: 1ml/phút 0,45 µm.

10


3

Inulin trong Cột Aminex HPX-87H Hút chính xác 1ml siro cho [34]
sản phẩm siro (300mm x 7,8mm), vào bình định mức 10ml,
multivitamin

80℃

định mức vừa đủ bằng nước

Detector RI, 80℃

khử ion, siêu âm ở 60 – 70℃,

Pha động :H2O

trong 5 phút, hút chính xác

độ

Tốc

dòng: 1ml dịch lọc cho vào bình
định mức 50ml, định mức

0,5ml/phút

vừa đủ bằng nước khử ion,
lọc qua màng 0,45µm.
4

Inulin trong Cột Animex HPX-42C 1g mẫu khô được chiết trong [38]
củ

cây (300 x 7,8 mm), 80oC

phút, sau đó lọc qua màng

Topinambour Detector RI, 80oC
Pha động: H2O
Tốc

độ

100 ml H2O 85oC trong 15

lọc 0,2µm.

dòng:

0,6

ml/phút
5

Inulin trong Cột
sữa chua

Pb2+ 10g sữa chua được chiết với [36]

SP0810

(300mm x 8,0 i.d.)

30 ml H2O 100oC trong 10

Detetor RI

phút., loại tủa protein bằng 5

Pha động: H2O

ml dung dich Carrez I và

Tốc độ dòng: 1 ml/phút 1465 ml dung dich Carrez II

(*), sau đó lọc qua màng lọc
0,45µm.
6

Inulin trong Cột Rezex RCM (300 x 2ml dung dịch sữa tách béo [20]
sữa tách béo

7,8

mm,

8

µm), được trộn với 5 ml dung dịch

Phenomenex, 80oC.

đệm acetat (0,1M, Ph 4,5),

Detetor ELSD

thêm 100µL inulinase có

Pha động: H2O

hoạt

Tốc

độ

dòng:

tính

enzyme

1740

0,5 INU/g, ủ ở 60oC qua đêm,

ml/phút

thêm 1,5 ml TCA 20% (**),

11


ly tâm lấy phần trên, sau đó
lọc qua màng lọc 0,22µm.
7

Inulin trong Cột Shodex OHpak 50g rễ tươi được đun cách [22]
củ

cây SB-804 HQ (300 x thuỷ 100℃ để bất hoạt

Jerusalem

8,0mm i.d.), 30℃

enzyme. Sau đó được xay

artichoke

Detector: RI

nhỏ, chiết cách thuỷ với 200

Pha động: H2O 100%

ml H2O ở 60℃ trong 7 giờ,

độ

Tốc

dòng;

0,8 loại bỏ tủa bằng Ca(OH)2
đến pH =11, trung hoà

ml/phút

Ca(OH)2 dư bằng H3PO4 đến
pH =8, tẩy màu bằng H2O2,
sau đó kết tủa Inulin bằng
EtOH 95% dư, đông khô ở 40℃. Cao đông khô được
hoà tan trong nước khử ion,
lọc qua màng 0,45µm

Kỹ thuật phân tích HPTLC
8

2g thực phẩm đã đồng nhất, [31]

Inulin trong Bản mỏng silicagel
thực phẩm

Pha

động:

n- chiết cách thuỷ 85oC trong

propano:aceton:H2O

30 phút trong 100ml. Dịch

(40:30:25),

chiết định mức vừa đủ

Thuốc thử phát hiện: 100ml,
DPA (***)

lọc

qua

màng

0,45µm.

Định lượng các vết
Inulin

bằng

máy

scanner và mật độ kế

Chú thích:
(*) Dung dich Carrez I: hoà tan 15,0g K4Fe(CN)6.3H2O trong H2O, định mức vừa đủ
100ml
12


Dung dich Carrez II: hoà tan 30,0g ZnSO4.7H2O trong H2O, định mức vừa đủ
100ml
(**) TCA: Tricloacetic
(***) DPA: Diphenylamin

b. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các carbohydrat có tính khử thường được định lượng bằng phương
pháp chuẩn độ Iod. (DĐVN IV) và carbohydrat không có tính khử được định lượng bằng
phương pháp đo góc quay cực (DĐVN V). Các phương pháp này đều có sai số lớn.
Riêng với Inulin, do không còn tính khử và không có góc quay cực xác định nên hiện
vẫn chưa có phương pháp định lượng cụ thể.
Từ thực tế trên, qua tham khảo tài liệu kết hợp với điều kiện phòng thí nghiệm,

đề tài tiến hành khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng Inulin bằng phương pháp
HPLC với detector RI, cột sắc ký Shodex OHpack SB-806M HQ có chất nhồi là
polyhydroxymethacrylat, pha động ưa nước.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là Inulin trong một số mẫu thực phẩm chức năng
bổ sung Inulin đang lưu hành trên thị trường.
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Chất chuẩn
Inulin: hàm lượng 97,0%, CAS number 9005-80-5, được cung cấp bởi SigmaAldrich.
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc: tiến hành cân chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn Inulin, hoà
tan bằng nước cất hai lần và định mức trong bình định mức 25 ml được dung dịch chuẩn
gốc nồng độ 20000ppm. Bảo quản ở nhiệt độ -24oC đến khi dùng.

13


Dãy dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy chuẩn có nồng độ từ 125
ppm đến 5000 ppm. Bảo quản ở nhiệt độ -24oC đến khi dùng.
2.2.3. Chuẩn bị dung dịch placebo
Mẫu placebo: do nền mẫu là thực phẩm chức năng nên thành phần nền mẫu các
sản phẩm rất đa dạng. Vì vậy đề tài tiến hành khảo sát thành phần nền mẫu của 6 mẫu
thực phẩm chức năng trên thị trường, sau đó chọn nền mẫu có tính đại diện nhất và
không chứa Inulin làm mẫu placebo. Sau đó tiến hành chiết theo quy trình chiết.
Thành phần mẫu placebo được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.1: Thành phần trong 3g mẫu placebo (nền mẫu rắn)
Thành phần

Hàm lượng

Calci Cacbonat (Nano)

50mg

Vitamin D3

200UI

Vitamin A

250UI

Nguyên sinh chất men bia tươi

1000mg

L-Lysin

20mg

Vitamin B1

0,4mg

Vitamin B2

0,2mg

Vitamin B6

0,4mg

Vitamin PP

10mg

Thành phần khác vừa đủ 1 gói

2.2.4. Dung môi, hoá chất
-

Natri nitrat của Merck – Đức.

-

Nước khử ion 18mΩ.

-

Natri azid của Merck – Đức.

-

Natri hydroxid của Merck – Đức

2.2.5. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:
-

Hệ thống máy HPLC Waters e2695 của Mỹ cùng phần mềm Empower® 3 2471

-

Cột sắc ký Shodex OHpack SB-806M HQ (300 x 8,0mm i.d.)
14


-

Máy siêu âm Elmasonic S120H (Đức)

-

Máy đo pH Eutech Ph510 (Singapo)

-

Máy lắc vortex

-

Máy ly tâm lạnh Universal 32R Hetich (Đức)

-

Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm

-

Cân phân tích Sartorius BP 121S (d=0,1mg, Max 120g) Đức

-

Tủ âm sâu Panasonic

-

Màng lọc PTFE 0,45 µm

-

Ống falcol 50ml, 15ml

-

Pipetman 100 – 1000 µL, 20 – 200 µL, 10 – 100 µL

-

Các dụng cụ khác: Bình định mức 10ml, 25nl, 50 ml, pipet Pasteur thuỷ tinh, cốc
có mỏ, ống đong, phễu lọc, vial loại 1,5 ml, …

2.2.6. Nội dung nghiên cứu
-

Xây dựng quy trình chiết xuất Inulin trong các mẫu thực phẩm chức năng.

-

Khảo sát điều kiện HPLC để phân tích Inulin.

-

Thẩm định phương pháp phân tích đã được xây dựng.

-

Áp dụng phương pháp phân tích để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức năng
bổ sung Inulin.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Khảo sát điều kiện HPLC
-

Khảo sát cột sắc ký sử dụng:
Cột Shodex OHpak SB-806M HQ (300mm x 8.0 mm i.d.)

-

Khảo sát một số pha động dựa trên các tài liệu tham khảo
Bảng 2.2: Hệ pha động khảo sát

MP1

Nước khử ion 18mΩ 100%

MP2

NaNO3 0,1M/H2O

[20], [34]

2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Qua tham khảo các tài liệu và dựa vào độ tan của Inulin, đề tài cố định dung môi chiết
là H2O để khảo sát:
-

Kỹ thuật chiết: siêu âm và đun cách thuỷ ở 85oC
15


-

Thời gian chiết.

2.3.3. Thẩm định quy trình
Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích Inulin bằng HPLC-RI được thẩm
định về các tiêu chí sau:
a. Độ ổn định hệ thống HPLC-RI
Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần 1 dung dịch
chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic
của các lần tiêm sắc ký.
Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu
thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00% [2].
b. Tính chọn lọc
-

Chuẩn bị các mẫu sau:

● Mẫu chuẩn Inulin như mục 2.2.2
● Mẫu placebo, mẫu placebo thêm chuẩn.

-

Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được.

-

Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm xuất hiện pic
của Inulin không được xuất hiện pic lạ.

c. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử
có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng theo phương pháp đã xây dựng. Giới
hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định
lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp.
Cách xác định: thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu lacebo và xác định
giá trị S/N tương ứng. LOD là giá trị mà nồng độ tại đấy tín hiệu đo lớn gấp 3 lần nhiều
đường nền (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn gấp 10 lần nhiều
đường nên (S/N=10), thường xác định giá trị LOD qua công thức LOQ = 3xLOD.
d. Khoảng tuyến tính
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần, giới hạn dưới của đường
chuẩn dựa vào giá trị LOQ, giới hạn trên của đường chuẩn căn cứ vào hàm lượng Inulin
trong một số thực phẩm chức năng trên thị trường.
16


- Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan
r.

-Yêu cầu: đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và 0,995≤r≤1.
e. Độ lặp lại
- Độ chính xác của một quá trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân
tán) kết quả giữa 1 loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất
dưới những điều kiện mô tả.
- Cách xác định: độ lặ lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác
định bằng cách tiến hành chiết và chạy sắc ký mẫu thực phẩm chức năng có Inulin trong
6 lần độc lập. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%).

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn
N là số lần thí nghiệm
Xi là giá trị tính được của lần thử
nghiệm thứ “i”.
Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương
đối RSD (%) của Inulin phải không lớn hơn 5,3% tại mức nồng đồ 100 ppm và 3,7% tại
mức nồng độ 0,1 % [4].
f. Độ đúng
- Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu
placebo. Lượng thêm chuẩn vào ở mức thấp, trung bình và cao. Tại mỗi nồng độ, phân
tích lặp lại 6 lần. Tính tỷ lệ thu hồi của Inulin thêm vào mẫu thử
- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 90% - 107% tại mức nồng độ 100 ppm và 95% - 105%
tại mức nồng độ 0,1% theo hướng dẫn của AOAC 2016 (Phụ lục 6).
2.3.4. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Inulin trong một số thực
phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường.
Nhằm bước đầu đánh giá sự có mặt và hàm lượng của Inulin trong một số thực
phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường, đề tài đã tiến hành lấy ngẫu nhiên 4 mẫu
17