NGUYỄN THỊ TOÁN mã SINH VIÊN 1502062 NGHIÊN cứu mức độ NHIỄM nấm mốc và AFLATOXIN TRÊN vị THUỐC ý dĩ ( SEMEN COICIS) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TOÁN
MÃ SINH VIÊN: 1502062

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM
NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN
TRÊN VỊ THUỐC Ý DĨ
( SEMEN COICIS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TOÁN
MÃ SINH VIÊN: 1502062

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM
NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN
TRÊN VỊ THUỐC Ý DĨ
( SEMEN COICIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Tạ Thu Lan
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Vi Sinh và Sinh Học
2. Viện Kiểm nghiệm thuốc TƢ

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng chân thành và biết ơn sâu sắc đến
người thầy của tôi là ThS. Tạ Thu Lan – Giảng viên Bộ môn Vi sinh và Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội. Cô là người đã định hướng cho tôi ngay từ những
ngày đầu làm khóa luận. Trong suốt thời gian làm khóa luận, cô đã luôn tận tình
hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kĩ thuật viên của Bộ
môn Vi sinh và Sinh học cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội –
là những người thầy đã chia sẻ và giúp tôi có được những kiến thức quý báu trong
học tập và hành trang trong quá trình thực hiện khóa luận.
Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn và các em sinh viên
nghiên cứu khoa học trên Bộ môn Vi sinh và Sinh học là những người đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi rất nhiều từ khi khóa luận mới bắt đầu được tiến hành cho đến khi
hoàn thành.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình tôi, đến các bạn của tôi. Họ là
những người luôn bên cạnh khích lệ, động viên và giúp đỡ tôi suốt những năm
tháng qua, lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Toán

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................... .5
1.1. Một vài nét đại cương về chi Aspergillus ............................................ .5
1.2. Một số nét đại cương về chi Penicillium ............................................. .7
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược trong và
ngoài nước .................................................................................................. 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ngoài
nước…………………………………………………………………..……………..8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược trong nước12

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .......................................................................................... .14
2.1. Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu ................................................... .14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. .14
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc .................................. .14
2.1.3. Aflatoxin chuẩn ........................................................................... .14
2.1.4. Thiết bị nghiên cứu...................................................................... .15
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................... .15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... .15
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. .15
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu .................................... .16
2.3.3. Phương pháp phân lập nấm mốc .................................................. .16
2.3.4. Phương pháp phân loại nấm mốc: …………………………………….….16

2.3.5. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm....................................... .17
2.3.6. Phương pháp phân tích độc tố aflatoxin……...…………………………..17

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................. 19


3.1. Hàm ẩm của các mẫu ý dĩ nghiên cứu ............................................... .19
3.2. Mức độ nhiễm nấm trên các mẫu ý dĩ nghiên cứu ............................. .19
3.2.1. Kết quả phân lập và phân loại ...................................................... .19
3.2.2. Đặc điểm khuẩn lạc, vi học của một số loài phân lập được từ các
mẫu ý dĩ nghiên cứu .............................................................................. .25
3.3. Kết quả định lượng aflatoxin trên các mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu.............26
3.3.1. Nồng độ chuẩn làm việc………………………………………….……..26
3.3.2. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống……………………….……26
3.3.3. Kết quả nghiên cứu khoảng nồng độ tuyến tính của aflatoxin…………..26
3.3.4. Kết quả xác định hàm lượng aflatoxin trong các mẫu ý dĩ……………...27
3.4. Một số ý kiến bàn luận ……………………………………………………..27
3.4.1. Về hàm ẩm dược thảo.............................................................................27
3.4.2. Về mức độ nhiễm nấm............................................................................28
3.4.3. Về mức độ nhiễm độc tố aflatoxin..........................................................29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….30
1. Kết luận………………………………………………………………..30
1.1. Mức độ nhiễm nấm mốc…………………………………………..30
1.2. Về mức độ nhiễm aflatoxin……………………………………….30
s2.

Đề xuất và kiến nghị…………………………………………………..31

2.1. Đề xuất......................................................................................................31

2.2. Kiến nghị...................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC: Sắc ký đồ định lượng aflatoxin


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADM

: Aspergillus Differentiation Medium Base

BGYF test

: Bright greenish-yellow fluorescence test

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

DGM

: Dichloran Glycerol Medium Base

HPLC

: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

HPLC-MS/MS

: Sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp detector khối phổ 2 lần

(High performance liquid chromatography - tandem mass
spectrometry)

IARC

International Agency for Research on Cancer

LÔ

: Phố Lãn Ông

MEA

: Malt Extra Agar

PDA

: Potato Dextrose Agar

TLC

: Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UPLC-MS/MS

: Sắc kí siêu hiệu năng kết hợp detector khối phổ 2 lần (Ultra
performance liquid chromatography - tandem mass
spectrometry)

PPB

: phần triệu


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu ........... …………..19
Bảng 3.2. Số lượng các chủng, chi và loài nấm chủ yếu phân lập được từ các
mẫu ý dĩ nghiên cứu .................................................................................... .19
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng phân lập từ các mẫu ý dĩ
nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, 7 ngày nuôi)…………………………25
Bảng 3.4. Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân lập được từ các mẫu ý
dĩ nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, 7 ngày nuôi)...................................25
Bảng 3.5. Mức độ nhiễm aflatoxin trên các mẫu ý dĩ nghiên cứu….……………..27

2


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1. Loài A. parasiticus nhiễm trên vị thuốc ý dĩ…………….…………21
Hình 3.2. Loài A.flavus nhiễm trên vị thuốc ý dĩ……………………………..22
Hình 3.3. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc ý dĩ:………………….………....23
Hình 3.4. Loài Penicillium sp1 nhiễm trên vị thuốc ý dĩ:……………….……24

3


ĐẶT VẤN ĐỀ

Thảo dược và các chế phẩm của chúng thường rất dễ bị nấm mốc xâm
nhiễm và phát triển, nhất là trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam.
Khi bị mốc các sản phẩm này bị giảm chất lượng làm giảm hiệu quả điều trị.
Hơn thế nữa, các sản phẩm này thường bị nhiễm các chất chuyển hóa thứ cấp
độc của nấm được gọi là mycotoxin, gây nguy hiểm cho sức khỏe người sử
dụng. Các độc tố này có thể gây ra các bệnh cho con người và động vật
(mycotoxicosis), với các tác động từ cấp tính đến mãn tính, và có thể dẫn đến
quái thai, ung thư, …[5], [7], [19]. Ý dĩ (Semen Coicis) là thảo dược thường
được sử dụng trong đông y để chữa trị tả lỵ, lợi tiểu tiện, tiêu phù thũng, đặc
biệt làm thuốc bồi bổ cơ thể, thực phẩm chức năng do có đầy đủ các thành
phần protid, chất béo và tinh bột [8]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn có rất ít các
đề tài trong nước nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên vị
thuốc này. Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc và an toàn cho người sử
dụng dược thảo nói chung, vị thuốc ý dĩ nói riêng, đề tài: “Nghiên cứu mức
độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên vị thuốc ý dĩ (Semen Coicis)” đã được
thực hiện với 2 mục tiêu sau:
1. Xác định mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc ý dĩ.
2. Phân tích độc tố aflatoxin nhiễm trên các mẫu ý dĩ nghiên cứu.

4


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
Ý dĩ mọc hoang ở nơi ẩm mát, ven suối. Một số tỉnh đã trồng như Nghệ
Tĩnh, Thanh Hóa, Lai Châu. Hình cầu bầu dục hoặc cầu tròn, phía đáy tương
đối rộng, hơi bằng, phía đỉnh tròn đầy, dài 0,5 – 0,65cm, rộng 0,3 – 0,5cm.
Mặt ngoài mầu trắng hoặc trắng vàng, mặt sau có một đường rãnh dọc sâu,
rộng lòng, rãnh sù sì, mầu nâu, phần cuống lõm vào, trong đó có một nốt nhỏ
mầu nâu. Chất cứng, đập vỡ ra có mầu trắng, có bột, không mùi, vị ngọt.
Thành phần hóa học: protein 16,2%, chất béo 4,65%, carbohydrate 79,17 %,

lượng ít vitamin B1 (330 vi lượng%) ngoài ra còn có amino acids (là leucine,
lysine, arginine (Arg), tyrosine v.v…), coixol, coixenolide, hợp chất
triterpenoid. Công dụng: Kiện tỳ, bổ phế, thanh nhiệt, lợi thấp.Trị tiết tả, thấp
tý, gân mạch co rút, co duỗi không lợi, thủy thũng, cước khí, phế nuy, phế
ung, trường ung, lâm trọc, bạch đới.
Nấm mốc là dạng nấm sợi, có hoặc không có vách ngăn. Trong đó,
nhóm nấm mốc ưa khô, đặc biệt là 2 chi Aspergillus và Penicillium có vài trò
quan trọng trong đời sống và y dược học.
1.1. Một số nét đại cƣơng về chi Aspergillus
Chi Aspergillus đặc trưng bởi những đặc điểm: Hệ sợi nấm gồm các sợi
ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp
trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc.
Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào có đường kính lớn
hơn, màng tế bào dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân- foot
cell). Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm,
gần thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất. Giá bào
tử trần không có nhánh, không có hoặc có it vách ngang, có phần đỉnh to ra
thành bọng (vesicle) hình chùy, hình elip, hình nửa cầu hoặc hình cầu. Bọng
hữu thụ này (bọng đỉnh giá) mang các thể bình (phialide). Các thể bình này
song song hoặc họp thành cụm ở đỉnh bọng hoặc xếp thành tia sát nhau trên
toàn bộ bề mặt bọng. Thể bình hoặc chỉ có một tầng (uniseriate) hoặc có hai
tầng (biseriate). Thể bình hai tầng tức là: Thể bình cấp 1 (còn gọi là cuống thể

5


bình, metula), mỗi cuống thể bình mang một cụm gồm 2 hoặc nhiều hơn các
thể bình cấp hai (thể bình, phialid) ở phần đỉnh. Các bào tử trần (conidi) tạo
thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc, không phân
nhánh (bào tử ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình

bào tử càng già). Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích
thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn, xù xì, có gai hay nốt sần). Hình thái bào tử trần
phụ thuộc vào từng loài. Bọng, thể bình, cuống thể bình, conidi họp thành
khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head). Conidial head có thể có các dạng
như hình cột (columnar), hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn (radiate). Một số loài
có thể sinh tế bào Hülle có thành nhẵn, dày, đơn độc hoặc thành chuỗi; hạch
nấm là các khối sợi, thường có dạng hình cầu cứng [7], [22], [23].
Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ
chất khác nhau, nhất là các loại cơ chất có nguồn gốc thực vật như các loại hạt
lương thực, thảo dược và các sản phẩm chế biến từ các nguồn cơ chất này
[10]. Về vai trò của chi Aspergillus, nhiều loài được dùng trong công nghệ lên
men, sản xuất enzym (amylase, protease …), sản xuất các acid hữu cơ (acid
citric, acid glucomic)…[7], [22]. Tuy nhiên chi Aspergillus lại được quan tâm
đặc biệt bởi khả năng sinh độc tố (mycotoxin) và ký sinh gây bệnh ở người và
động vật. Một số độc quan trọng do các loài của chi Aspergillus tạo ra như
aflatoxin, ochratoxin A, patulin, citrinin và acid cyclopiazonic [10], [15].
Trong đó, quan trọng nhất phải nói đến là aflatoxin.
Aflatoxin là một nhóm chất, trong đó quan trọng nhất là các aflatoxin
B1, B2, G1, G2 và M1. Các aflatoxin nhóm B (B1, B2) và G (G1, G2) lần
lượt phát huỳnh quang màu xanh blue (B) và green (G) trong bức xạ UV
(365nm) và là các aflatoxin thường gặp trong tự nhiên [17], [19]. Aflatoxin
M1 là chất chuyển hóa sinh học của aflatoxin B1 trong cơ thể thể người và
động vật, thường gặp trong sữa (Milk), nhất là các động vật cho sữa (do thức
ăn bị nhiễm aflatoxin B1). Đây là 5 aflatoxin được quan tâm phân tích và có
6


qui định hàm lượng tối đa cho phép trên lương thực, thực phẩm và thảo dược
trên thế giới. Aflatoxin rất bền với nhiệt, không bị phá hủy ở nhiệt độ đun nấu
bình thường (100oC) [10].

Về khả năng gây ung thư trên người và động vật của aflatoxin, IARC
(tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế) đã đưa ra đánh giá rằng: Có bằng chứng
đầy đủ về khả năng gây ung thư ở người và động vật của hỗn hợp các
aflatoxin (B1, B2, G1, G2) xuất hiện tự nhiên và của từng aflatoxin B1, G1,
M1, với bằng chứng giới hạn đối với aflatoxin B2 và bằng chứng chưa đầy đủ
đối với aflatoxin G2. Trong đó, khả năng gây ung thư gan là chủ yếu [19].
Ngoài ra, aflatoxin B1 còn gây tổn thương đáng kể hệ miễn dịch, đặc biệt với
miễn dịch qua trung gian tế bào, làm tăng khả năng nhạy cảm với nhiễm trùng
do vi khuẩn và ký sinh trùng của cơ thể [19].
Aflatoxin thường nhiễm trên lương thực, thực phẩm, dược thảo và chủ
yếu do 2 loài Aspergillus flavus và A. parasiticus sinh ra. Loài A. flavus
thường sinh các aflatoxin nhóm B, trong khi A. parasiticus sinh cả afaltoxin
nhóm B & C [23], [25].
Loài nấm của chi Aspergillus có khả năng ký sinh gây bệnh cơ hội phổ
biến nhất ở người và động vật trên thế giới là A. fumigatus [30].
1.2. Một số nét đại cƣơng về chi Penicillium
Chi Penicillium thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp Nấm bất toàn
trong hệ thống phân loại hình thái (Saccardo, 1886) [7]. Chi Penicillium đặc
trưng bởi các đặc điểm sau:
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi
màu sẫm. Khuẩn lạc phát triển nhanh, thường ngả màu lục, vàng lục, xanh
lục, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu
hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có
màu sắc do có mặt sắc tố hòa tan tương ứng. Khuẩn lạc có hoặc không có viết
khía xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc không có các giọt tiết (exudate).
7


Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là chổi hoặc penicillus) hoặc chỉ
gồm giá bào tử trần với với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo một vòng;

monoverticillate), hoặc bao gồm giá bào trần với 2 đến nhiều cuống thể bình
(metula) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có thể bình
(cấu tạo 2 vòng; biverticillate). Trường hợp các giá bào tử trần mang 1 hoặc
nhiều nhánh (branch) ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống thể
bình và các cuống mang các thể bình cũng được coi là cấu tạo 2 vòng. Khi
các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo 2 vòng đó
được coi là cấu tạo hai vòng đối xứng, trường hợp các cuống thể bình xếp
không đều đặn trên phần ngọn giá hoặc có nhánh, cấu trúc này được gọi là
cấu trúc 2 vòng không đối xứng. Trường hợp giá bào tử trần mang nhiều
nhánh và các nhánh này cùng với cuống thể bình, các thể bình xếp đều đặn và
sát nhau, lúc này bộ máy mang bào tử trần có cấu tạo nhiều vòng
(polyverticillate) [7], [22].
Chi Penicillium cũng có khả năng sinh một số độc tố quan trọng như:
ochratoxin A, patulin và citrinin [10], [22].
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dƣợc trong
và ngoài nƣớc
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược ngoài
nước
Dược thảo đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền
và nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng. Các
bài thuốc dược thảo gia truyền được sử dụng để phòng tránh, trị liệu và cứu
chữa các rối loạn và nhiều bệnh khác nhau từ thời cổ xưa. Tuy nhiên, nguồn
nguyên liệu này chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng, độ an toàn và
tính hiệu quả. Trong quá trình thu hoạch, vẫn chuyển, bảo quản và phân phối,
các dược thảo là mục tiêu lây nhiễm của nhiều loại nấm mốc khác nhau, và có
thể là nguyên nhân của sự hư hỏng và tạo thành mycotoxin. Việc sử dụng
8


ngày một tăng các thực vật làm thuốc tạo ra mối nguy cơ về sức khỏe cho

cộng đồng do thiếu các nghiên cứu cần thiết về cách sử dụng, tính hiệu quả,
độc tính, và chất lượng của các sản phẩm tự nhiên này. Khi nguồn dược thảo
được sử dụng tăng cao có thể dẫn đến việc tăng lượng mycotoxin đưa vào cơ
thể. Bởi vậy, dược thảo nhiễm mycotoxin có thể góp phần tạo ra các vấn đề
bất lợi đối với sức khỏe con người, và có thể dẫn đến rủi ro nguy hiểm đến
tính mạng. Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều mycotoxin trong các loại thực vật
làm thuốc và các dược thảo truyền thống đã được ghi nhận ở nhiều nước trên
thế giới như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, các nước
Trung Đông, … [10], [17], [26].
Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 12 dược thảo
dạng hạt gồm: Thảo quyết minh (cassia seed), hạt cây tơ hồng (chinese
dodder seed), hạt ý dĩ (coix seed), sa uyển tử (flastem milkvetch seed), hạt sen
(lotus seed), hạt vải (lychee seed), đào nhân (peach seed), hạt tiêu
(pepperweed seed), hạt mã đề (plantain seed), bá tử nhân (platycladi seed),
hạt màn màn (spiderflower seed), và hạt quýt (tangerine seed) cho thấy: 27
loài thuộc 12 chi nấm phân lập được từ các mẫu hạt được tiệt trùng bề mặt.
Trong đó, loài Chaetomium globosporum là phổ biến nhất (chiếm tỷ lệ 23%),
tiếp sau là loài Microascus trigonosporus (12%) và Alternaria alternata (9%).
Với hệ vi nấm bề mặt, 34 loài thuộc 7 chi đã được phát hiện. Trong đó,
Aspergillus niger và Penicillium polonicum là các loài phổ biến nhất (lần lượt
là 12% và 15%). Các mẫu hạt dược thảo đã được kiểm tra khả năng nhiễm 2
độc tố chính là ochratoxin và aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) bằng thiết bị siêu
hiệu năng cao kết nối với detector khối phổ 2 lần (UPLC-MS/MS) cho thấy:
Các mẫu hạt bá tử nhân (từ cây trắc bá) đã bị nhiễm độc tố aflatoxin B1 (52,0
µg/kg) và hạt quýt đã phát hiện thấy độc tố ochratoxin A (92,3 µg/kg), quá
qui định cho phép (5 µg/kg và 20 µg/kg) của châu Âu [13].

9

Một nghiên cứu khác, khảo sát khả năng nhiễm aflatoxin B1, B2, G1 và
G2 trong các mẫu hạt của 2 loài cây: Mucuna pruriens L.,

Portulaca

oleracceae L., và rễ của cây: Delphinium denudatum Wall, được thu thập từ
các chợ ở New Delhi (Ấn Độ) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với
khối phổ 2 lần (HPLC-MS/MS) cho thấy: các aflatoxin B1, B2 đã được phát
hiện ở dạng vết (thấp hơn giới hạn phát hiện) trong hạt của cây M.pruriens,
không phát hiện được trong rễ của cây D.denudatum. Hạt của cây P.oleraceae
đã bị nhiễm aflatoxin B1 và B2 [29].
Đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế
Cinamomum zeylanicum Blume), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các
hiệu bán lẻ ở khu vực miền đông của Arập Xeút. Tổng số 1.126 chủng nấm
thuộc 8 loài của 2 chi Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện
từ 50 mẫu nghiên cứu. Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ,
thuộc các loài Aspergillus terreus, A. glaucus, A. flavus, A. fumigatus, A.
clavatus, A. niger Penicillium restrectum và Penicillium sp.. Xác định
mycotoxin trên các mẫu vỏ cho thấy: các aflatoxin B1, B2 và G1 được phát
hiện ở nồng độ thấp (không quá 4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên cứu [9].
Khati [20] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu thảo
dược thô của 10 cây thuốc (Emblica officinalis, Terminalia chebula, T.
belerica, Zingiber officinalis, Piper nigrum, Cinnamomum tamala, Piper
longum, Wthania somnifera, Asparagus racemosus và Chlorophytum
borivilianum), được bảo quản ở các địa điểm khác nhau của bang Haridwar,
Ấn Độ, kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đã bị nhiễm một hoặc nhiều các chi
nấm Alternaria,
Curvularia,

Aspergillus,

Fusarium,

Chaetomium,

Cladosporium,

Penicillium, Mucor, Rhizopus, Rhizoctonia và Verticillium.

Trong số các chủng nấm phân lập được, loài Aspergillus flavus chiếm tỷ lệ
cao nhất (23,6%), tiếp sau là A. niger (19,2%). Phân tích aflatoxin cho thấy:

10


2/10 mẫu bị nhiễm aflatoxin B1. Kết quả này cho thấy: các thảo dược đã tiềm
ẩn rủi ro đối với sức khỏe của người tiêu dùng và cần phải được kiểm tra chặt
chẽ trước khi cho phép đưa vào sử dụng trong cộng đồng.
Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 84 mẫu thảo dược và
gia vị thực phẩm thường dùng (có nguồn gốc từ 14 loại thực vật khác nhau,
được nhập khẩu từ Ấn Độ) được thu thập từ các hiệu bán lẻ của thủ đô Cairo,
Ai Cập. Kết quả cho thấy: 10 chi nấm đã được nhận diện. Trong đó, các loài
A. flavus, A. parasiticus, A. niger, Fusarium oxysporum, và Penicillium
viricatum xuất hiện với tần suất cao nhất. Kết quả phân tích mycotoxin cho
thấy: 17 mẫu đã bị nhiễm aflatoxin B1, với lượng trung bình từ 10-160 µg/kg.
Độc tố ochratoxin được phát hiện trong 3 mẫu, trung bình từ 20-80 µg/kg
[11].
Điều tra mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 50 mẫu dược liệu là lá
khô của 2 loài thực vật (Azadirachta indica và Justica adhatoda) được thu
thập từ các hiệu bán buôn và bán lẻ của 8 quận thuộc bang Jammu & Kashmir

(Ấn Độ) bằng kỹ thuật rửa bề mặt (surface washing technique), sắc ký lớp
mỏng (TLC) và HPLC. Kết quả cho thấy: có tổng số 50 loài, thuộc 30 chi đã
được phân lập. Sự đa dạng của các loài nấm trên 2 mẫu lá tương đối giống
nhau. Các loài nấm phân lập được có khả năng sinh mycotoxin quan trọng.
Kết quả phân tích độc tố cho thấy: các aflatoxin B1, B2, patulin đã được phát
hiện trên các mẫu lá khô của Azadirachta indica, và aflatoxin B1, B2,
zearalenol cũng được phát hiện ở các mẫu lá cây Justica adhatoda. Trong các
mycotoxin được phát hiện, aflatoxin có trên cả 2 loại lá (do sự có mặt của các
chủng sinh độc tố loài A. flavus) [28].
Đánh giá mức độ nhiễm nấm và khả năng sinh độc tố trên 152 mẫu dược
liệu thô có nguồn gốc từ 56 loài thảo dược, được thu thập từ 13 cơ sở sản xuất
của Achentina [24], bằng các phương pháp phân lập, nhận diện chuẩn cho

11


thấy: có 52% mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài của chi Aspergillus. Trong số
này, nhóm loài A. flavus chiếm 27% và 25% thuộc nhóm loài A. niger. Ngoài
ra, 16% tổng số mẫu đã bị nhiễm các loài của chi Fusarium. Các loài A. flavus
và A. parasiticus phân lập được nhiều nhất, với 50% trong số 40 chủng phân
lập được có khả năng sinh độc tố, và nồng độ aflatoxin xác định được dao
động trong khoảng 10-2000 ng/g. Trái lại, chỉ có 26% số chủng của nhóm loài
A.niger phân lập được có khả năng sinh độc tố ochratoxin A ở nồng độ thấp,
trong khoảng 0,12-9,0ng/g. Trong số 29 chủng thuộc các loài của chi
Fusarium phân lập được, có 27,5% số chủng thuộc 2 loài F. verticilloides và
F. proliferatum có khả năng sinh độc tố fumonisin B1 và fumonisin B2, lần
lượt dao động trong các khoảng 20,0-22.000 µg/g và 5,0-3.000 µg/g. Các loài
còn lại gồm F. equiseti, F. oxysporum, F. semitectum, F. compactum, F.
sambucinum và F. solani có khả năng sinh trichothecene nhóm A và B hoặc
Zearalenone. Qua tỷ lệ nhiễm các loài nấm có khả năng sinh độc tố trên các

mẫu thảo dược nghiên cứu, cho thấy sự cần thiết phải điều tra mức độ nhiễm
tự nhiên của mycotoxin. Trên cơ sở đó mới có thể xác định được giới hạn hợp
lý về các loại độc tố, giúp quản lý hiệu quả nguồn nguyên liệu thảo dược,
tránh rủi ro về sức khỏe của cộng đồng người sử dụng.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược trong
nước
Việt Nam là một trong những quốc gia sử dụng lượng thảo dược lớn
hàng năm, lại có khí hậu nóng ẩm, phương pháp thu hoạch, chế biến, bảo
quản còn lạc hậu, chủ yếu theo kinh nghiệm, … Điều này làm cho nguồn
nguyên liệu và chế phẩm dược thảo rất dễ bị nấm mốc xâm nhiễm, phát triển
và sinh độc tố.
Trong khoảng vài thập niên qua, mặc dầu chưa nhiều nhưng cũng có một
số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên thảo
dược [3], [4], [5], [6].... Trong đó, đáng chú ý là công trình nghiên cứu về
12


mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin của tác giả Trần Trịnh Công và cộng sự
[5] trên 9 vị thuốc gồm: Hạt sen (Semen Nelumbinis): 70 mẫu; Ngũ vị tử
(Fructus Kadsurae), ý dĩ (Semen coicis): mỗi vị 20 mẫu; Nhân sâm (Radix
ginseng), đẳng sâm (Radix Codonopsis), sa sâm (Launae pinnatifida Cass., rễ
nhiều cây khác nhau, họ thực vật khác nhau), ngưu tất (Radix Achyranthis
bidentatae), bạch truật (Rhizoma Atractylodis macrocephalae, thân rễ phơi
hay sấy khô của cây bạch truật) và hòang kỳ (Radix Astragali membranacei,
rễ phơi hay sấy khô của cây hoàng kỳ): mỗi vị 15 mẫu, được thu thập từ các
hiệu thuốc đông dược thuộc phố Lãn Ông, Hà Nội; thành phố Hải Dương,
tỉnh Hải Dương; thị xã Bác Ninh, Tỉnh Bắc Ninh. Kết quả phân tích nấm và
độc tố aflatoxin cho thấy, các chủng nấm phân lập được chủ yếu thuộc chi
Aspergillus, tiếp sau là Penicillium và nhóm nấm tiếp hợp với các chi
Rhizopus, Absidia và Mucor. Trong đó, các loài có khả năng sinh độc tố như

A. flavus, A. parasiticus, A. niger thường chiếm tỷ lệ cao trên các thảo dược
dạng quả, hạt: 10/20 mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm 2 loài A. flavus và A.
parasiticus với số lượng chủng phân lập được dao động 4-18 chủng/mẫu (60
hạt); 20/70 mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm loài A. flavus với tỷ lệ chủng dao
động từ 10-60 chủng/mẫu (60 hạt). Kết quả phân tích độc tố bằng HPLC cho
thấy: 13/20 bị nhiễm aflatoxin toàn phần (tổng của B1, B2, G1 và G2) dao
động trong khoảng 2,2-364,3 ppb; trong đó, có 12 mẫu vượt quá qui định của
DĐVN IV (PL12.21), lớn hơn 4ppb (5,3-364,3 ppb). Với vị thuốc ý dĩ: 6/10
mẫu phân tích độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 3,3-24,1 ppb;
trong đó có 5 mẫu vượt qúa 4ppb (8,8-24,1). Vị thuốc ngũ vị tử có 5/10 mẫu
phân tích độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 0,1- 0,9 ppb. Với
kết quả thu được cho thấy nguồn nguyên liệu thảo dược này cần phải được
giám sát chặt chẽ trước khi chuyển đến các nhà máy sản xuất thuốc và cộng
đồng sử dụng; bởi việc sử dụng các sản phẩm này rất thường xuyên và kéo
dài.
13


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, TRANG THIẾT BỊ
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
10 mẫu của vị thuốc ý dĩ được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược
thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm) vào tháng 10 của năm
2018, được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi
phân, phân loại nấm và xác định mức độ nhiễm aflatoxin.
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc
- Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ:
200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC) 5,6 ±0,2.
- Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ).

Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5;
Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25 oC): 5,6
± 0,2.
- Môi trường xác định 2 loài A.flavus và A.parasiticus: Aspergillus
D’ifferentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l):
Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran:
0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25 oC): 6,3 ± 0,2.
- Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Đường
kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5;
FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 7,3 ± 0,2.
2.1.3. Aflatoxin chuẩn
Aflatoxin
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2
Aflatoxin G1
Aflatoxin G2

Số lô
3-LWJ-61-1
3-LWJ-22-1
4-LXM-6-1
2-JLW-148-1

14

Hàm lƣợng
98%
96%
98%
98%

Nhà sản xuất
TRC
TRC
TRC
TRC


2.1.4. Thiết bị nghiên cứu
- Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số
Canon (Nhật Bản).
- Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức).
- Tủ ấm Memmert (Đức)
- Tủ sấy SEL LAB (Đức)
- Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản).
- Hệ thống HPLC Shimadzu LC- 20AD, detector huỳnh quang.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu gồm 6 nội dung chính như sau:
- Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu của vị thuốc nghiên cứu, đặt lên
các đĩa Petri chứa môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được chuẩn bị
và ủ ở 27ºC trong 5-7 ngày.
- Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu.
- Nuôi cấy các chủng nấm phân lập được trên môi trường Czapek Dox Agar ở
25ºC trong 7 ngày.
- Nuôi cấy xác định các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên
môi trường ADM (AFPA).
- Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, vi học, sinh hóa của các chủng nấm và xác
định chi và loài.
- Phân tích mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên các mẫu dược liệu nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu là việc lựa chọn, thu thập các mẫu dược liệu cho việc kiểm tra
chất lượng. Mức độ đại diện của mẫu có ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác
và độ đúng của việc kiểm tra. Việc lấy mẫu dược liệu để tiến hành phân tích
nấm và độc tố được tiến hành dựa trên cơ sở phụ lục 12.1, DĐVN IV: Dược

15


liệu được lấy ở trên, giữa và cuối của mỗi bao gói, với khối lượng 200g. Mẫu
được trộn đều và san phẳng theo hình vuông; chia mẫu theo 2 đường chéo
thành 4 phần bằng nhau. Lấy 2 phần đối diện, trộn đều và san phẳng theo hình
vuông, chia thành 2 phần bằng nhau theo đường chéo; một phần được dùng để
phân tích nấm, phần còn lại được dùng để phân tích độc tố.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu
Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối
lượng do làm khô" (Phụ lục 9.6, DĐVN IV). Cách tiến hành: Dược liệu được
nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm. Cân một lượng
mẫu thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 105C trong vòng 4
giờ. Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi cân ngay
(m’).
Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:

2.3.3. Phương pháp phân lập nấm mốc:
Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở
phương pháp của Samson và cộng sự (phương pháp đặt trực tiếp trên môi
trường PDA hoặc DGM) [25]: Các mẫu dược liệu (mỗi mẫu tối thiểu 60 hạt)
được khử trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid 1% mới
pha trong 2 phút [27]. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng. Để ráo
nước, và đặt nhanh vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM)

bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 57 ngày tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu
nghiên cứu.
2.3.4. Phương pháp phân loại nấm mốc:
- Phân loại các chi nấm theo khóa phân loại của Barnet và Hunter [12].

16


- Phân loại các chủng nấm đến cấp loài thuộc các chi (Aspergillus,
Penicillium, …) dựa trên mô tả đặc điểm khuẩn lạc, vi học các loài của
Samson và cộng sự 1995 [25], Raper và Fennell 1965 [23], Pitt và Hocking
2009 [22]. Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự so sánh đặc điểm khuẩn
lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và sau của khuẩn lạc, các chất
tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (chủ yếu là cấu trúc sinh conidi,
kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi, …) của các chủng khi
được nuôi cấy trên môi trường chuẩn (Czapek Dox), trong cùng điều kiện
(nhiệt độ, thời gian, …).
- Xác định 2 loài A. flavus, A. paraciticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt
và Hocking [22]. Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A.
flavus, A. paraciticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C
sau 42-48 giờ sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái (mặt sau) khuẩn lạc.
2.3.5. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm
Mức độ nhiễm nấm được đánh giá bằng 2 chỉ số:
- Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài (hoặc chi) trên các mẫu nghiên cứu:
FQ (isolation frequency; %) = số mẫu có mặt loài (hoặc chi)/ tổng số mẫu
nghiên cứu x 100% [18].
- Chỉ số có nhiều hay mật độ loài (hoặc chi): RD (relative fungal density; %) =
số chủng của loài (hoặc chi)/ tổng số chủng nấm phân lập được x 100% [18].
2.3.6. Phương pháp phân tích độc tố aflatoxin
Các mẫu dược liệu được phân tích aflatoxin bằng hệ thống sắc lý lỏng

hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu LC-20AD với detector huỳnh quang (Viện
Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) gồm các bước sau:
- Xử lý mẫu dƣợc liệu trƣớc khi chiết pha rắn: Do điều kiện thời gian và
kinh tế không cho phép, chúng tôi đã chọn 3 mẫu ý dĩ có tỷ lệ nhiễm 2 loài
nấm sinh độc tố aflatoxin cao (63A LÔ, 24 LÔ và 51A LÔ) để phân tích độc

17


tố. Dược liệu được nghiền nhỏ, cân khoảng 4 g cho vào ống chiết. Thêm 10
ml hỗn hợp acetonitril (MeCN) : nước (85:15). Lắc xoáy trong vòng 1 phút.
Tiếp tục lắc siêu âm trong 1 giờ với nhiệt đổ bể lắc là 40o C. Ly tâm 10.000
vòng/phút trong 10 phút. Hút toàn bộ lớp dịch trong vào ống chiết thủy tinh.
Bảo quản trong tủ lạnh 2-8o C trong 24 giờ. Pha loãng dịch chiết 4 lần bằng
nước. Lắc xoáy, ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trong
(dung dịch A).
- Chiết pha rắn:
+ Cột C18 (Water, 500 mg, 6cc).
+ Hoạt hóa: 2 ml MeOH (metanol).
+ Cân bằng: 2 ml hỗn hợp MeOH : nước (10:90)
+ Nạp mẫu: 2 ml dịch trong (dung dịch A).
+ Rửa tạp: 4 ml MeOH : nước (20:90).
+ Rửa giải: 2 ml dung dịch acid formic 2% trong methanol)
+ Cô thu cắn, hòa tan trong 0,5 ml dung dịch acid formic 0,1% trong
hỗn hợp MeCN:nước (5:95).
+ Lọc qua màng 0,45.
+ Tiêm sắc ký thể tích 30 μl.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột C18; 150*4,6 mm; 5μm
+ Pha động: MeOH : đệm KBr (238mg KBr + 700 μl 4M HNO3/1L nước) = 45:55.

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 30 μl.
+ Detector huỳnh quang.
+ Bước sóng: λEX = 365; λEM = 455 nm.
+ Nhiệt độ cột: 40o C.

18


Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Hàm ẩm của các mẫu ý dĩ nghiên cứu
Hàm ẩm của cơ chất là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự lây
nhiễm và phát triển của nấm mốc trên thảo dược. Do vậy, các mẫu của vị
thuốc trước khi tiến hành phân lập nấm, được xác định hàm ẩm và kết quả
được liệt kê trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu
TT
1
2
3
4
5

Mẫu

Hàm ẩm (%)

55 LÔ
30 LÔ
63A LÔ

44A LÔ
36 LÔ

9,73
12,62
10,21
10,82
11,21

TT
6
7
8
9
10

Hàm
(%)
10,30
9,96
13,13
12,07
10,73

Mẫu
32 LÔ
24 LÔ
69A LÔ
51A LÔ
62 LÔ

ẩm

(Ghi chú. LÔ: Phố Lãn Ông)

Nhận xét: Trong 10 mẫu ý dĩ nghiên cứu, có 7/10 mẫu đạt yêu cầu của
DĐVN IV về hàm ẩm (≤ 12%), dao động trong khoảng 9,73-11,21%. Các
mẫu còn lại (3/10) có hàm ẩm không đạt yêu cầu của DĐVN IV (˃12%), dao
động trong khoảng 12,07-13,13%.
3.2. Mức độ nhiễm nấm trên các mẫu ý dĩ nghiên cứu
3.2.1. Kết quả phân lập và phân loại
Kết quả phân lập và phân loại các chủng nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị
thuốc ý dĩ nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số lượng các chủng, chi và loài nấm
chủ yếu phân lập được từ 10 mẫu ý dĩ nghiên cứu
Chi & loài
Aspergillus
A. flavus
A. parasiticus
A. niger
A. fumigatus
A. aculeatus

55 30
LÔ LÔ

63A 44A 36
LÔ LÔ LÔ

2

2
37
3

1

2

1

1
1

32
LÔ

12
2

1

1
1

1

2

19

24
LÔ
7
20
2
1

69A
LÔ

1
2

51A 62
LÔ LÔ

Tổng

Tỷ lệ
(%)

3
24

28
84
11
5
7

16,2
48,6
6,4
2,9
4,1

1
1
2

1


A. ustus
Penicillium
Penicillium sp.
Rhizopus
R. stolonifer
Absidia

3

2

3

1

1

1

A. corymbifera 1
Tổng

1

5

4

2

4

3

2

51

11

2

17

1

7

31

2

2

6

30

2

13

7,5

1

2

1,2

4

13

7,5

10

5,8

11

173

100
(%)

Nhận xét: Kết quả phân lâp, phân loại ở bảng 3.2 cho thấy: Từ 10 mẫu
ý dĩ nghiên cứu đã phân lập được 173 chủng nấm thuộc 9 loài của 4 chi
(Aspergillus, Penicillium, Rhizopus và Absidia). Trong đó, chi Aspergillus có
6 loài được phân lập gồm: A. parasiticus [hình 3.1] chiếm tỷ lệ cao nhất về số
chủng phân lập được là 48,6% (84/173) và có mặt trên 50% (5/10) mẫu
nghiên cứu. Xếp thứ 2 là loài A. flavus [hình 3.2] có tỷ lệ số chủng phân lập
được chiếm 16,2% (22/173), và có mặt 7/10 mẫu nghiên cứu, chiếm 70%.
Xếp thứ 3 là loài A. ustus, với tỷ lệ chủng phân lập và tỷ lệ mẫu có mặt lần
lượt là 7,5% (13/173) và 70% (7/10). Loài A. niger [hình 3.3] chiếm vị trí thứ
4 về số chủng phân lập được, với 6,4% (11/173) và phân lập được từ 70%
(7/10) mẫu nghiên cứu. Các loài A. aculeatus và A. fumigatus lần lượt xếp ở
vị trí thứ 5 và 6, với tỷ lệ chủng và tỷ lệ mẫu có mặt lần lượt là 4,1% (7/173)
và 50% (5/10); 2,9% và 40% (4/10).
Các chi nấm tiếp hợp có 2 loài phân lập được là R. Stolonifer và
Absidia corymbifera với tỷ lệ chủng và chỉ số có mặt lần lượt là 7,5%
(13/173) và 50% (5/10); 5,8% (10/173) và 50% (5/10).
Chi Penicillium với 2 chủng phân lập (thuộc một loài chưa được xác
định), chiếm tỷ lệ chủng phân lập 1,2% và có mặt trên 2 mẫu nghiên cứu
[hình 3.4].

20