Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên hai vị thuốc kha tử (fructus terminaliae) và nhục đậu khấu (semen myristicae) đang lưu hành trên địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐÀM THU HIỀN
MÃ SINH VIÊN: 1201185

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM
MỐC TRÊN HAI VỊ THUỐC KHA TỬ
(FRUCTUS TERMINALIAE) VÀ NHỤC ĐẬU
KHẤU (SEMEN MYRISTICAE) ĐANG LƢU
HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐÀM THU HIỀN
MÃ SINH VIÊN: 1201185

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM
MỐC TRÊN HAI VỊ THUỐC KHA TỬ
(FRUCTUS TERMINALIAE) VÀ NHỤC ĐẬU
KHẤU (SEMEN MYRISTICAE) ĐANG LƢU
HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Trịnh Công

Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Vi Sinh và Sinh Học

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến
TS. Trần Trịnh Công – giảng viên bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại
học Dược Hà Nội. Thầy là người đã định hướng cho tôi ngay từ những ngày
đầu làm khóa luận. Trong suốt thời gian làm khóa luận, thầy đã luôn tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận
này.
Tôi xin trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kỹ thuật viên
và các em làm nghiên cứu khoa học tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại
học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Nhân đây, tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng
toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức cho
tôi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình tôi, đến các bạn của tôi.
Họ là những người luôn bên cạnh khích lệ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn
thành khóa luận này.

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Đàm Thu Hiền


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Một vài nét về chi Aspergillus và Penicillium ....................................... 2
1.1.1. Chi Aspergillus ................................................................................ 2
1.1.2. Chi Penicillium ................................................................................ 4
1.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở
ngoài nước ..................................................................................................... 6
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở
trong nước.................................................................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 14
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc ................................... 14
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu ..................................... 15
2.3.2. Phương pháp phân lập nấm mốc ................................................... 15
2.3.3. Phương pháp phân loại nấm mốc .................................................. 16
2.3.4. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm. ....................................... 16
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 18
3.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc kha tử ...................................... 18
3.1.1. Hàm ẩm của các mẫu kha tử nghiên cứu ....................................... 18


3.1.2. Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu kha tử nghiên cứu ............ 18
3.1.3. Một số ý kiến bàn luận .................................................................. 25

3.2. Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc nhục đậu khấu ......................... 26
3.2.1. Hàm ẩm của các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu ......................... 26
3.2.2. Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu27
3.2.3. Một số ý kiến bàn luận .................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 37
1. Kết luận.................................................................................................... 37
1.1. Vị thuốc kha tử ................................................................................. 37
1.2. Vị thuốc nhục đậu khấu .................................................................... 37
2. Đề xuất..................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADM

: Aspergillus Differentiation Medium Base

AFPA

: Aspergillus Flavus/ Parasiticus Agar

CFU

: Colony-Forming Unit

CREA

: Creatine Sucrose Agar

DGM

: Dichloran Glycerol Medium Base

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LÔ

: Phố Lãn Ông

MEA

: Malt extract agar

PDA

: Potato Dextro Agar

A. flavus

: Aspergillus flavus

A. niger

: Aspergillus niger

A. fumigatus

: Aspergillus fumigatus

A. aculeatus

: Aspergillus aculeatus

A. ustus

: Aspergillus ustus

A. parasiticus

: Aspergillus parasiticus

A. tamari

: Aspergillus tamari

A. corymbifera

: Absidia corymbifera

R. stolonifer

: Rhizopus stolonifer

P. marneffei

: Penicillium marneffei

P. aurantiogiseum

: Penicillium aurantiogiseum


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc kha tử nghiên cứu

18

Bảng 3.2. Số lượng các chủng, chi và loài nấm phân lập được

19

từ 10 mẫu kha tử nghiên cứu
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

20

phân lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu
Bảng 3.4. Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân

21

lập được từ các mẫu kha tử nghiên cứu
Bảng 3.5. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc nhục đậu khấu

27

nghiên cứu
Bảng 3.6. Số lượng chủng, chi và loài phân lập được từ 10

27

mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu
Bảng 3.7. Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

29

phân lập được từ các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu
Bảng 3.8. Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân
lập được từ các mẫu nhục đậu khấu nghiên cứu

30


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc và quá trình sinh conidi của chi Aspergillus

3

Hình 1.2. Cấu trúc sinh conidi dạng chổi của chi Penicillium

5

Hình 3.1. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc kha tử

22

Hình 3.2. Loài A. fumigatus nhiễm trên vị thuốc kha tử

23

Hình 3.3. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc kha tử

24

Hình 3.4. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu

31

Hình 3.5. Loài A. fumigatus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu

32

Hình 3.6. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu

33

Hình 3.7. Loài A. parasiticus nhiễm trên vị thuốc nhục đậu khấu

34

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dược liệu nói chung và các sản phẩm làm thuốc có nguồn gốc thực vật
nói riêng thường dễ bị nấm mốc xâm nhiễm và phát triển, nhất là trong điều
kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam. Khi bị mốc các sản phẩm này ngoài
việc bị giảm chất lượng (bị biến đổi thành phần hoá học, biến màu, sinh các
mùi vị khó chịu,...) thường bị nhiễm các độc tố nấm (mycotoxin). Các độc tố
này có thể gây ra các bệnh cho con người và động vật gọi chung là bệnh do độc
tố nấm (mycotoxicosis), với các tác động từ cấp tính đến mạn tính, và có thể
dẫn đến quái thai, ung thư, …[2], [5], [15]. Kha tử (Fructus Terminaliae) và
nhục đậu khấu (Semen Myristicae) là các vị thuốc thường được sử dụng trong
đông y. Kha tử được dùng để chữa ỉa lỏng lâu ngày, chữa lỵ kinh niên, ho mất
tiếng, mồ hôi trộm. Nhục đậu khấu được dùng trong các trường hợp kém ăn,
nôn mửa và đau bụng [12]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có một công trình
trong nước nào nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên các
vị thuốc này. Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc và an toàn cho người sử
dụng dược thảo, nghiên cứu hệ vi nấm trên các sản phẩm này là một bước quan
trọng, làm cơ sở để có biện pháp thu hoạch, bảo quản hợp lý, phòng tránh các
tác hại nói trên. Với mục đích, ý nghĩa đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên hai vị thuốc kha tử (Fructus
Terminaliae) và nhục đậu khấu (Semen Myristicae) đang lưu hành trên địa
bàn Hà Nội” với hai mục tiêu:
1. Phân lập các chủng nấm mốc nhiễm trên các mẫu của 2 vị thuốc nghiên
cứu.
2. Phân loại các chủng nấm phân lập được đến cấp chi và loài.

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Một vài nét về chi Aspergillus và Penicillium
1.1.1. Chi Aspergillus
Chi Aspergillus do Micheli mô tả năm 1729, sau đó năm 1832 được
Fries chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi Aspergillus
chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Sau này Fries lại xem xét
bổ sung và được các nhà phân loại học công nhận nên được mang tên
Aspergillus Fries ex Fries.
Về mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm: Khuẩn lạc
thường phát triển nhanh, có thể có màu trắng, vàng, nâu vàng, nâu tới đen,
hoặc ngả màu xanh lá cây, chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp dày các
conidiophore thẳng đứng. Conidiophore (thường không phân nhánh) được cấu
tạo bởi một giá đỡ (stipe) không phân nhánh, với phần đỉnh phồng to gọi là
bọng (vesicle). Thể bình (phialide) được sinh trực tiếp trên bọng được gọi là
thể bình một tầng (uniseriate phialide), hoặc trên cuống thể bình (metula) là
thể bình hai tầng (biseriate phialide). Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có
mặt) và conidi hình thành một khối conidi (conidial head, hình 1.1). Khối
conidi có thể hình thành dạng cột (columnar), dạng phóng xạ (radiate) hoặc
dạng cầu (globose). Conidi (conidium) chỉ gồm một tế bào, bề mặt nhẵn hoặc
xù xì, có gai, không màu hoặc có màu. Một số loài có thể sinh tế bào Hülle
(Hülle cell) có thành nhẵn, dày, đơn độc hoặc thành chuỗi, hạch nấm
(sclerotium) là các khối sợi thường có dạng hình cầu, cứng.
Các loài của chi Aspergillus thường lây nhiễm phổ biến trên nhiều cơ
chất khác nhau, đặc biệt là trên các loại hạt lương thực, các loại cơ chất chết
có nguồn gốc thực vật [2], [30], [33]. Ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,
các loài của chi Aspergillus phổ biến hơn rất nhiều so với các loài của chi
Penicillium.

2

Hình 1.1. Cấu trúc và quá trình sinh conidi của chi Aspergillus
Một số loài của chi nấm này đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt do
chúng có khả năng gây bệnh ở người và động vật [36] hoặc có khả năng sinh
các chất chuyển hóa thứ cấp độc (mycotoxin) [33]. Một số loài khác có tầm
quan trọng trong lên men các sản phẩm truyền thống phương đông, hoặc các
ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ hoặc enzym [30].
Việc phân loại chi Aspergillus chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái.
Raper & Fennell (1965) [31] đã chia chi nấm này thành 18 nhóm (group) và
đã chấp nhận 132 loài với 18 thứ. Samon (1979, 1992, 1994a & b) đã công bố
sưu tập dữ liệu của các loài, thứ đã được mô tả từ 1965 và chỉ ra sợ bất hợp lý
của một số taxon đã được công bố. Hiện nay số lượng các loài của chi đã
được phát hiện lên tới trên 200 loài, trong đó có khoảng trên 70 loài là các
trạng thái hữu tính [30].

3


Nuôi cấy để nhận diện: Các chủng nấm được cấy đơn tại 3 điểm trên
môi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 25oC. Đối với các loài nấm ưa khô
như A. penicillioides, một số loài khác và trạng thái hữu tính Eurotium có thể
sử dụng các môi trường Czapek và MEA với 20-40% đường kính (sucrose).
Nuôi cấy các chủng tại 3 điểm trên các môi trường, sử dụng các đĩa Petri thủy
tinh tốt hơn các đĩa Petri bằng chất dẻo. Hầu hết các loài hình thành bào tử
trong vòng 7 ngày. Màu và cấu trúc của khối conidi (dạng cột hoặc phóng xạ)
được quan sát bằng kính hiển vi. Do một số loài của chi Aspergillus có thể
gây bệnh ở người (đặc biệt là A. fumigatus), nên cần có biện pháp phòng tránh
hít phải bào tử [30], [36].
1.1.2. Chi Penicillium
Chi Penicillium thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp nấm bất toàn

trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo 1886.
Chi Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau: Khuẩn lạc thường
phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đôi khi có màu trắng, chủ yếu
được cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore. Conidiophore có thể mọc lên
từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các bó sợi bò lan trên mặt thạch, hoặc các bó
sợi thẳng đứng chặt hay lỏng. Conidiophore không màu, có thành nhẵn hay
ráp, có thể đơn độc hoặc kết thành bó, cấu tạo gồm một giá đỡ (stipe) và được
kết thúc bằng một vòng của các thể bình (phialide), đây là cấu trúc chổi một
vòng (monoverticillate), hoặc kết thúc bằng các chổi đa vòng, gồm các nhánh
và cuống thể bình - metulae (các nhánh gần đoạn cuối mang một vòng
phialide). Tất cả các tế bào giữa metulae và stipe được xem như là các nhánh
(hình 1.2).
Kiểu phân nhánh: có thể có 1 giai đoạn phân nhánh (biverticillate), 2
giai đoạn phân nhánh (terverticillate) hoặc 3 (quaterverticillate) tới nhiều hơn
các giai đoạn phân nhánh.

4


Hình 1.2. Cấu trúc sinh conidi dạng chổi của chi Penicillium
Thể bình thường có hình chai, với phần đáy hình trụ và phần cổ đặc
trưng, hoặc dạng mác với phần đáy dẹp nhiều hay ít, thon nhỏ tới một đỉnh
khá nhọn (acerose). Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài, khô, phân ly hay
dạng cột, có dạng hình cầu, elip, hình trụ hoặc hình thoi, không màu, hoặc hơi
xanh lá cây, thành nhẵn hoặc ráp. Một số loài tạo hạch nấm (sclerotium).
Nhiều loài của chi Penicillium là những tác nhân lây nhiễm phổ biến
trên nhiều cơ chất khác nhau và đồng thời tiềm ẩn khả năng sinh các độc tố.
Do vậy việc nhận diện chính xác là vấn đề quan trọng khi nghiên cứu khả
năng lây nhiễm do chi Penicillium. Việc nhận diện các loài của Penicillium đã
được Raper và Thom (1949) thực hiện, chủ yếu dựa trên các đặc điểm nuôi

cấy, nhưng các đặc tính này cũng đã được chứng minh là khá dễ thay đổi. Các
đặc tính hình thái thuần chủng có thể được dùng cho việc phân loại. Ngoài ra,
các đặc điểm như tốc độ phát triển, hoạt độ nước (water activity) ở các môi
trường và nhiệt độ khác nhau cũng giúp hỗ trợ cho việc xác định loài (Pitt,
1979). Việc sử dụng các dữ liệu về các chất chuyển hóa thứ cấp cũng cho thấy
có giá trị cho việc nhận diện (Frisvad 1981, 1985 ; Frisvad và Filtenbord,

5


1983 ; Lund & Frisvad, 1994…). Nhiều công trình mô tả chi tiết và các khóa
phân loại của chi Penicillium cũng đã được công bố (Pitt et al. 2009) [30].
Một số loài sinh các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của
chúng. Tuy nhiên, cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi có thể bị
stress, gây ảnh hưởng tới sức khỏe. May mắn là các loài có khả năng gây
bệnh ở người của chi nấm này ít hơn nhiều so với chi Aspergillus và chỉ giới
hạn ở loài P. marneffei [3], [30].
Nuôi cấy để nhận diện : Samson và Pitt (1985) đề xuất nên cấy các
chủng ở 3 điểm trên môi trường CYA (Czapek yeast Agar) và MEA (2%), ủ ở
25oC, trong môi trường tối hoặc sáng. Tuy nhiên, nuôi cấy trên môi trường
Czapek cũng cho kết quả hợp lý. Một điểm lưu ý rằng sự phát triển không
điển hình và các chất màu của các loài thuộc Penicillium trên các môi trường
CYA và Czapek có thể xuất hiện, thường là do thiếu các vết kim loại nặng,
đặc biệt là đồng. Khó khăn có thể được giải quyết khi bổ sung thêm dung dịch
đồng hoặc kẽm. Hầu hết các loài hình thành bào tử sau 5 đến 7 ngày. Một số
loài thuộc nhóm chổi 3 vòng (Terverticillate Penicillium), khi sử dụng môi
trường CREA (Creatine Sucrose Agar) cũng rất hiệu quả trong việc phân biệt
các loài có mối quan hệ rất thân thuộc. Các loài có chổi 3 vòng (P.
aurantiogriseum/ verrucosum complex) rất khó xác định khi chỉ dựa trên các
cấu trúc hình thái của chúng.

1.2. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dƣợc ở
ngoài nƣớc
Dược thảo thường bị nhiễm các loài nấm sinh độc tố có nguồn gốc từ
đất trồng trọt. Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều độc tố nấm trên các nguyên
liệu làm thuốc có nguồn gốc thực vật và các dược thảo truyền thống đã được
thông báo từ nhiều nước trên thế giới [15], [20], [34]. Các dữ liệu từ Ấn Độ
cho thấy các mycotoxin đã được phát hiện ở mức độ cao hơn so với hàm

6


lượng cho phép trên các thực vật làm thuốc thường gặp ở quốc gia Nam Á
này. Các nghiên cứu từ Thổ Nhĩ Kỳ cũng cho thấy các loại sản phẩm chế biến
từ quả vả khô (dried figs) đã bị nhiễm mycotoxin ở mức cao như aflatoxin,
ochratoxin A và fumonisin B1. Ngoài ra, đây cũng là khu vực có tỷ lệ nhiễm
độc tố ochratoxin A cao trên sản phẩm được điều chế từ rễ cây cam thảo. Với
các thuốc truyền thống của Trung Quốc cũng đã ghi nhận bị nhiễm aflatoxin
và ochratoxin A cao hơn mức cho phép [15].
Dược thảo đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền và
cũng là nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một tăng.
Các bài thuốc (được điều chế từ thảo dược) gia truyền được sử dụng để phòng
tránh, trị liệu, điều trị các rối loạn và nhiều bệnh khác nhau từ thời cổ xưa.
Tuy nhiên, dược thảo sử dụng chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng,
độ an toàn và tính hiệu quả. Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, bảo quản
và phân phối, các dược thảo có thể bị lây nhiễm nhiều loại nấm mốc khác
nhau, và có thể bị hư hỏng và nhiễm mycotoxin. Thực vật làm thuốc được sử
dụng ngày càng nhiều, trong khi thiếu các nghiên cứu cần thiết về cách sử
dụng, hiệu quả, độc tính và chất lượng của các sản phẩm tự nhiên này có thể
dẫn đến nguy cơ cho sức khỏe con người. Lượng mycotoxin đưa vào cơ thể
cũng có thể tăng lên cùng với việc gia tăng sử dụng dược thảo. Do đó, việc sử

dụng các dược thảo nhiễm mycotoxin có thể tạo ra các vấn đề bất lợi và rủi ro
nguy hiểm đến sức khỏe và tính mạng cộng đồng. Nhiều nước trên thế giới
như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ và các nước Trung
Đông cũng đã ghi nhận tình trạng nhiễm các mycotoxin trên các thực vật làm
thuốc và các dược thảo truyền thống [15], [20], [34].
Dược thảo được xác định là việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc
thực vật trong thực hành trị liệu, là một thực tế tồn tại từ ngàn xưa, trước khi
thuốc hiện đại phát triển, phổ biến và vẫn được sử dụng cho đến tận ngày nay.

7


Mặc dù thuốc kháng sinh đã được đưa vào sử dụng từ những năm 1940,
nhưng vẫn có tới 80% dân số tin dùng các cây thuốc bản địa trong điều trị
bệnh [20]. Do các dược thảo có nguồn gốc thực vật nên thường bị nhiễm, hư
hỏng bởi nấm trước thu hoạch, trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Trong
quá trình phát triển của nấm, nhiều mycotoxin được tạo thành, và là các chất
gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Sự gây hư hỏng cho dược thảo không
chỉ gây ra nhiều tác động bất lợi đến cộng đồng người sử dụng, mà còn làm
giảm hiệu quả và tiềm năng sử dụng của thuốc. Một số nhà nghiên cứu còn
nhận xét, nấm mốc và mycotoxin là một trong những nguyên nhân chủ yếu
gây tụt hậu nền công nghiệp dược thảo Ấn Độ (một nước có nền y học cổ
truyền lâu đời nhất trên thế giới với thảo dược là nguồn nguyên liệu chính)
[20].
Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của nấm. Một số chi nấm
thường có thể tạo ra các mycotoxin là Aspergillus, Penicillium và Fusarium.
Hiện nay, đã phát hiện được khoảng 400 mycotoxin, trong đó, các mycotoxin
phổ biến nhất là aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, deoxynivalenol,
zearalenone. Các mycotoxin này đã được thông báo về khả năng gây ung thư,
độc với hệ thần kinh, gây quái thai hoặc suy giảm miễn dịch. Nhiều thực

phẩm và thức ăn như ngô, lúa, gạo, đậu phộng có thể bị nhiễm các mycotoxin
vì chúng có thể được hình thành từ trước thu hoạch, thời gian thu hoạch và
làm khô và trong khi bảo quản [18]. Hầu hết cây thuốc và các bộ phận của
chúng như: lá, rễ, hạt đều có thể bị nhiễm các loại nấm khác nhau trong quá
trình bảo quản. Khi được bảo quản nhiều ngày, chúng trở nên nhạy cảm với
sự phát triển của nấm mốc và hình thành mycotoxin. Các yếu tố ảnh hưởng
đến khả năng nhiễm nấm là điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm,
phương thức thu hoạch, làm khô và bảo quản. Ở các điều kiện khác nhau thì

8


tình trạng nhiễm nấm và hình thành mycotoxin cũng khác nhau. Khả năng
nhiễm nấm tăng lên ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [15], [20].
Một nghiên cứu của Matei và cộng sự [29] trên 10 mẫu chè thuốc được
bán ở các hiệu thuộc hạt Cluj của Rumani. Kết quả cho thấy, 4 mẫu có mức
độ nhiễm nấm cao gồm: chè quả tầm xuân (rosehip tea) với 7.818 khuẩn lạc
(CFU)/gam, chè húng quế ngọt (sweet basil tea) phát hiện được 118.636
CFU/g, chè đen (black tea) bị nhiễm ở mức 192.272 CFU/g, và chè common
nettle (common nettle tea) có mức nhiễm 204.545 CFU/g. Trong đó, các loài
của chi Fusarium nhiễm vượt quá nhiều so với qui định (100 CFU/g). Kết quả
phân tích mycotoxin cho thấy: 7/10 mẫu có lượng aflatoxin toàn phần vượt
quá mức qui định cho phép (10 ppb). Trong số 7 mẫu này, có 3 mẫu vượt quá
ngưỡng 100 ppb, mẫu nhiễm cao nhất là 437,17 ppb và trung bình của 7 mẫu
bị nhiễm là 109,21 ppb.
Nghiên cứu 36 mẫu chè thuốc (Pu-erh tea), có xuất xứ từ tỉnh Yunnan,
tây nam Trung Quốc cho thấy: Nấm mốc đã phân lập được ở tất cả các mẫu ở
nồng độ 1,0 x 101 - 2,6 x 106 CFU/g. Trong đó, 36 loài thuộc 19 chi nấm đã
được nhận diện. Các loài phổ biến nhất là Aspergillus acidus và A. fumigatus,
tiếp sau là nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes và các loài thuộc chi Penicillium.

Các độc tố aflatoxin và fumonisin không phát hiện thấy trong các mẫu nghiên
cứu. Độc tố ochratoxin A đã được phát hiện trong 4/36 (11,1%) mẫu chè
nghiên cứu [25].
Nghiên cứu chất lượng thuốc về tiêu chuẩn vi sinh trên 303 mẫu của 3
nhóm dược thảo và gia vị gồm: 11 loại thuộc nhóm sử dụng lá, 6 loại sử dụng
quả và 3 loại sử dụng hoa. Kết quả xác định và đếm vi sinh vật bằng các môi
trường nuôi cấy chuẩn cho thấy: Bên cạnh việc bị nhiễm ở tỷ lệ cao quá qui
định cho phép về vi khuẩn (coliform, tụ cầu vàng, và Salmonella), cả nấm
men và nấm sợi đã phát hiện thấy trong tất cả các mẫu nghiên cứu. Trong đó,

9


Aspergillus và Penicillium là các chi nấm có số loài phân lập được nhiều hơn
so với các chi Alternaria, Absidia, Mucor, Rhizoctonia và Cladosporium. Các
mẫu phân tích không phát hiện thấy độc tố aflatoxin (B1, B2, G1 và G2). Tuy
nhiên, các tác giả đã khuyến cáo: các loại dược thảo và gia vị thực vật là
những sản phẩm có rủi ro cao, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện
pháp chống lây nhiễm [19].
Mahajan và cộng sự [28] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên 15
mẫu dược liệu có nguồn gốc từ 3 cây: Saraca indica Linn. (5 mẫu),
Terminalia arjuna (Roxb) Wight & Arn. (5 mẫu), và Hemidesmus indicus (L.)
R. Br. (5 mẫu) được thu thập từ các chợ thuộc vùng Agra và lân cận, Ấn Độ,
giai đoạn 2013-2014. Kết quả cho thấy: 93% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm
các loài nấm khác nhau, với 13 loài được phân lập chủ yếu thuộc 5 chi
Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Rhizopus và Syncephalastrum. Trong đó,
Aspergillus (71,95%) là chi nấm phổ biến nhất, tiếp sau là Penicillium
(15,44%), Rhizopus (9,51%), Alternaria (1,67%), và Syncephalastrum
(1,41%). Hầu hết các loài phân lập được là của các chi Aspergillus,
Penicillium và Alternaria. Các loài này đều có khả năng sinh độc tố như

aflatoxin, ochratoxin, citrinin, altertoxin và acid tennuazonic. Sự có mặt của
nhiều loại nấm bảo quản cho thấy nấm mốc có khả năng lây nhiễm trên thảo
dược thô (chưa chế biến) trong quá trình thu hoạch, sau thu hoạch, nhất là
trong quá trình làm khô, bảo quản, vận chuyển và chế biến. Trên cơ sở kết
quả của nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận rằng: Sự lây nhiễm nấm trên
các nguyên liệu thực vật làm thuốc là đáng báo động, và các nguyên liệu này
cần phải được nghiên cứu kỹ trước khi được chuyển đến các nhà máy sản xuất
thuốc và cộng đồng sử dụng.
Để đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế
Cinamomum zeylanicum Blume), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các

10


hiệu bán lẻ ở khu vực miền đông của Arập Xeut. Tổng số 1.126 chủng nấm
thuộc 8 loài của 2 chi Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện
từ 50 mẫu nghiên cứu. Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ,
thuộc các loài Aspergillus terreus, A. glaucus, A. flavus, A. fumigatus, A.
clavatus, A. niger, Penicillium restrectum và Penicillium sp.. Phân tích
mycotoxin trên các mẫu vỏ cho thấy: các aflatoxin B1, B2 và G1 được phát
hiện ở nồng độ thấp (không vượt quá 4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên
cứu, và 17 mẫu không phát hiện thấy các aflatoxin này [14].
Khati [26] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu
thảo dược thô của 10 cây thuốc, được bảo quản ở các địa điểm khác nhau,
thuộc bang Haridwar, Ấn Độ. Kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đã bị nhiễm
một hoặc nhiều chi nấm gồm: Alternaria, Aspergillus, Fusarium,
Chaetomium, Cladosporium, Curvularia, Penicillium, Mucor, Rhizopus,
Rhizoctonia và Verticillium. Trong số các chủng nấm phân lập được, loài
Aspergillus flavus xuất hiện với tần số cao nhất (23,6%), tiếp sau là loài A.
niger (19,2%). Kết quả phân tích aflatoxin cho thấy: 2/10 mẫu đã bị nhiễm

aflatoxin B1. Từ kết quả phân tích nấm mốc và độc tố cho thấy: Các thảo
dược có thể tiềm ẩn rủi ro đối với sức khỏe của người tiêu dùng. Đồng thời
cho thấy sự cần thiết phải kiểm tra chặt chẽ các thảo dược trước khi cho phép
đưa vào sử dụng trong cộng đồng.
Khảo sát chất lượng của 36 mẫu hạt tiêu (được làm khô bằng ánh nắng
mặt trời và bảo quản ở tỉnh Razavi Khorasan, Iran, trong khoảng thời gian
cuối hè đầu mùa thu) về tiêu chuẩn vi sinh và mycotoxin bằng các phương
pháp phân tích và xác định chuẩn cho thấy: Bên cạnh tiêu chuẩn vi khuẩn, tất
cả các mẫu nghiên cứu đã bị nhiễm nấm dao động trong khoảng 2,4 x 10 3 –
4,6 x 106 CFU/g. Trong đó, các chi nấm phân lập được nhiều nhất là
Aspergillus, Penicillium và Rhizopus. Đánh giá kết quả phân tích vi sinh thu

11


được cho thấy: Các mẫu hạt tiêu đã bị nhiễm vi sinh ở mức cao, chỉ có 2 mẫu
(6%) là đạt tiêu chuẩn qui định của EU (2004/24/EC). Về kết quả phân tích
độc tố: 69% và 17% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm lần lượt aflatoxin toàn
phần và ochratoxin A, có thể gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Kết
quả của nghiên cứu này là một cảnh báo về tiêu chuẩn vi sinh trên nguồn
nguyên liệu thảo dược và gia vị sau thu hoạch [32].
Nghiên cứu hệ vi nấm và mycotoxin trên 25 mẫu quả thô (chưa chế
biến) bảo quản sau khi được phơi khô bằng ánh nắng mặt trời và 25 mẫu dạng
bột (đã qua chế biến) từ 3 cây thuốc Emblica offinalis, Terminalia bellirica và
Terminilia chebula, được thu thập từ các chợ của thành phố Gwalor, Ấn Độ.
Kết quả thu được cho thấy: Khoảng 88% các mẫu quả và bột thảo dược bị
nhiễm nấm với 1.199 chủng phân lập được thuộc các chi Aspergillus,
Penicillium, Helminthosporium, Rhizopus, Syncephalastrum, Alternaria, và
Curvularia. Trong đó, 11 loài thuộc 5 chi được phân lập từ các mẫu quả, và 9
loài thuộc 5 chi được phân lập từ các mẫu dạng bột. Khoảng 25% các mẫu

quả và 12,5% các mẫu bột đã bị nhiễm các độc tố như aflatoxin, citrinin, và
sterigmatocystin. Sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố và mycotoxin, có thể
biến các thảo dược thô cũng như dạng bột trở nên nguy hại cho sức khỏe
người tiêu dùng. Do vậy, trước khi sử dụng, các dạng thảo dược này cần được
kiểm soát chất lượng chặt chẽ và chống lây nhiễm [22].
Bokhari và cộng sự [17] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố
fumonisin trên 47 mẫu của 15 loại chè thuốc được thu thập từ các siêu thị và
các phố chợ ở Jeddah (Arập Xêut) kết quả cho thấy: Hệ vi nấm khá phong
phú với 25 loài thuộc 13 chi đã phân lập được từ các mẫu nghiên cứu. Trong
số đó, Aspergillus, Penicillium, và Fusarium là các chi có khả năng sinh nhiều
độc tố và phân lập được nhiều nhất. Kết quả phân tích fumonisin bằng HPLC
cho thấy: lượng độc đố phát hiện được dao động trong khoảng 0-260 µg/kg.

12


Như vậy, sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố đã đưa đến rủi ro nhiễm
mycotoxin tiềm tàng. Trong khi mức độ sử dụng nguồn dược thảo trên thế
giới ngày càng tăng, cho thấy sự cần thiết phải có các qui định về chỉ tiêu nấm
mốc và mycotoxin trong các loại thảo dược thô để giảm rủi ro về sức khỏe
của người tiêu dùng.
1.3. Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dƣợc ở
trong nƣớc
Trong nước, trong khoảng 10-15 năm trở lại đây các công trình nghiên
cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược không nhiều.
Một số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố trên một
số vị thuốc (được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược) bằng phương pháp
đặt trực tiếp trên môi trường PDA [1], [3], [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11],
[13]. Trong các công trình này, phương pháp phân loại chủ yếu dựa vào đặc
điểm hình thái vi học trên môi trường chuẩn Czapek Dox. Bên cạnh phương

pháp hình thái, phương pháp sinh hóa (sử dụng môi trường AFPA) để nhận
diện 2 loài A. flavus và A.parasiticus cũng được áp dụng. Kết quả phân lập và
phân loại cho thấy, các chủng nấm phân lập được chủ yếu thuộc chi
Aspergillus, tiếp sau là chi Penicillium và nhóm nấm tiếp hợp với các chi
Rhizopus, Absidia và Mucor. Trong đó, các loài có khả năng sinh độc tố như
A. flavus, A. niger thường chiếm tỷ lệ cao [3], [8], [9]. Kết quả phân tích độc
tố cho thấy, một số vị thuốc dạng quả, hạt (hạt sen, ý dĩ) bị nhiễm aflatoxin
quá mức cho phép của ngành y tế [3].

13


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
10 mẫu kha tử và 10 mẫu nhục đậu khấu được thu thập từ các hiệu thuốc
đông dược thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm), được
chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và
phân loại nấm.
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc
Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ:
200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC) 5,6 ±0,2.
Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ).
Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5;
Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25 oC): 5,6
± 0,2.
Môi trường xác định 2 loài A. flavus và A. parasiticus: Aspergillus
Differentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l):
Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran:
0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 6,3 ± 0,2.

Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l):
Đường kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5;
FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 7,3 ± 0,2.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật
số Canon (Nhật Bản).
Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức).
Tủ ấm Memmert (Đức)
Tủ sấy SEL LAB (Đức)

14


Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản).
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu của 2 vị thuốc nghiên cứu,
đặt lên các đĩa Petri chứa môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được
chuẩn bị và ủ ở 27ºC trong 5-7 ngày.
 Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu.
 Nuôi cấy các chủng nấm phân lập được trên môi trường Czapek Dox Agar
ở 25ºC trong 5 ngày.
 Nuôi cấy xác định các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên
môi trường ADM.
 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, vi học, sinh hóa của các chủng nấm và xác
định chi hoặc loài.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu
Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất
khối lượng do làm khô" (Phụ lục 9.6, DĐVN IV). Cách tiến hành: Dược liệu
được nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm. Cân một

lượng mẫu thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 105C trong
vòng 5 giờ với kha tử, và đến khối lượng không đổi với nhục đậu khấu. Sau
khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi cân ngay (m’).
Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:
Hàm ẩm (%)

m m'
100%
m

2.3.2. Phương pháp phân lập nấm mốc
Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở
phương pháp của Samson và cộng sự (phương pháp đặt trực tiếp trên môi
trường PDA hoặc DGM) [33]: Các mẫu dược liệu (mỗi mẫu 40g) được khử

15


trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid 1% mới pha trong 2
phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng. Để ráo nước, cắt thành các
mảnh nhỏ kích thước 1-1,5 cm và đặt nhanh vào các đĩa Petri đã có môi
trường PDA (hoặc DGM) bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7 ngày tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên
các mẫu dược liệu nghiên cứu.
2.3.3. Phương pháp phân loại nấm mốc
 Phân loại các chi nấm theo khóa phân loại của Barnet và Hunter [16].
 Phân loại các chủng nấm đến cấp loài thuộc các chi khác (Aspergillus,
Penicillium,…) dựa trên mô tả đặc điểm khuẩn lạc, vi học các loài của
Samson và cộng sự 1995 [33], Raper và Fennell 1965 [31], Pitt và Hocking
2009 [30]. Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự so sánh đặc điểm khuẩn

lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và sau của khuẩn lạc, các chất
tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (chủ yếu là cấu trúc sinh conidi,
kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi,…) của các chủng khi
được nuôi cấy trên môi trường chuẩn (Czapek Dox), trong cùng điều kiện
(nhiệt độ, thời gian…).
 Xác định 2 loài A. flavus, A. parasiticus theo phương pháp sinh hóa của
Pitt và Hocking [30]. Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A.
flavus, A. parasiticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C
sau 42-48 giờ sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái (mặt sau) khuẩn lạc.
2.3.4. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm.
Mức độ nhiễm các loài (hoặc chi) được tính theo 2 chỉ số:
 Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài (hoặc chi) trên các mẫu
nghiên cứu: FQ (isolation frequency, %) = số mẫu có mặt loài (hoặc chi)/
tổng số mẫu nghiên cứu x 100% [24]

16


 Chỉ số có nhiều hay mật độ loài (hoặc chi): RD (relative fungal
density, %) = số chủng có mặt của loài (hoặc chi)/ tổng số chủng nấm phân
lập được x 100% [24]

17