TRƯƠNG MINH HUẤN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH các THUỐC lợi TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG dược BẰNG LC MSMS và TLC LUẬN văn tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG MINH HUẤN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC LỢI TIỂU TRỘN TRÁI
PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG LC-MS/MS VÀ TLC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG MINH HUẤN
Mã sinh viên: 1401259

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC LỢI TIỂU TRỘN TRÁI
PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG LCMS/MS VÀ TLC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn :
1. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh.
2. DS. Trịnh Thị Hoài Ân.
Nơi thực hiện :
1. Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia –

Đại học Dược Hà Nội.
2. Viện Khoa học hình sự - Bộ Công An.

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài khóa luận một cách hoàn chỉnh, sự hướng dẫn nhiệt tình
của quý Thầy Cô, sự động viên ủng hộ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt
thời gian học tập nghiên cứu là nguồn động lực lớn lao và quý giá nhất đối với tôi.
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,
DS. Trần Thị Hoài Ân người đã hướng dẫn và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trình
nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong quá
trình tạo nền mẫu của nghiên cứu.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ
Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội và Trung tâm giám định ma túy
– Viện Khoa học hình sự – Bộ Công an đã không ngừng hỗ trợ về thiết bị và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận của
mình.
Tôi xin gửi lời chân thành cám ơn đến Ban Giám hiệu, Bộ môn Hóa Phân tích – Độc
chất - Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và làm đề
tài khóa luận của mình.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích
lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, 11 tháng 6 năm 2019

Trương Minh Huấn

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................. 3
1.1 Tình hình trộn trái phép thuốc lợi tiểu trong chế phẩm đông dược. ..................... 3
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .................................................................. 3
1.2.1. Tính chất vật lý, hóa học ............................................................................ 3
1.2.2. Tính chất dược lý ....................................................................................... 4
1.3. Các nghiên cứu xác định dược chất lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm động
dược......................................................................................................................... 5
1.4. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu ........................................................... 7
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .............................................................................. 7
1.4.2. Sắc ký lỏng khối phổ (LCMS) .................................................................... 8

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.......................................................................................................... 14
2.1

. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ....................................... 14

2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 14
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................... 14
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 15
2.2.1. Thu thập mẫu ........................................................................................... 15
2.2.2. Quy trình xử lý mẫu ................................................................................ 15

2.2.3. Xây dựng phương pháp phân tích ............................................................. 16
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng ....................................... 16
2.2.5. Ứng dụng phân tích các mẫu chế phẩm đông dược đã thu thập trên thị trường
........................................................................................................................... 17
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM - KẾT QUẢ ................................ 18
3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS .......................................... 18
3.1.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS ......................................................... 18
3.1.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS ....................................................... 23
3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp TLC...................................................... 31
3.2.1. Xây dựng phương pháp TLC .................................................................... 31
3.2.2. Thẩm định phương pháp TLC .................................................................. 34
3.3. Ứng dụng phân tích trên các mẫu thực thu nhận thị trường ............................. 37
3.3.1. Kết quả phân tích trên phương pháp TLC ................................................. 37
3.3.2. Kết quả phân tích trên phương pháp LC-MS/MS ...................................... 38

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................. 41
4.1. Tạo nền mẫu ................................................................................................... 41
4.2. Xây dựng phương pháp phân tích .................................................................... 41
4.2.1. Lựa chọn phương pháp phân tích.............................................................. 41
4.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích ............................................................. 42
4.2.3. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu................................................................... 43
4.3. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................................. 43
4.4 Ứng dụng ......................................................................................................... 44

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ........................................................... 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng anh hoặc tên khoa học

ACN

Acetonitril

AML

Amlodipin besilat

AOAC

APCI

APPI

Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hóa phân
Chemists

tích chính thống

Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học ở áp suất

Ionization
Atmospheric

Atenolol

ESI

Electrospray Ionization

Fu

Furosemid

HCT

Hydroclorothiazid

HPTLC

LC-MS/MS

khí quyển
Pressure

Photonization

ATE

HPLC

Tiếng việt

High

Performance

Ion hóa bằng photon tại
áp suất khí quyển
Ion hóa phun điện tử

Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High Performance Thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu
chromatography

năng cao

Liquid chromatography – Mass Sắc ký lỏng hai lần khối
Spectrometry/Mass Spectrometry phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng
Khối lượng/điện tích

m/z
MeOH

Methanol

MRM

Multiple Reaction Monitoring

MRM

Multiple Reaction Monitoring

MS

Mass Spectrometry

NIF

Nifedipin

NSAID

Khối phổ

Non steroidal anti-inflammatory Thuốc chống viêm không
drug

steroid


RAAS

Renin-Angiotensin-Aldosterone

SCAN

renin-angiotensin-

aldosterone
Quét toàn phổ

SIM

Selected Ion Monitoring

SRM

Selected Reaction Monitoring

TLC

Thin layer chromatography

UHPLC

Hệ

Ultra High Performance Liquid
Chromatography

VAL

Valsartan

WHO

Word health organization

Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích một số thuốc lợi tiểu trộn trái phép trong đông
dược. ........................................................................................................................... 6
Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu ........................................................ 14
Bảng 3.1 Tối ưu điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu ..................................... 18
Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích .................................................. 19
Bảng 3.3 Khảo sát chế độ gradient ............................................................................. 20
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) ..................... 23

Bảng 3.5 Các nồng độ xây dựng khoảng tuyến tính ................................................... 26
Bảng 3.6 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu
.................................................................................................................................. 27
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại trong ngày của phương pháp (n=7) . 28
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại khác ngày của phương pháp (n=7) . 28
Bảng 3.9 Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu ......................................................... 30
Bảng 3.10 Khảo sát hệ Ethylacetat – cloroform – acid acetic: .................................... 32
Bảng 3.11 Khảo sát hệ dung môi Ethylacetat : methanol : Amoniac .......................... 33
Bảng 3.12 Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực ....................................................... 39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Furosemid ................................................................ 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo Hyrochlorothiazid ............................................................ 4
Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................... 9
Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của khối phổ kế .................................................. 10
Hình 1.5 Sơ đồ tạo ion ESI. ....................................................................................... 11
Hình 1.6 Sơ đồ bộ phân tích tứ cực ............................................................................ 12
Hình 1.7 Sơ đồ bộ phân tứ cực chập ba ...................................................................... 12
Hình 3.1 Phổ khối của Hydroclorothiazid .................................................................. 19
Hình 3.2 Phổ khối của Furosemid .............................................................................. 19
Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký ...................................................................... 21
Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát các chất phân tích ở điều kiện phân tích ........................ 22
Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nang cứng.. 25
Hình 3.6 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD và LOQ trong nền mẫu viên hoàn
.................................................................................................................................. 30
Hình 3.7 Kết quả khảo sát hệ Ethylacetat – cloroform – acid acetic: .......................... 32
Hình 3.8 Kết quả khảo sát hệ dung môi Ethylacetat : methanol :amoniac ................... 33
Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát một số chất chuẩn .......................................................... 35
Hình 3.10 Độ đặc hiệu chạy TLC............................................................................... 36

Hình 3.11 Kết quả LOD chạy TLC ............................................................................ 37
Hình 3.12 Kết quả chạy mẫu thực M1 – M7 .............................................................. 38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân ở các nước đang phát triển sử
dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc sức khỏe. Ở Châu Âu, doanh
thu đem lại từ các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược lên đến hơn 3,7 tỷ Euro hằng
năm [19]. Chế phẩm đông dược có nguồn gốc từ thực vật, động vật và khoáng vật. Được
coi là có nguồn gốc tự nhiên và an toàn nên loại chế phẩm này thường được nhiều người
ưa chuộng. Tuy nhiên chế phẩm đông dược thường được chỉ định điều trị kéo dài với số
lượng lớn. Nhằm hấp dẫn khách hàng, một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư
nhân đã trộn không công bố vào chế phẩm đông dược một số loại thuốc tân dược để cải
thiện tác dụng, rút ngắn thời gian điều trị và để trục lợi.
Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn trái
phép trong các chế phẩm đông dược tập trung nhiều ở các nhóm thuốc: glucocorticoid,
NSAIDs, thuốc giảm hạ glucose máu, thuốc ức chế PDE -5,…[5], [10], [11], [9] nhưng
các nghiên cứu về nhóm thuốc lợi tiểu trong các chế phẩm đông dược thì chưa nhiều.
Các chế phẩm đông dược sử dụng trong điều trị phù, tăng huyết áp kèm theo phù, các
bệnh lý liên quan đến thận như bí tiểu, và các chế phẩm giảm cân đang được nhân dân
ta sử dụng rộng rãi. Vì vậy cần phải kiểm soát chất lượng của các sản phẩm này một
cách chặt chẽ.
Các phương pháp phân tích dùng trong phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược được sử dụng chủ yếu là sắc kí lớp mỏng (TLC) [9], sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) [8], [6] và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [10],
[6]. Tuy nhiên, do các chế phẩm này có nền mẫu phức tạp nên có thể dẫn tới hiện tượng
âm tình giả hoặc dương tính giả. Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần
khối phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại ở Việt Nam, đang từng
bước được ứng dụng rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm thuốc. Tích hợp khả năng
phân tách chất của sắc ký lỏng (LC) và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ

(MS), phương pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền
mẫu phức tạp như chế phẩm đông dược. Đây được xem là phương pháp quy chiếu,
thường dùng so sánh, đối chiếu với các phương pháp khác trong việc phát hiện thuốc
tân dược trộn lẫn trong chế phẩm đông dược [19].
1


TLC là phương pháp phân tích nhiều mẫu cùng một lúc, quy trình xử lý mẫu đơn
giản, thường dùng trong giai đoạn sàng lọc. Việc kết hợp giữa hai phương pháp TLC và
LC-MS/MS đem lại nhiều ưu điểm vượt trội về việc xác định nhanh, đơn giản, chính
xác, hiệu quả các thuốc trộn trái phép trong chế phẩm đông dược.
Vì vậy, với mục đích góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn
lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng
phương pháp xác định các thuốc lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
bằng LC-MS/MS và TLC”.
Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 2 thuốc lợi tiểu Furosemid và
Hydroclorothiazid trộn trái phép trong chế phẩm động dược bằng LC–MS/MS và TLC.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định đồng thời hai thuốc lợi tiểu
Furosemid và Hydroclorothiazid trong một số chế phẩm đông dược lưu hành trên thị
trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tình hình trộn trái phép thuốc lợi tiểu trong chế phẩm đông dược.
Lợi dụng nhu cầu sử dụng tăng cao về các thuốc đông dược nên tình trạng chế
phẩm đông dược bị trộn trái phép tân dược đang diễn ra phổ biến, gây ra nhiều tác hại
nguy hiểm cho sức khỏe người dùng [30]. Điển hình các nhóm thuốc tân dược hay được

trộn vào là nhóm thuốc giảm glucose máu [17]; thuốc glucocorticoid [28], [29]; thuốc
giảm đau chống viêm không steroid [14]; thuốc ức chế phosphodiesterase-5 [25].
Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra nhóm thuốc lợi tiểu cũng bị trộn trái phép trong
các chế phẩm đông dược. Ở Brazil, trong quá trình phân tích 34 mẫu sản phẩm có nguồn
gốc thảo dược Ana Paula Lancanova Moreira và các cộng sự đã phát hiện 3 mẫu chứa
thuốc lợi tiểu hydroclorothiazid và 2 mẫu có furosemid [12]. Ở Trung Quốc, nghiên cứu
của Lu Y.L và cộng sự trên 35 thực phẩm bổ sung và các thuốc cổ truyển thì có 9 mẫu
có hydroclorothiazid [27].
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.2.1. Tính chất vật lý, hóa học
1.2.1.1. Furosemid

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Furosemid
− Công thức phân tử: C12H11ClN2O5S.
− Khối lượng phân tử: 330,75.
− Tên khoa học: Acid 4-chloro-2-[(furan-2-ylmethyl)amino]-5-sulphamoylbenzoic [31].
− Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hoặc hầu như trắng, không mùi, không vị [2].
− Độ tan: không tan trong nước; tan trong aceton, methanol, hơi tan trong ethanol và rất
tan trong dimethyl formamid [2].
3


− Đặc tính hấp thụ UV: dung dịch furosemid trong NaOH 0,1M có 3 cực đại hấp thụ ở
bước sóng 228nm, 270nm, và 333nm [7].
1.2.1.2. Hydroclorothiazid

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Hyrochlorothiazid
− Công thức phân tử: C7H8ClN3O4S2.
− Khối lượng phân tử: 297,74.
− Tên

khoa

học:

6-chloro-1,1-dioxo-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazine-7-

sulfonamid [31].
− Cảm quan: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng, không mùi [2].
− Độ tan: Ít tan trong nước, dễ tan trong trong dung dịch kiềm, dimethylformamid [2].
− Đặc tính hấp thụ UV: Dung dịch HCT trong NaOH 0,01M có cực đại hấp thụ ở các
bước sóng là 273nm và 323nm [7].

1.2.2. Tính chất dược lý
Thuốc lợi tiếu có tác dụng làm giảm thể tích dịch lỏng ngoài tế bào nên được
dùng chủ yếu để phòng và làm giảm phù do suy tim sung huyết, phù phổi cấp, phù ở
phụ nữ mang thai, xơ gan cổ trướng. Ngoài ra, thuốc lợi tiểu còn được dùng trong điều
trị tăng huyết áp, suy thận cấp hoặc mạn, hội chứng thận hư, chứng tăng calci máu [4].
1.2.2.1. Furosemid
− Cơ chế tác dụng: furosemid là thuốc lợi tiểu dẫn chất sulfonamid thuộc nhóm tác
dụng mạnh, nhanh, phụ thuộc liều lượng. Thuốc tác dụng ở nhánh lên của quai Henle.
4


Thuốc ức chế hệ thống đồng vận chuyển Na+- K+- 2Cl – làm tăng thải trừ những chất
điện giải kèm bài xuất nước [3].
− Chỉ định: điều trị phù trong suy tim sung huyết, bệnh thận và xơ gan; điều trị trăng
huyết áp đặc biệt khi do suy tim sung huyết hoặc do suy thận; điều trị tăng calci huyết
[3].
− Tác dụng không mong muốn [3]:

• Tuần hoàn: giảm thế tích máu trong trường hợp điều trị liều cao, hạ huyết áp tư thế
đứng
• Chuyển hóa: mất cân bằng nước và điện giải bao gồm giảm kali huyết, giảm natri
huyết, giảm magnesi huyết, giảm calci huyết, nhiễm kiềm giảm clor huyết.
− Liều lượng [3]: 20 – 80 mg/ 1 lần/ ngày.
1.2.2.2. Hydroclorothiazid
− Cơ chế tác dụng: hydroclorothiazid và các thuốc lợi tiểu thiazid làm tăng bài tiết natri
clorid và kéo theo nước do cơ chế ức chế tái hấp thu ion natri và clorid ở ống lượn
xa. Các thuốc lợi tiểu thiazid cũng làm giảm hoạt tính carbonic anhydrase nên làm
tăng bài tiết bicarbonat. Các thiazid có tác dụng lợi tiểu vừa phải [3].
− Chỉ định: phù do suy tim và các nguyên nhân khác; tăng huyết áp [3].
− Tác dụng không mong muốn [3]:
• Chuyển hóa: giảm kali hyết, tăng acid uric huyết, tăng glucose huyết, tăng lipid huyết
• Tuần hoàn: hạ huyết áp tư thế đứng.
• Tiêu hóa: buồn nôn, nôn, chán ăn, táo bón, ỉa chảy, co thắt ruột.
− Liều lượng [3]: 12,5mg/1 lần x 2 lần/ngày.
1.3. Các nghiên cứu xác định dược chất lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm
động dược
Có nhiều nghiên cứu đã xây dựng phương pháp để phát hiện và xác định các
thuốc lợi tiểu trong các phẩm đông dược bằng nhiều phương pháp khác nhau.

5


Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích một số thuốc lợi tiểu trộn trái phép trong đông
dược.
STT Đối tượng

Phương pháp phân Kết quả phân tích

TLTK

tích
1

Phân tích 18 dược − Phương pháp sắc kí − Khoảng

tuyến

chất được sử dụng

khố phổ ion hóa

trong điều trị tăng

điện tử (LC/ESI- − LOD: 6,5

huyết áp gồm thuốc

MS).

tính

[27]

0,03 đến 21,52 mg/kg.
–

86,0

µg/kg

lợi tiểu, thuốc chẹn − Cột XtimateTM C18 − Độ thu hồi: 71 –
kênh calci và thuốc − Pha động: MeOH: 109%.
ức chế men chuyển
được
thực

trộn

trong

phẩm chức

ACN

và

đệm − 9/35 mẫu thực phát
amoni
formate hiện
có
20mM (pH 3,2)
hydroclorothiazid.

năng và các loại − Dung môi chiết
thuốc cổ truyền mẫu: MeOH – H2O
Trung Quốc.
2

(1:1)

Phân tích đồng thời − Phương

pháp: − LOD: 0,02 – 2,51 µg/L. [12]

13 thuốc nhóm hạ

UHPLC-ESI-

huyết áp (β-block,

MS/MS

− Độ thu hồi: 80,56 –
111,28%.

angiotensin II, ức − Pha

động: − Hydroclorothiazid và

chế men chuyển

Methanol:

angiotensin và lợi

acetic 0.1%

acid

hiện trong 5/34 mẫu

− Cột C18

tiểu)

furosemid được phát
được phân tích

− Chiết mẫu trong
MeOH
3

Nghiên

cứu

quy − Phương

trình xác định đồng
thời

dexamethason
piroxicam

− LOQ: 0,2 – 0,4 µg/ml

HPLC

sibutramin, − Cột:

furosemid,

pháp: − LOD: 0,05 – 0,1 µg/ml
Symmetry − Độ thu hồi: 98,4% -

Waters (250 mm x
và
trong

102,7%

4,6mm; 5 pm) và − Chưa
tiền cột C l 8.
6

phát

hiện

furosemid trong 20

[8]


thực

phẩm chức − Pha

năng bằng kỹ thuật
HPLC.

động:

mẫu

thu

thập

thị

trường

methanol,
amoni acetat 50mM
-

Chiết mẫu bằng
MeOH

1.4. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng TLC
1.4.1.1. Nguyên tắc
Phương pháp TLC bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được phủ trên
một mặt phẳng trơn, pha động là chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi phổi hợp với
nhau, pha động chuyển động qua pha tĩnh dưới tác động của lực mao dẫn.
Các chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc theo bản chất của
chúng, được tách riêng ở các vị trí khác nhau của bản mỏng. Sự tách các chất khác nhau

dự trên tính chất phân cực của các thành phần trong dung dịch phân tích. Các hạt trong
pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử,… hoặc phối hợp nhiều cơ chế [1].
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf . Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ khoảng cách di chuyển của chất phân tích và
khoảng di chuyển của pha động [1]:

Rf = dR/dM

Trong đó:

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm).
Rf: có giá trị dao dộng giữa 0 và 1.

7


1.4.1.2. Pha tĩnh
Pha tĩnh TLC là các hạt có kích thước 10 – 30 µm được rải đều và kết dính thành
lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng có sẵn trên
thị trường khác nhau thường 5÷20 cm, nhiều khi có đưa thêm các chất phát huỳnh quang
không tan vào pha tĩnh để phát hiện chất phân tích. Chất hấp phụ thường dùng là silicagel
[1].
1.4.1.3. Pha động
Pha động cho TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường sức rửa
giải, thường kết hợp 2 hoặc nhiều dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào sự phân bố
giữa hai pha. Tùy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm.
Sau đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:
− Dung môi cần có độ tinh khiết cao.

− Cần điểu chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng từ 0,2 đến
0,8 đạt độ phân giải cực trị.
− Chất phân tích dạng ion hay phân cực cần được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực
như hỗn hợp n – butanol – nước. Thêm một lượng nhỏ acid acetic hoặc amoniac vào
nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc aicd tương ứng.
− Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động
sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và giá trị Rf của chúng. Nếu thêm
một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không phân cực như
methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf.
1.4.2. Sắc ký lỏng khối phổ (LCMS)
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các
chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng phân
tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS).
Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng
rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam, thời gian
phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau
mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được [1].

8


1.4.2.1. Hệ thống HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa
các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đế hệ số phân bố của chúng giữa
hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động.
Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha
động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân
tích với thời gian hợp lý [1].
Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [32]:

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC

1. Hệ thống cấp pha động
2. Bơm cao áp
3. Bộ phận tiêm mẫu
4. Cột sắc ký
5. Detector
6. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ
thống
1.4.2.2. Khối phổ
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật đô trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion
(m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được
biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lương nguyên tử bằng 1/12

9


khối lượng của carbon 12C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên
tử hydro).
Nguyên tắc: Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách
riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình diễn ra trong hệ
thiết bị chân không. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một vạch
(pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp
thông tin định tính và đinh lượng các chất [1].
Các bộ phần chính của khối phổ kế:

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của khối phổ kế
− Bộ phận nạp mẫu ( Inlet system): đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn
cần chuyển sang dạng hơi. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu
ra của cột sắc ký.

− Nguồn ion hóa (ion source): Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí
hoặc hơi.
Có ba kĩ thuật ion hóa thường dùng trong LC-MS:
• Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI)
• Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization –
APCI),
• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization –
APPI).
10


Trong số các kĩ thuật trên thì ESI là phổ biến nhất. Kỹ thuật này tạo ra ion từ phân
tử trong chất lỏng. Dung dịch ở trong một mao quản thép không gỉ (đường kính từ 75 –
150 µm) với tốc độ dòng từ 1 µL/phút đến 1 mL/phút. Người ta đặt một điện trường
giữa đầu mao quản và một điện cực (điện thế có thể lên đến 4kV). Đồng thời, các dung
dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí (Nitơ). Kết quả là tạo
ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho các
chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng
tới 100000 Da [1], [15].

Hình 1.5 Sơ đồ tạo ion ESI.
− Bộ phận phân tích khối: Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được gia tốc và tách
riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát
hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap), bộ
phân tích thời gian bay (time-of-flight analyzer).
Trong đó, bộ phân tích khối tứ cực có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối
nhau có điện tích bằng nhau. Các ion bay qua khoảng không giữa 4 cực được gia tốc bởi
điện thế một chiều và tín hiệu xoay chiều. Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng
tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực [1].

11


Hình 1.6 Sơ đồ bộ phân tích tứ cực
Hiện nay, có loại thiết bị dùng bộ phân tích khối gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau
Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ.

Q1

Q2

Q3

Hình 1.7 Sơ đồ bộ phân tứ cực chập ba

Trong đó [1]:
• Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion. Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất
định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2.
• Q2: Bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm
với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị
phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Q2 không
đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến. Sau
đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.
• Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ
phận phát hiện.
Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC-MS/MS) [1].
−

Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng

hệ điện tử của máy khối phổ.

−

Bộ phận ghi và xử lý số liệu:
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm
kiểm soát, điều khiển thiết bị, phân tích tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô
vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:
• Quét toàn phổ (SCAN)
Khi thao tác với chế độ SCAN, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối
phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận
danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ
cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan
12


MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho
tín hiệu ổn định và bền nhất.
• Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho
chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn, do vậy
không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi
đã biết ion mẹ.
• Selected Reaction Monitoring (SRM) và Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS/MS, 2 kỹ thuật
ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật nên các ion con cần quan tâm thường

từ 2 trở lên, vì thế kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion
cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất
là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở
tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện [16].
Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách
cao của LC và vừa có khả năng phát hiện, định lượng chính xác của MS đối với các chất
hữu cơ ít hoặc không bay hơi. Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích với phổ
mẫu đa dạng.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 . Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
−

Hóa chất:
• Methanol, acetonitril loại dùng cho HPLC loại của Merck, Đức; nước cất hai lần.
• Acid formic loại tinh khiết của Merck, Đức.
• Cloroform, ethyl acetat, acid acetic, amoniac 25%, ethanol của Trung Quốc... Đạt độ
tinh khiết thuốc thử phân tích.

−

Chất chuẩn
Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
STT Chất chuẩn

Hàm lượng

Số lô

Nguồn gốc

1

99,65%

0114308.01

Viện

Hydroclorothiazid

kiểm

nghiệm

thuốc Hồ Chí Minh
2

Furosemid

99,51%

WS.0103128 Viện

kiệm

nghiệm

thuốc trung ương

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
− Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC-MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER EVOQ
Qube – Mỹ.
− Cân phân tích METTLER – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)
− Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)
− Máy lắc siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc
− Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức
− Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức
− Máy lắc xoáy Vortex ZX3 –Ý
− Các dụng cụ trong phân tích: bình định mức, pipet, micropipet....
− Bản mỏng sắc ký Silicagel 60 GF254
− Thiết bị bay hơi dung môi HANON HN200 – Trung Quốc

14


2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
−

Mẫu thử: Chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng dạng viên nén, viên nang
cứng, viên hoàn cứng, trà cốm được sử dụng để điều trị, hỗ trợ tiểu đường có kèm
tăng huyết áp, phù; chế phẩm hỗ trợ điều trị các bệnh thận; một số thực phẩm chức
năng có tác dụng giảm cân đang lưu hành tại Việt Nam.

−

Mẫu trắng: 3 nền mẫu dùng xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây
dựng dựa trên nguyên tắc gia giảm từ các bài thuốc y học cổ phương, các bài thuốc
kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng lợi tiểu, hạ huyết áp kèm
tiểu đường có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam; 3 nền mẫu có dạng bào chế:
• Nền 1: viên nang cứng.
• Nền 2: viên nén.
• Nền 3: viên hoàn cứng.

−

Mẫu chuẩn tự tạo: các chất chuẩn trộn vào cùng nền mẫu với tỉ lệ nhất định.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập mẫu

−

Lựa chọn theo công dụng: lựa chọn các chế phẩm điều trị, hỗ trợ điều trị tiều đường
có kèm theo tăng huyết áp, phù; tăng huyết áp; điều trị bệnh về thận, bí tiểu; một số
chế phẩm có tác dụng giảm cân.

−

Theo dạng bào chế: bột cốm/nang cứng, viên nén, viên hoàn, trà hòa tan.

−

Cách thức thu thập: các nhà thuốc, cửa hàng thuốc đông y, phòng khám lương ý, qua
mạng internet, mẫu gửi.

−

Dạng chế phẩm: có số đăng kí (SĐK) hoặc không.
2.2.2. Quy trình xử lý mẫu
Dựa vào khả năng hòa tan của các nhóm thuốc tân dược, và tham khảo các nghiên
cứu đã công bố [27], [12], [8],[19] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược
từ nền mẫu như sau :
• Khảo sát dung môi chiết: sử dụng các dung môi chiết: MeOH, EtOH 96%, hỗn hợp
MeOH – H2O (50:50), hỗn hợp MeOH - H2O (70:30).
• Khảo sát phương pháp chiết: sau khi tiến hành lựa chọn dung môi chiết, khảo sát các
phương pháp chiết sau: siêu âm 10 phút, 15 phút, 25 phút.
15