Nghiên Cứu Chuyển Gen GmCHI Vào Giống Đậu Tương ĐT51

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI
VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI
VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên
cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số
liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán
bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu.

Tác giả luận văn

Phạm Hải Yến

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu, người
thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất
giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục &
Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong cây đậu tương
bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 do TS Hoàng Phú Hiệp làm
chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang
cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục
sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện và giúp đã tôi trong quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động

viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này.

Tác giả luận văn

Phạm Hải Yến

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan…………………………………………………………. i
Lời cảm ơn……………………………………………………………

ii

Mục lục……………………………………………………………….

iii

Danh mục bảng………………………………………………….......... iv
Danh mục hình……………………………………………………….

v

Danh mục chữ viết tắt………………………………………………...

vi

Mở đầu ………………………………………………………………. 1

1. Đặt vấn đề ……………………………………………………........

1

2. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………. 2
3. Nội dung nghiên cứu………………………………………….........

2

Chương 1. Tổng quan tài liệu………………………………………

3

1.1. Cây đậu tương……………………………………………………

3

1.1.1. Đặc điểm hình thái cây đậu tương………………………..........

3

1.1.2. Vai trò của đậu tương…………………………………….........

4

1.2. Isoflavone và enzyme chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp
isoflavone..…………………………………………………................

6

1.2.1. Isoflavone...…………………………………………………….

6

1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương……..............

9

1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI……............. 10
1.3. Chuyển gen ở đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13

iii


1.3.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương...........................

13

1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI……….......……………………. 17
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................. 19
2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………

19

2.2. Hóa chất và thiết bị………………………………………………

21

2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 21
2.3.1. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen…………………..

21

2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử…………………………............

24

2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn……………............

27

Chương 3. Kết quả và thảo luận………………………………......... 28
3.1. Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51
nhờ A.tumefaciens……………………………………….....................

28

3.1.1. Kết quả khử trùng hạt…………………………………..............

28

3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp………………………………

29

3.1.3. Kết quả lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương ………………….

30

3.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmCHI trong đậu tương

chuyển gen thế hệ T0…………………………………………………

35

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số……………………………….

35

3.2.2.Kết quả phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI……………..

36

3.3. Thảo luận kết quả nghiên cứu……………………………………

38

Kết luận và đề nghị………………………………………………….. 42
1. Kết luận…………………………………………………………….

iv

42


2. Đề nghị……………………………………………………………..

42

Công trình công bố liên quan đến luận văn…………………………... 43
Tài liệu tham khảo……………………………………………............. 44

Phụ lục 1………………………………………………………...........

50

Phụ lục 2………………………………………………………............

51

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách DNA tổng số.................................

24

Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi GmCHI-coI- 25
F/GmCHI-cmyc-SacI-R....................................................................
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân bản đoạn GmCHI- 26
cmyc-KDEL………….…………………………………………….
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR………………………..

26

Bảng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi
khuẩn A.tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín…………………...

iv

34

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone...…………………………..

7

Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa isoflavone..………………….......

11

Hình 2.1. Giống đậu tương ĐT51………………………………… 19
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc trong vector chuyển
gen pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens……………..

20

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua
nách lá mầm……………………………………………….............

23

Hình 3.1. Khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín

29

Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn
chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp………………………………..

30

Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương
nách lá mầm và biến nạp………………………………………….. 31
Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo
chồi và kéo dài chồi……………………………………….............

32

Hình 3.5. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra
rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể ……….............

33

Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách
từ lá các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển
gen.................................................................................................... 36
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại
đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen
và cây không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHIcmyc- SacI-R………………………………………........................

v

37


DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

GmCHI

Glycine max chalcone isomerase

CHI

Chalcone isomerse

PCR

Polymerase Chain Reaction

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

HPLC

High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng áp suất cao)

ER

Estrogens receptor (thụ thể estrogens)

CHR

Chalcone reductase

CHS

Chalcone synthease

IFS

Isoflavones synthease

PAL

Phenylalanine amoni-lyase

DNA

Deoxyribonucleotide acid

cDNA

Complementary deoxyribonucleotide acid

BAP

6-Benzylaminopurine

GA3

Gibberillic acid

IAA

Indole-3-acetic acid

DNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

vi


MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại
cây trồng quan trọng, đứng thứ sáu về sản lượng hạt có dầu được sản xuất
rộng rãi, được trồng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới [45]. Đậu
tương có hàm lượng dinh dưỡng cao hơn hẳn so với các thực phẩm khác. Hạt
đậu tương có hàm lượng protein là 40% khối lượng khô, lipid 12-25%, glucid
0-15% và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Theo Cục Quản lý Thực Phẩm và
Dược phẩm và Tổ chức Y thế giới đánh giá về chất lượng protein cho trẻ em
và người lớn thì protein đậu tương có chất lượng cao nhất, chứa nhiều amino
acid cần thiết cho người mà cơ thể không tổng hợp ra được, như metionin,
tryptophan, lysine, isoleucine, leucine, phenylalanine, valine Đặc biệt, trong
mầm đậu tương có một chất tương tự như kích thích tố nữ estrogen, đó là
isoflavone. Chất này có công thức hoá học gần giống như kích thích tố nữ
estrogen. Vì thế, nó được mệnh danh là estrogen thực vật (phyto - estrogen)
và có vai trò quan trọng đối với sức khoẻ phụ nữ, bảo vệ phụ nữ trước một số
căn bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương [46].
Isoflavone là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu có ở loại
cây họ Đậu và đặc biệt có nhiều trong mầm đậu tương. Tuy nhiên, hàm lượng
isoflavone trong hạt đậu tương thấp, trong khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn
tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside có trọng lượng
phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số và được cho là có sự hấp
thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong khi đó, dạng aglucone được hấp thụ
nhanh hơn, nhưng hàm lượng lại rất thấp, chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone

tổng số [16]. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng hàm lượng isoflavone dạng

1


aglucone trong hạt đậu tương. Chính vì vậy hướng tiếp cận nghiên cứu nâng
cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương bằng công nghệ gen đang được
quan tâm ứng dụng.
Isoflavone được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid từ hợp
chất flavonoid trong thực vật bậc cao. Quá trình chuyển hóa tổng hợp
isoflavone là một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme,
trong đó có hai enzyme chìa khóa là isoflavone synthease (IFS) và chalcone
isomerase (CHI). CHI xúc tác chuyển hóa chalcone thành flavanone và từ
flavanone tạo thành isoflavone với sự tham gia của enzyme IFS. Như vậy,
nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzym chìa khóa trong quá trình
sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen là một
biện pháp công nghệ có hiệu quả nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt
đậu tương. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Chuyển được cấu trúc mang gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51
phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI qua nách lá mầm đậu
tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và tạo cây đậu tương
chuyển gen.
3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của
gen chuyển GmCHI bằng kỹ thuật PCR.

2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1. Đặc diểm hình thái cây đậu tương
Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc chi Glycine, họ Đậu
(Fabaceae) có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40. Đậu tương là một trong những loại
cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn
gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh. Đậu tương có nguồn gốc
được thuần hóa ở Trung Quốc [8].
Cây đậu tương có rễ cọc gồm một rễ chính và nhiều rễ phụ, rễ chính ăn
sâu trong lòng đất 30 – 50 cm, các rễ phụ có thế phát triển lan rộng 30 – 40
cm2. Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần là do các vi khuẩn Rhizobium
Japonicum cộng sinh với rễ đậu tương. Trong một nốt sần có khoảng 3 – 4 tỷ
vi sinh vật cố định đạm.
Đậu tương là một loài cây thân thảo, cây trồng ngắn ngày. Thân thường
dài từ 14 – 15 lóng, mỗi lóng có chiều dài khoảng 3 – 10 cm, cây cao khoảng
0,3 - 1,0 m. Toàn thân bao phủ bởi một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ
gốc lên đến ngọn và cả cuống lá. Những giống có mật độ lông to dày, màu
sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn, chịu rét khỏe. Ngược lại, những giống
không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém.
Thân cây có lông dài ngắn, dày thưa, nhiều ít là đặc điểm để phân biệt các
giống đậu tương với nhau. Thân cây thường có màu xanh hoặc tím khi còn
non, về già thì có màu nâu nhạt. Nếu thân non màu xanh thì hoa màu trắng
còn thân non màu tím thì hoa có màu tím đỏ.
Lá đậu tương có 3 loại lá mọc ra tùy theo giai đoạn sinh trưởng, đó là:

3

lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá thường mọc so le, có màu xanh tươi khi già
thì chuyển thành màu vàng nâu. Lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng
khác nhau tùy loài, thường có nhiều lông tơ.
Hoa nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc hoa thay đổi tùy
theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Hoa phát sinh ở nách
lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có 1 - 10 hoa
và thường có 3 - 5 hoa.
Quả đậu tương hơi cong, có chiều dài từ 2 - 7 cm, chứa 2 - 5 hạt, màu
sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen.
Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, dẹt,... Hạt to nhỏ khác
nhau tùy loài, trung bình có khối lượng 100 - 200 g [9].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương
Hạt đậu tương chứa 8% nước, 5% chất vô cơ, 15 - 25% glucose, 1520% chất béo, 35- 45% chất đạm với đủ các loại amino acid cần thiết và nhiều
khoáng chất. So với thịt động vật, đậu tương có nhiều chất dinh dưỡng hơn:
100 gr đậu tương có 411 calo; 34 gr đạm; 18 gr béo; 165mg calcium; 11mg
sắt; trong khi đó thịt bò loại ngon chỉ có 165 calo, 21gr đạm; 9gr béo; 10mg
calcium và 2,7 mg sắt. Vì có nhiều đạm nên đậu tương đã được coi như “thịt
không xương” ở nhiều quốc gia châu Á. Tại Nhật Bản, Trung Quốc 60% hàm
lượng đạm tiêu thụ hàng ngày đều do đậu tương cung cấp. Đạm này rất tốt để
thay thế cho thịt động vật vì có ít mỡ và cholesterol. Đậu tương có nhiều đạm
hơn thịt, nhiều calcium hơn sữa bò, nhiều lecithin hơn trứng. Các amino acid
cần thiết mà cơ thể không tạo ra được thì đều có trong đậu tương. Khi đậu
tương ăn chung với một số ngũ cốc như ngô thì đạu tương sẽ bổ sung một số
amino acid mà ngô không có. Với trẻ em, chất đạm của đậu tương là món ăn

4

quý giá cho các em bị dị ứng với sữa bò hoặc không tiêu thụ được đường
lactose.
Hàm lượng protein tổng số dao động trong hạt đậu tương từ 29,6 50,5%, trung bình là 36 - 40%. Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số
protein): albumin (6 - 8%), globulin (25 - 34%), glutelin(13 - 14%), prolamin
chiếm lượng nhỏ không đáng kể. Protein đậu tương dễ tan trong nước và chứa
nhiều amino acid không thay thế đáp ứng nhu cầu của người và động vật, như
valine,

leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, threonine, lysine,

phenylalanine.
Đậu tương được chế biến thành nhiều món ăn như đậu phụ, đậu phù
chúc, sữa đậu nành, tào phớ, tương,... Bên cạnh vai trò là một loại cây thực
phẩm, đậu tương cũng có tác dụng chữa bệnh tim mạch và ung thư. Theo các
nghiên cứu từ trước tới nay, việc sử dụng đậu tương có thể làm giảm lượng
cholesterol trong máu 10 - 15%. Lượng cholesterol càng cao thì hiệu quả sử
dụng đậu tương càng rõ. Kể cả khi bệnh nhân đã ăn chế độ ít béo, ít
cholesterol, nếu ăn thêm đậu tương vẫn có tác dụng hạ thấp hơn nữa lượng
cholesterol trong máu. Do vậy, ăn đậu tương được nhiều bác sĩ coi là cách
chữa bệnh vừa hiệu quả, lại ít tốn kém và không độc. Cholesterol chỉ gây tác
hại cho mạch máu nếu bị oxy hóa. Đậu tương không những làm giảm
cholesterol mà còn ức chế khả năng oxy hóa của chất này. Các nhà nghiên
cứu Nhật Bản cho biết, đạm đậu tương hoạt động như một chất chống oxy hóa
mạnh. Ngoài ra, nó còn có khả năng ức chế sự kết hợp cholesterol thành các
tổ chức clot - bước quan trọng dẫn đến rối loạn hoạt động của tim, tạo nên các
cơn đau tim.
Năm 1990, Viện ung thư Quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu tương
trong phòng bệnh ung thư và xác định ở đậu tương có năm nhóm chất chống

5

ung thư. Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của
isoflavone, một nhóm hóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm
khác ngoài đỗ tương. Tác dụng chống ung thư của đậu tương được giải thích
là do isoflavone của nó đã tác động như một anti-oestrogen, làm vô hiệu hóa
tác động của oestrogen, giống như thuốc Tamoxifen đang được dùng rộng rãi
và có kết quả trong điều trị ung thư vú [49].
Một trong các isoflavone của đậu tương được nghiên cứu nhiều nhất
trong 7 - 8 năm qua là genistein. Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng
genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u. Bên cạnh việc
ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết để khối
u phát triển), genistein còn ức chế các enzyme trong các loại tế bào ung thư,
và do đó, nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều thể ung thư
khác nhau [49].
1.2. ISOLAVONE VÀ ENZYME CHÌA KHÓA TRONG QUÁ TRÌNH SINH
TỔNG HỢP ISOFLAVONE

1.2.1. Isoflavone
Đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đã được quan tâm nhiều hơn
trong những năm gần đây, vì đậu tương có vai trò quan trọng đối với sức khỏe
con người. Đậu tương chứa daidzein, genistein, glycitein cùng với dạng
glycosid của chúng, acetyl tương ứng và dẫn xuất malonyl [21]. Vai trò trên
chủ yếu là do một hợp chất trong đậu tương, đó là isoflavone.
Isoflavone là các polyphenol không màu thuộc lớp flavonoid. Trong khi
phần lớn flavonoid có vòng B gắn vào vị trí 2 của vòng tròn C, isoflavone có
vòng B gắn vào vị trí số 3 của vòng C (Hình 1.1). Ngay cả khi chúng không
phải là steroid, chúng có cấu trúc tương đồng với estrogen, đặc biệt là
estradiol. Điều này mang lại cho chúng tính chất giả hình, chẳng hạn như khả

6


năng

gắn

kết

thụ

thể

estrogen; do

đó,

chúng

được

phân

loại

như phytoestrogens hoặc estrogen thực vật.

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone
(Nguồn: />
Isoflavone là các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tích tụ trong

đậu tương trong quá trình phát triển. Hàm lượng isoflavone có trong hạt đậu
tương là thay đổi, phụ thuộc vào yếu tố di truyền và tác động của môi
trường. Các thí nghiệm được tiến hành để xác định liệu isoflavone được tổng
hợp trong các mô hạt trong quá trình phát triển hay ở các cơ quan của thực
vật và được vận chuyển đến các hạt nơi chúng tích lũy. Phân tích sắc kí khối
phổ (HPLC) phát hiện ra các hợp chất này có trong tất cả các cơ quan của
đậu tương, nhưng hàm lượng isoflavone khác nhau tùy thuộc loại mô và giai
đoạn phát triển. Nồng độ lớn nhất là tìm thấy trong hạt nảy mầm và lá đậu
tương [15].
Isoflavone là một lớp chất của isoflavonoid, hoạt động như kích tố nữ ở
động vật có vú. Isoflavone chủ yếu được tổng hợp trong các cây họ đậu. Các
chất isoflavone hoạt động như phytoestrogens để kích hoạt động giả bằng
cách gắn kết các thụ thể estrogens (ER) ở động vật có vú [11], [36].

7


Các dẫn xuất chính của isoflavone là daidzein, genistein và glycitein
[42]. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl,
ví dụ như, genistein và daidzein là hai dạng chính trong họ isoflavone,
genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5 [44].
Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa
học đặc trưng [20].
Isoflavone được coi là chất chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn
và có cả hoạt động chống viêm giống như các flavonoid khác. Isoflavone gợi
lên một hiệu ứng estrogens yếu (agonistic) hoặc chống estrogens (đối kháng),
tùy thuộc vào mức độ estrogens nội sinh và ER [23]. Isoflavone ngăn chặn sự
liên kết của các estrogens mạnh hơn, có vai trò trong việc phòng ngừa ung thư
vú, ung thư cổ tử cung, tuyến tiền liệt hoặc ung thư tinh hoàn [33].
Khi lượng estrogen giảm trong thời kỳ mãn kinh, nhiều phụ nữ sử

dụng liệu pháp hormone. Liệu pháp hormone có thể giúp làm giảm triệu
chứng mãn kinh nhưng nó cũng gây một số rủi ro. Liệu pháp hormone có thể
làm tăng nguy cơ đau tim, đột quỵ, ung thư vú và mất trí nhớ. Isoflavone thì
lại không gây những rủi ro này. Nghiên cứu cho thấy isoflavone làm giảm
nguy cơ u xơ tử cung và nội mạc tử cung. Tỷ lệ người ung thư vú và tuyến
tiền liệt ở người châu Á thấp hơn người ở phương Tây, điều này có thể liên
quan đến mức độ tiêu thụ đáng kể isoflavone khác nhau trong chế độ ăn của
người châu Á (15 – 4mg/ngày) [27] so với chế độ ăn của người phương Tây
(0,15 – 1,7mg/ngày) [29].
Isoflavone có khả năng trung hòa các gốc tự do, trong số các isoflavone,
genistein có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [47]. Trong những thập kỷ gần
đây, các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng, cùng với các thí nghiệm in vivo, in
vitro đã chỉ ra rằng isoflavone có lợi cho bệnh nhân bị các bệnh tim mạch, ung

8


thư, loãng xương và mãn kinh [13], [30]. Isoflavone đã được chứng minh thông
qua các thử nghiệm lâm sàng với vai trò làm giảm nguy cơ tăng cholesteron
máu, bệnh tim mạch và ung thư [14]. Isoflavone có tầm quan trọng đối với các
tương tác giữa thực vật và môi trường như: các chất ức chế nhiễm trùng gây
bệnh (phytoalexins) và tín hiệu các phân tử để cộng sinh với vi khuẩn cố định
đạm [14].
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương
Con đường phenylpropanoid tạo ra một loạt các sản phẩm khác nhau có
nguồn gốc tự nhiên của thực vật. Một nhánh của con đường này là nhánh
flavonoids phổ biến hầu hết ở các loài thực vật, một nhánh khác của con
đường phenylpropanoid mà hầu như chỉ họ Đậu (Fabaceae) mới có, hình
thành nên isoflavonoid [14].
Trong đậu tương, isoflavone gồm daidzein, genistein và glycitein được

dự trữ trong không bào [38]. Genistein, daidzein và glycitein được tổng hợp
bởi một nhánh của con đường phenylpropanoid. Trong con đường trao đổi
chất này cũng có sự tổng hợp các hợp chất thực vật quan trọng khác như
tannin, linhin, lignans, anthocyanins, flavone, flavonol, phytoalexin,
glyceollin và pterocarpan có hoạt động kháng khuẩn [16],[18].
Con đường phenylpropanoid có nhiều nhánh với chất xuất phát ban đầu
là phenylalanine, kết quả tạo thành các chất như: glycitein, genistein, flavone,
glyceollin, anthocyanin và tanin đặc (còn được gọi là proanthocyanidin) dưới
tác dụng của hàng loại các enzyme chuyển hóa [17], [39], [40].
Một enzyme quan trọng khác trong con đường tổng hợp isoflavone là
chalcone isomerase (CHI) chuyển đổi chalcone thành flavanone, và chalcone
reductase (CHR), hình thành nên daidzein và glycitein. Các chalcone được
tổng hợp bởi CHS được chuyển đổi sang các naringenin flavone (5,7,4’9


trihydroxyflavone) bởi enzyme chalcone isomerase (CHI) [40].
Con đường phenylpropanoid bắt đầu với cơ chất đầu tiên là amino acid L
– phenylalanine (Hình 2.1). Phản ứng đầu tiên của con đường này là khử
nhóm amino (-NH3) của amino acid phenylalanine tạo thành acid cinnamic
bởi phenylalanine amoni-lyase (PAL). Con đường này tiếp diễn thêm hai phản
ứng khác nữa dẫn đến hình thành coumaroyl – CoA. Hợp chất này được biến
đổi thành hai dạng naringenin chalcone hoặc isoliquiritigenin bởi hai enzyme
tương ứng là chalcone synthease (CHS) và reductase chalcone (CHR). Sau đó
từ hai chất trên, naringenin và liquiritigenin được tạo thành nhờ sự xúc tác của
các enzyme chalcone isomerase (CHI).
Naringenin được sử dụng để tổng hợp flavonoid như flavones, flavonols,
tanin cô đặc và anthcyanins, cũng như isoflavone, genistein. Liquiritigenin
trong con đường dẫn chất isoflavonoid của cây họ Đậu (Fabaceae) và được
chuyển đổi thành glycitein và daidzein, tiền thân caue glyceollins, một nhóm
phytoalexins quan trọng [14].

Sự tổng hợp daidzein và genistein từ liquiritigenin và naringenin là hoàn
toàn được xúc tác bởi enzyme isoflavone synthease (IFS) và hydroxylhydroxan dehydratase. Tổng hợp glycitein vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng
theo giả thuyết có thể có nguồn gốc từ isoliquiritigenin [18].
1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI
Con đường phenylpropanoid với sự tham gia của hàng loạt các enzyme
chia thành hai nhánh tổng hợp, trong đó enzyme then chốt của một nhánh –
chalcone isomerase, xúc tác các phản ứng flavone, là xương sống cho nhiều
chất chuyển hóa như flavonoid và isoflavonoid. Trong con đường tổng hợp
này, phenylalanine thông qua sự xúc tác của nhiều loại enzyme để biến đổi
thành naringenin chalcone. Bắt đầu từ hợp chất này, con đường
10


phenylpropanoid được chia thành hai nhánh. Trong cả hai nhánh, enzyme
chalcone isomerase đều đóng vai trò “chìa khóa”. Nếu vì một lý do nào đó,
gen CHI không hoạt động thì enzyme chalcone isomerase không được tổng
hợp, dẫn theo hàng loạt các dẫn xuất của isoflavone không đươc tạo thành,
con đường phenylpropanoid bị dừng lại.

Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa isoflavone [18]
11


Chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa xúc tác các phản ứng sản
sinh ra flavonoid, là khung xương để chuyển hóa thành các chất như flavones
và isoflavone [20]. Flavonoid là một loại chất có nhiều trong thực vật, là một
loại chất chuyển hóa thứ cấp trong con đường phenylpropanoid. Flavonoid có
vai trò quan trọng trong việc giữ các hoạt động sinh lý bình thường trong cây
trồng, ví dụ hình thành màu sắc trong thực vật, bảo vệ cây khỏi bức xạ tia cực
tím, tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh, kích thích sự phát triển của phấn

hoa, vận chuyển hormone thực vật và tương tác giữa rễ cây và vi khuẩn
Rhizobium.
Chalcone isomerase là enzyme có vai trò quan trọng trong việc xúc tác
biến đổi chalcone thành (2S) flavanol hoặc (2S)-5-desoxidation flavanol. Đã
xác định được hai dạng của gen CHI, loại I và loại II. CHI loại I có thể xúc
tác

6-hydrox-chalcone

vào

flavonoid

(2S)-flavonoid

hoặc

(2S)-5-

desoxidation. CHI loại I được tìm thấy ở nhiều loài thực vật như lúa mạnh,
lúa, cải dầu, và Arabidopsis. CHI loại II chủ yếu được tìm thấy trong cây họ
Đậu (Fabaceae), có thể xúc tác cả 6-hydrox-chalcone và 6-deoxidationchalcone thành flavonoid (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-desoxidation flavonoid
[43]. Gen CHI từ nhiều loài thực vật khác nhau như: ngô, đậu tương, lúa
mạch, cỏ cari, hoa cẩm chướng và Saussurea medusa đã được nhân bản thành
công [26]. Mô hình biểu hiện gen CHI khác nhau ở các loài thực vật khác
nhau. Thông qua mô hình biểu hiện của gen CHI ở cà chua trong cây thuốc lá
ta thấy sự gia tăng mạnh mẽ của flavonoid trong vỏ và bột của cây cà chua
chuyển gen mà không gây ra bất kì kiểu hình nào khiếm khuyết. Ngăn chặn
con đường tổng hợp flavonoid bằng cách khử hoạt hóa gen CHI trong hành
tây dẫn đến sự tích tụ chalcone ở mức độ cao và làm giảm lượng flavonoid,

kết quả tạo ra ngô vàng. Sử dụng RNAi ức chế biểu hiện của gen CHI làm
hàm lượng flavonoid giảm, phấn hoa và cánh hoa biến mất [26].
12


Gen CHI (cDNA) đã được nhân bản từ nhiều loài thực vật bậc cao, như đậu
tương (G. max), ngô (Z.mays), lạc (A. hypogaea), P.hybrida và S. medusa [22].
Gen CHI có kích thước dao động 0,6 kb - 2,1 kb đã được nghiên cứu từ
nhiều loại cây như bông, đại mạch, cà chua, ích mẫu, cỏ linh lăng, lúa, dã yên
thảo, cam thảo, quýt, bòng, đậu xanh, đậu đỏ, sắn dây.... [23]. Hai mươi tám gen
CHI và 7 FAP được tìm thấy từ 6 mẫu thực vật, trong đó cây họ đậu có nhiều
gen CHI hơn các loài thực vật khác. Các nhà khoa học đã xác định được 12 gen
GmCHI chia thành bốn phân họ: GmCHI 1A, GmCHI 2, GmCHI 3 và FAP
[23] trong đó trong hai phân họ đầu tiên gồm GmCHI1A, GmCHI1B1,
GmCHI1B2 và GmCHI 2 mã hóa enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển
hóa chalcone thành flavones [14]. Ở cây đậu tương, gen CHI được xác định
nằm trên nhiễm sắc thể số 20 [26].
1.3. CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƯƠNG NHỜ AGROBACTERIUM

1.3.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương
Hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu khoa học được thực hiện trên
đối tượng nghiên cứu là đậu tương ở thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng. Đậu tương là cây biến đổi gen chiếm diện tích lớn nhất trên toàn thế
giới (60%), sau đó là ngô (22%) và bông vải (11%). Năm 2015, diện tích cây
trồng biến đổi gen trên thế giới đạt 179,7 triệu ha. Trong đó, đậu tương biến
đổi gen được áp dụng rộng rãi nhất, chiếm 83% tổng diện tích trồng đậu
tương trên thế giới (48). Việc tìm kiếm và phát hiện các gen chức năng trong
hệ gen của đậu tương, phân lập, tách dòng, chuyển gen tạo giống, dòng đậu
tương đã thu được nhiều thành tựu. Hiện có tất cả 36 công trình chuyển gen
được công bố, chủ yếu liên quan đến tính trạng kháng sâu và thuốc diệt cỏ,

một số ít liên quan đến tính chịu hạn và tăng hàm lượng các hoạt chất có vai
trò quan trọng.

13


Thứ nhất là tạo các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng kháng sâu,
bệnh hại. Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen kháng ruồi
đục thân, sâu đục quả, đã thiết kế được bốn vector mới mang gen kháng sâu
cry2Aa, cry4A, cry2Aa + soycy1Ac, cry4A + soycry1Ac; tạo được các dòng
biến đổi gen từ giống William đến thế hệ T2 được xác định qua phân tích
Southern blot mang gen soycry1Ac hoặc vip3A [48].
Thứ hai là tạo các dòng đậu tương chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi
như hạn, nóng, lạnh. Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn Hahb-4 (có nguồn gốc
từ cây hoa hướng dương) đã được công bố và phê duyệt áp dụng tại Argentina
năm 2015. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu
các gen khác liên quan đến tính trạng chịu hạn, đặc biệt là nhóm gen NAC.
Tại Việt Nam, mỗi năm phải nhập khẩu 2,5 triệu tấn đậu tương, sản lượng đậu
tương hàng năm thu được chỉ đáp ứng 18% nhu cầu trong nước do năng suất
thấp mà chủ yếu là kết quả của stress phi sinh học trong đó hạn hán là hạn chế
lớn. Do vậy, việc nghiên cứu, phát triển các giống đậu tương ưu tú có thể đối
phó với tình trạng khan hiếm nước được xem là một mục tiêu quan trọng của
các nhà khoa học trong nước [48].
Thứ ba là chọn tạo giống đậu tương nhằm tăng hàm lượng các chất hoạt
tính có trong đậu tương có vai trò quan trọng như genistein, daidzein,
flavonoid.
Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu tạo chọn dòng đậu
tương chịu hạn (vector pPTN-rd29A-drebIA), kết quả phân tích PCR của 8
dòng T0 kháng thuốc diệt cỏ có 5 dòng có sự hiện diện của gen chịu hạn
drebIA.

Năm 2014, Henry Nguyen và cs đã nghiên cứu chuyển gen GmNAC003
và GmNAC004 sử dụng promoter 35S vào cây Arabidopsis. Kết quả cho thấy

14


cây chuyển gen GmNAC004 so với cây đối chứng có sự gia tăng số lượng và
chiều dài rễ trong điều kiện thường và tăng cao trong điều kiện hạn [31].
Theo nghiên cứu mới nhất của Reem Hussain và cs (Trường Đại học
Nông Nghiệp Huazhong, 2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, phân tích
biểu hiện 28 gen GmNAC, kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC phụ thuộc
vào kiểu gen; 8 trong số 28 gen chọn lọc (GmNAC004, GmNAC021,
GmNAC065, GmNAC066, GmNAC073, GmNAC082, GmNAC083

và

GmNAC087) đã được phát hiện có mức độ biểu hiện cao ở các giống đậu
tương chịu hạn. Nghiên cứu này xác định gen GmNAC có thể được xem là
trọng tâm trong các nghiên cứu trong tương lai trong việc phát triển đậu tương
chịu hạn cao [19].
Trong nghiên cứu của Qu và cs (2016), các tác giả đã thực hiện quá trình
chuyển gen thông qua Agrobacterium trên đối tượng nghiên cứu là đậu tương
bằng cách sử dụng một vector biểu hiện RNAi chứa gen β tiểu đơn vị của
globulin 7S. Phân tích PCR và Southern blot đã được sử dụng để xác nhận
việc gắn của vec tơ vào bộ gen đậu nành có thành công hay không. Trong
nghiên cứu này, việc chuyển đổi cây đậu nành bằng cách sử dụng một vector
biểu hiện RNAi chứa tiểu đơn vị β ở globulin 7S đã thành công. Tổng cộng có
10 cây đậu tương chuyển gen dương tính ở thế hệ T0, 6 cây chuyển gen
dương tính ở thế hệ T1 và 13 cây chuyển gen dương tính ở thế hệ T2. Các
mức độ giao thoa biểu hiện của tiểu đơn vị β trong 7S thay đổi trong mỗi cây

biến đổi gen và cao nhất mức độ can thiệp đạt 77,5%. Do đó, một dòng đậu
tương mới chứa hàm lượng thấp chất gây dị ứng thu được, có chứa vector
biểu hiện RNAi [34].
Yếu tố phiên mã MYB là một trong những họ lớn nhất trong thực vật,
đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của cây trồng và
sự chuyển hóa sinh lý. Yang và cs (2009) đã nghiên cứu biểu hiện và chức
15