KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨNESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔRỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂNNUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,TỈNH VĨNH LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHẠM THỊ THÙY LINH

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ
RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN
NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,
TỈNH VĨNH LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ
RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN
NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,
TỈNH VĨNH LONG

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PSG. TS Lưu Hữu Mãnh

Phạm Thị Thùy Linh
MSSV: B1207161
Lớp: CN12Y4A1 – K38

Cần Thơ, 2016


CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi gà là một nghề không chỉ cung cấp thực phẩm cho bữa ăn hàng
ngày của mỗi gia đình mà còn đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người
chăn nuôi nên những năm gần đây ngành chăn nuôi gà ở Vĩnh Long phát
triển rất mạnh. Theo báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 của Sở Nông
Nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Vĩnh Long, tổng đàn gà của toàn tỉnh
trên 3 triệu con, tăng 24,7% so với cùng kỳ năm 2013 (Chi cục Thú y tỉnh
Vĩnh Long, 2014). Hơn nữa, việc phát triển nhanh chóng đồng thời cũng
làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và
hiệu quả chăn nuôi. Theo Hồ Việt Thu (2012), hầu hết các loài gia cầm ở
mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với vi khuẩn E. coli. Trong các bệnh nhiễm cầu
trùng trên gà thì E. coli là phổ biến nhất, xảy ra ở mức độ ngày càng tăng và
có thể trở thành một vấn nạn trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm
(Võ Thị Trà An, 2012). Để chăn nuôi hạn chế được các rủi ro, tăng hiệu quả
thức ăn, kích thích tăng trưởng thì nhiều nơi đã sử dụng kháng sinh một
cách liên tục, đặc biệt là trên cả gà khỏe, gà chưa có biểu hiện bệnh, làm cho
vi khuẩn không chỉ đề kháng với chính kháng sinh đó mà còn đề kháng chéo
với nhiều kháng sinh khác (Trần Huy Hoàng, 2013).
Hiện nay đã xuất hiện các chủng vi khuẩn gram âm sinh men β-lactamases

phổ rộng (ESBL) có khả năng đề kháng với các kháng sinh nhóm βlactamases bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng như cephalosporin thế hệ 3
và 4. Trên thế giới đã có rất nhiều báo cáo về E. coli ESBL trên gà được
công bố, tại Zagazig - Ai Cập tiến hành nghiên cứu trên 106 mẫu thịt gà bán
lẻ thì có 69 chủng E. coli ESBL được tìm thấy, chiếm 65,09% (Abdallah et
al., 2015). Theo Hetty Blaak et al. (2015), nghiên cứu trên các mẫu phân tại
các trại gà thịt và gà đẻ ở Hà Lan cho thấy tỉ lệ E. coli dương tính với ESBL
trên gà thịt và gà đẻ lần lượt là 65% (46/71) và 81% (57/70). Tuy nhiên tại
Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này đa phần chỉ thực hiện trên người ở
những bệnh viện lớn, có rất ít nghiên cứu về E. coli ESBL trên vật nuôi nói
chung và trên gà nói riêng. Xuất phát từ tình hình trên, đề tài “Khảo sát sự
hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh β-lactamases phổ rộng trên
gà khỏe và môi trường chăn nuôi tại một số nông hộ ở huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện với mục tiêu:
Xác định tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe và môi
trường chăn nuôi tại một số nông hộ ở huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long.

1


Kiểm tra tính nhạy cảm của các chủng E. coli ESBL phân lập được đối với
một số loại kháng sinh.

CHƯƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli
Bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Echerich đã phân lập và tìm ra đặc điểm
của vi khuẩn này lần đầu tiên trong tả lót trẻ em vào năm 1885, tại Munchen
và công bố nó dưới cái tên Bacterium coli commune. E.coli là loài quan trọng
được tìm thấy trong phân (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970).Năm 1991, vi khuẩn
này được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli hay E. coli. E.coli
được xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma
Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae. Là vi khuẩn

Gram âm thường trực ở trong ruột, chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí; một số
chủng là vi khuẩn cộng sinh giúp tổng hợp một số vitamin B, E và K và cân
bằng hệ vi sinh đường ruột nhưng hầu hết là vi khuẩn gây bệnh đường ruột và
các cơ quan khác. Ở ruột, vi khuẩn E.coli sống kháng với một số vi khuẩn
khác như Salmonella và Shigella nhờ có khả năng tạo ra một loại chất ức chế
có tên là colicin. (Lê Xuân Phương, 2009).
Theo Đậu Ngọc Hào (2012) E. coli sống ở khắp nơi trong môi trường và đặc
biệt sống phổ biến trong ruột, đường hô hấp của động vật khỏe mạnh. Tuy
nhiên, khi cơ thể suy yếu, một số chủng E.coli có thể gây bệnh.Vi khuẩn
E.coli hiện diện thường xuyên trong đường ruột gà và được thải qua phân với
số lượng lớn (Hồ Thị Việt Thu, 2012).
2.1.1 Đặc điểm hình thái
Theo Lưu Hữu Mãnh (2010) E.coli là một trực khuẩn Gram âm, có hình gậy
ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2-3 x 0,6 µm, không sinh nha bào. Trong cơ thể
có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn
E.coli di động do có lông nhung bao xung quanh thân nên có khả năng di
dộng, nhưng có thể gặp một số chủng đột biến không lông và không thấy di
động.
Dưới kính hiển vi điện tử, người ta còn phát hiện được cấu trúc pili – yếu tố
mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli (Lê Thị Hoài, 2008).
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số
có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo dinh dưỡng. Là vi khuẩn
hiếu kỵ khí tùy ý. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40 0C, nhiệt độ thích hợp
2


nhất là 37oC, pH tối ưu nhất là 7,4 (Hồ Thị Việt Thu và Nguyền Đức Hiền,
2012).
Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E.coli phát triển

rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi
khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối (do vi
khuẩn phát triển sinh ra H2S ) (Phùng Thị Minh, 2008).
Môi trường thạch MC (MacConkey Agar): vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to,
tròn đều, màu hồng nhạt, khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2-3 mm (Nguyễn Ngọc
Hải, 2012).
Môi trường NA (Nutrient Agar): sau khoảng 8 giờ đến 10 giờ nuôi cấy ở ,
dung 37oC kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc
có kích thước khoảng 1,5mm, hình tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu
tro trắng nhạt, hơi lồi. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng
ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucoid)
(Theo Lê Thị Hoài, 2008).
Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): qua 18-24 giờ ủ trong tủ ấm 37 oC,
hình thành khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đường
kính 2-3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001).
Môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar): sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC, vi
khuẩn hình thành hững khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim (Nguễn Ngọc Hải,
2012).
Môi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucurnide Agar): đây là một phương tiện
và đã được phát triển như là một môi trường chọn lọc để phân lập và định
lượng Escherichia coli trong mẫu thực phẩm. Dựa trên Tryptone Bile Agar kết
hợp các tác nhân chromogenic X-glucuronide, trong đó phát hiện hoạt động
của enzyme glucuronidase, đây là enzyme cùng được phát hiện bởi thuốc thử
MUG đã được chứng minh là rất cụ thể cho Escherichia coli, có thể được
phân biệt với các sinh vật coliform khác. Kết quả ở các khuẩn lạc là màu xanh,
trong khi coliforms khác là không màu (Bavo Verhaegen, 2015).
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
Hầu hết các trường hợp E. coli có thể lên men một số loại đường bao gồm
arabinose, glucose, galatose, fructose, saccharose và maltose. Khả năng lên
men glucose với việc sản xuất acid, sinh hơi cũng như sinh Indole là một đặc

tính cơ bản của E. coli (Soja, 1965; Bettelheim, 1994; trích dẫn bởi Anna
Milena Ulmer Franco, 2011).
3


Phản ứng Voges Proskauer và oxidase âm tính. Có thể dung các xét nghiệm
sinh hóa phân biệt E. coli từ các loài Escherichia khác và vi khuẩn thuộc họ
Enterobaccteriaceae E. coli phân lập từ gia cầm có đặc tính sinh hóa tương tự
E. coli phân lập từ các nguồn khác (Hồ Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Theo Nguyễn Tiến Dũng (2007), vi khuẩn E.coli xuất hiện sớm ở động vật
ngay sau khi sinh khoảng 2 giờ, chúng thường ở phần sau của ruột. Trong
nhiều trường hợp còn tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ
thể. Để phân biệt vi khuẩn E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta
thường sử dụng phản ứng IMViC qua các môi trường Tryton (thử nghiệm sinh
indole), MR (Methyl Red), VP (Voges Prokauer), Simmons citrate (Nguyễn
Ngọc Hải, 2012)
Phản ứng sinh Indole
Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn vào môi trường tryptone, ủ ở 37 oC. Sau 24
giờ, nhỏ 5 giọt dung dịch thuốc thử Kovac ’s vào môi trường, để yên vài phút,
theo dõi sự tạo màu đỏ trrong lớp dung môi hữu cơ.
Phản ứng (+): vòng thuốc thử chuyển màu đỏ, phản ứng (-): có lớp màu vàng
của thuốc thử trên bề mặt môi trường.
Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có thể sản xuất indol từ axit amin tryptophan
bằng cách sử dụng enzyme tryptophanase (Trần Linh Thước, 2003).

Tryptophan

tryptophanase

> Indole + pyruvic acid + NH3

H2 O
Phản ứng Methyl Red (MR)

Tiến hành phản ứng: các vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào trong nước dùng
phosphate glucose, trong đó có chứa glucose và một bộ đệm phosphate và ủ ở
37oC trong 48 giờ. Trong 48 giờ hỗn hợp sản xuất axit của sinh vật phải sản
xuất đủ axit để vượt qua các bộ đệm phosphate và vẫn còn axit. Độ pH của
môi trường được kiểm tra bằng cách cho thêm 5 giọt thuốc thử methyl red.
Phát triển của màu đỏ được thu được như là tích cực. Methyl red với sinh vật
âm tính thì môi trường không đổi màu (Stephan et al., 2013).
Nguyên tắc: Điều này là để phát hiện những khả năng của một sinh vật để sản
xuất và duy trì sản phẩm axit cuối ổn định từ quá trình lên men glucose. Một
số vi khuẩn sản xuất ra một lượng lớn axit từ quá trình lên men glucose mà nó
vượt qua những tác dụng đệm của hệ thống. Methyl red là một chỉ số pH, mà
vẫn còn màu đỏ ở độ pH 4,4 hoặc ít hơn.
4


2 Glucose + H2O

> 2 Lactic acid + acetic acid + ethanol + 2 CO2 + 2 H2

Phản ứng Voges Proskauer (VP)
Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng VP-MR, ủ ở 37 oC
trong 24 giờ, nhỏ vào môi trừng đã nuôi cấy vi khuẩn mẫu 6 giọt dung dịch
thuốc thử VP1 (alpha-naphthol) và 2 giọt dung dịch VP2 (NaOH 40%), đọc
kết quả sau 20 phút
Phản ứng (+): có màu đỏ trên bề mặt môi trường, phản ứng (-): môi trường
không đổi màu.

Nguyên tắc: trong quá trình lên men glucose, E. coli có thể cho những sản
phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetonin. Khi bổ sung vào môi
trường vài giọt VP1 và VP2 aceton sẽ tạo ra một phức hợp máu đỏ (Trần Linh
Thước, 2003).
Glucose + 1/2O2

2,3-butanediol

> 2,3-butanediol + H2O + 2 CO2
Oxi hóa
2,3-butanediol dehydrogenase

Acetoin + α – Naphthol

40% NaOH
O2

Diacetyl + Guanidine

> Acetoin

> Diacetyl
> màu đỏ

Sử dụng Citrate
Tiến hành phản ứng: khuẩn lạc của vi khuẩn được cấy vào thạch Simmon
citrate và ủ qua đêm ở 37oC. Nếu sinh vật có các khả năng sử dụng citrate, tạo
ra sản phẩm cuối cùng có tính kiềm, chúng sẽ thay đổi màu sắc của môi
trường từ màu xanh lá sang màu xanh dương. Âm tính, môi trường không đổi
màu. Sử dụng citrate liên quan đến các enzyme citrase, cái mà phá vỡ citrate

thành oxaloacetate và acetate. Oxaloacetate được tiếp tục bị tách thành
pyruvate và CO2. Sản xuất Na2CO3 cũng như NH3 từ việc sử dụng sodium
citrate và muối amoni tương ứng tạo kết quả pH kiềm. Điều này dẫn đến sự
thay đổi về màu sắc của môi trường từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương.
Nguyên tắc: kiểm tra này phát hiện khả năng của một sinh vật với sử dụng
citrate làm nguồn carbon duy nhất (Quinn et al., 2004).

Citrate

> Oxaloacetate + Acetate
5


Oxaloacetate

> Pyruvate + CO2

CO2 + 2 Na + H2O

> Na2CO3 + H2

NH3 + CO2 + H2O

> (NH4)2CO3

2

2.1.4 Sức đề kháng
Trong tự nhiên, vi khuẩn E. coli tồn tại khắp nơi: nền chuồng, máng ăn, nước
uống, chuồng trại ẩm thấp chật chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thường

xuyên thay đổi, stress có thể là những điều kiện phát sinh mầm bệnh (Nguyễn
Xuân Bình, 2005).
E. coli là vi khuẩn không sinh nha bào nên không chịu được nhiệt độ cao, có
thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60 0C sau 30 phút, ở 70oC sau 2 phút, trong điều kiện
đông khô vi khuẩn có thể sống lâu (Hồ Thị Việt Thu, 2012).
Các chất sát trùng thông thường như acid phenic, formol, hydroperoxide 1%
diệt được vi khuẩn trong vài phút. Sự sinh sôi của hầu hết các chủng bị ức chế
khi pH < 4,5 và pH > 9 nhưng không chết. E. coli ở dạ dày ruột có thể sống sót
ở pH 2,5 ít nhất là 2 giờ. Muối 8,5 % sẽ ngăn ngừa sự tăng trưởng nhưng
không bất hoạt vi khuẩn (Barnes et al., 2008).
Escherichia coli thường là một vi khuẩn đường ruột không gây bệnh. Tuy
nhiên, một số chủng đã có được các yếu tố độc tính và có thể gây ra nhiều
bệnh ở động vật khi sức đề kháng của chúng bị giảm sút (Stenutz, 2006). Dựa
trên đặc điểm gây bệnh, chúng được phân thành tám nhóm nhỏ như sau
(Antão et al., 2008)
EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột.
ETEC (Enterotoxicgenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột.
EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm nhập ruột.
EAEC (Enteroaggregative E. coli): E. coli ngưng tập ruột.
DAEC (Diffusely adherent E. coli) : E. coli bám dính phân tán.
EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) : E. coli gây xuất huyết ruột.
MAEC (Meningitidis-associated E. coli): E. coli gây bệnh viêm màng não.
UPEC (Uropathogenic E. coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu.
2.1.5 Phương thức lây truyền bệnh
Tính gây bệnh
6


Theo Wilson et al. (2002), để có thể gây bệnh trước hết vi khuẩn E. coli phải
bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính. Sau đó nhờ

các yếu tố xâm nhập vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột.
Ở đó vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá hủy lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột
đồng thời sản sinh độc tố đường ruột. Độc tố đường ruột tác động vào quá
trình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể tập trung
vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ơ ruột gây nên một tác
dụng cơ học làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên
hiện tượng tiêu chảy. Sau đó phát triển ở thành ruột vi khuẩn vào hệ lâm ba
đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu. Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện
tượng thực bào gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần hoàn, vi
khuẩn đến các tổ chức, cơ quan khác nhau. Ở đây vi khuẩn phát triển lên lần
thứ hai, phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết. Các yếu tố gây
bệnh của E. coli gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm
nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố E. coli có sẵn trong
ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề kháng của con vật
giảm. Bệnh do E. coli có thể xảy ra như một bệnh truyền nhiễm kế phát trên
cơ sở thiếu vitamin và mắc bệnh do virus và kí sinh trùng. Khi tỉ lệ E. coli
giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất hiện
các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
E.coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề
kháng của con vật giảm. Tuy từng loại mà cơ chế gây bệnh có khác nhau:
EPEC (Enteropathogenic E.coli) gây viêm ruột non: ETEC (Enterotoxigenic
E.coli) gây bệnh do sinh độc tố; EIEC (Enteroinvasive E.coli) gây bệnh do có
khả năng xâm nhập vào niêm mạc ruột già, cơ chế giống vi khuẩn Shigella gây
tiêu chảy có đờm lẫn máu; EAEC (Enteroaggregative E.coli) gây bệnh do bám
vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột; EHEC (Enterohaemorrhagic
E.coli) gây bệnh làm tổn thương xuất huyết ruột (Lê Hồng Hinh, 2008).
Các chủng EHEC là một mối đe dọa cho sức khỏe con người, đặc biệt là
serotype O157:H7. Vi khuẩn được truyền sang người chủ yếu thông qua việc
sử dụng các thực phẩm sống hoặc chưa nấu chín kỹ, ngoài ra vi khuẩn có thể
bị lây nhiễm vào thực phẩm thông qua môi trường xung quanh. Chỉ cần một

lượng rất nhỏ vi khuẩn cũng đủ gây bệnh và EHEC thường dẫn đến hội chứng
tán huyết-tăng ure máu (HUS) rất phổ biến ở trẻ em. EHEC thường được tìm
thấy nhiều nhất ở động vật nhai lại, nhưng đôi khi chúng vẫn có thể hiện diện
trên các động vật khác như heo, chó mèo hoặc gà (WHO, 2011).

7


Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm thuộc nhóm APEC (Avian Pathogenic
E.coli), chúng gây ra bệnh Colibacillosis (nhiễm khuẩn E.coli) trên gà, đây là
một bệnh cấp tính, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp
chăn nuôi gà trên toàn thế giới (Ewers C, 2003). Tỉ lệ nhiễm trong đàn thường
trên 10%, tỉ lệ chết thường thấp hơn 5% nhưng đôi khi có thể lên đến 20% (Hồ
Thị Việt Thu, 2012). Gà mắc bệnh do E. coli có biểu hiện đờ đẩn, giảm tăng
trọng, có triệu chứng hô hấp. Sau đó gà bị nhiễm trùng huyết, nhiệt độ tăng
cao 420C- 430C. Lông xù có bết phân, sau đó gà chết. Một số gia cầm mắc
bệnh cố triệu chứng què từ mức độ nhẹ cho đến nặng, đi dứng khó khăn.
Nguồn lây nhiễm
Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết các loài động vật
đều có E. coli thường trú trong ống tiêu hóa. Ở ống tiêu hóa gia cầm, mật độ
E. coli có thể đến 106CFU/g. Sự lây nhiễm E. coli từ trứng thì phổ biến và là
nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao cho gia cầm mới nở. Bình thường có khoảng
0,5-6% trứng gia cầm khỏe có chứa E. coli, 26,5% gà mái nhiễm E. coli đẻ
trứng có vi khuẩn E. coli. Tuy nhiên đường lây nhiễm qua phân vẫn là cách
lây truyền quan trọng nhất.
Vi khuẩn E. coli hiện diện thường xuyên trong đường ruột và được thải qua
phân với số lượng lớn. Sự tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với phân có thể đưa
những chủng mới vào bầy đàn. Bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết
thương ngoài da, qua niêm mạc bị tổn thương (Barnes et al., 2008).
Ngoài ra, E. coli có thể truyền qua trứng do cơ thể gà mẹ bị nhiễm bệnh,

truyền lây qua đường hô hấp do niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn từ
môi trường xâm nhập qua vết thương vào cơ thể, truyền qua vỏ trứng do bị
nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường ở chuồng trại bị nhiễm trùng, lây qua thức
ăn và nước uống bị nhiễm trùng (Nguyễn Xuân Bình và ctv., 2005).
Mặt khác, E. coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh
khi sức đề kháng của con vật bị giảm sút (do chăm sóc, nuôi dưỡng, thời tiết
và thức ăn,…). Bệnh do trực khuẩn E. coli có thể xảy ra như một bệnh truyền
nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin, mắc các bệnh virus và ký sinh trùng.
E. coli thường gây bệnh cho gia súc mới đẻ từ 3 - 5 ngày hoặc 4 - 8 ngày.
Người ta gọi Colibacillosis là một bệnh đường ruột ở ngựa, bê, cừu, lợn và gia
cầm non do E. coli gây ra (Lưu Hữu Mãnh, 2009).
Nguồn gây bệnh E. coli chủ yếu là từ con bệnh và con khỏe mang trùng bài
xuất mầm bệnh ra môi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các

8


loài gậm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ
môi trường bên ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005).
Côn trùng cánh cứng (bọ hung) có thể làm lan truyền bệnh E. coli do ăn phân
của gia cầm, vi khuẩn E. coli có thể tồn tại bên ngoài cơ thể bọ cánh cứng đến
12 ngày và trong phân 6 - 10 ngày (Nguyễn Bá Hiên, 2013).
2.1.6 Kháng nguyên
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp nên hệ thống phân nhóm
serotype được sử dụng dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, K, H.
Hiện có khoảng 180 kháng nguyên O, 80 kháng nguyên K, 60 kháng nguyên
H (Ana Milena Ulmer Franco, 2011).
Vi khuẩn E. coli được chia thành các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc
kháng nguyên. Cấu trúc kháng nguyên của E. coli gồm: kháng nguyên thân O,
kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên F.

Kháng nguyên O
Là nhóm kháng nguyên bề mặt thành tế bào, bền vững với nhiệt, đề kháng với
nhiệt độ 1000C trong 2 – 4h, cấu tạo bởi chuỗi đường trên phân tử LPS (Gyles
và Thoen, 2003). Kháng nguyên O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch
hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên O tương ứng.
Nghiên cứu một số đặc điểm huyết thanh học, rất nhiều tác giả nhận thấy có
hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhóm kháng nguyên O với nhau (Orskov
và cs, 2007).
Kháng nguyên K
Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharide, hòa tan trong dung
dịch phenol45%, gồm 3 loại kháng nguyên L, A, B (P H Makela và H Mayer,
2006). Một số nhóm kháng nguyên K của E.coli tính kháng nguyên rất kém,
cơ thể vật chủ không đáp ứng miễn dịch (Gyles và Thoen, 2003). Kháng
nguyên K của rất nhiều chủng E.coli có khả năng ngưng kết chéo với nhau.
Một số kháng nguyên K của nhóm E.coli này có thể ngưng kết chéo với kháng
thể O của nhóm E.coli khác (Orskov và cs, 2007).
Kháng nguyên H
Cho đến nay đã có 56 kháng nguyên H được phát hiện, đó là nhóm kháng
nguyên có nguồn gốc từ lông tế bào vi khuẩn E.coli (flagella antigens) và
chúng được gọi là kháng nguyên H. Khả năng phòng vệ của kháng nguyên H
vẫn chưa được nghiên cứu kỹ. Tuy nhiên nhiều tác giả cho rằng kháng nguyên
H không phải là một yếu tố kích thích miễn dịch, thường xuyên biến đổi. Đa
9


số các chủng ETEC là không có kháng nguyên H, chúng thường không di
động (Phạm Hồng Ngân, 2011)
Kháng nguyên F (Kháng nguyên pili)
Ngoài lông ra, ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E.coli nói
riêng còn có những bộ phận khác hình sợi, gọi là pili. Tất cả các kháng nguyên

pili đều là protein, chúng được cấu tạo từ các amino axit cơ bản. Môi trường
nuôi cấy, nhiệt độ, cấy chuyển lên các môi trường nhiều lần ảnh hưởng đến
tổng hợp kháng nguyên pili (Duchet-Suchaux và cs, 2006). Kháng nguyên pili
kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu, ngưng kết hồng cầu một số loài gia súc
(Isaacson, 2007). Kháng nguyên pili không cùng serotype, mặc dù trong cấu
trúc một số kháng nguyên pili có một vài thành phần giống nhau (De Graaf,
2002).
Theo Ewers C (2003) hiện nay các serotype O1:K1, O2:K1 và O78:K80 được
công nhận là phổ biến nhất trong các chủng E. coli gây bệnh trên gà.
Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết các chủng E. coli
phân lập từ gia cầm chỉ gây bệnh cho gia cầm, ít nguy hại đến người và các
động vật khác như: O1, O2, O35, O78, O18, O81, O115 , O 116 và O132. Tuy
nhiên loài gia cầm cũng mẫn cảm với chủng E. coli O157:H7 là một chủng
sinh độc tố Shiga gây hại cho người.
Hiện nay có hơn 700 type kháng nguyên hay serotype của E. coli từ sự tổ hợp
của các nhóm kháng nguyên O, H, K. Gần đây, vài phân lập từ gia cầm bệnh
thuộc các serotype O18, O81, O115, O116, O132 cho thấy đã xuất hiện một số
tác nhân gây bệnh mới (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.1.7 Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E. Coli
Dựa vào khả năng gây bệnh, các E. Coli có khả năng gây bệnh được chia làm
2 nhóm: nhóm gây bênh đường ruột (IPEC) và nhóm gây bệnh ngoài đường
ruột (ExPEC). Mặc dù đa số các nhiễm trùng E. coli ở gia cầm xảy ra ở ngoài
đường ruột nhưng một số chủng APEC có đặc tính liên quan đến E. Coli gây
bệnh đường ruột như EPEC, ETEC, EIEC và EHEC. Các thử nghiệm cho thấy
48% các serotype E. coli là nguyên nhân gây viêm màng ngoài tim và gây chết
ở gà 3 tuần tuổi. Ngoài đường ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E.
Coli), UPEC (Uropathogenic E. coli) (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền,
2012).
2.2 Tổng quan đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn
2.2.1 Khái niệm kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

10


Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh là những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi
sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triển
hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn
chuyển hóa cần thiết của vi snh vật (Võ Thị Trà An, 2010).
Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc sản xuất bằng những con
đường tổng hợp. Kháng sinh chỉ gồm những chất ở nồng độ thấp đã có tác
dụng ức chế hay tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh,
nhưng không, hay rất ít gây độc cho con người, gia cầm và gia súc (Bùi Thị
Tho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005).
Đề kháng kháng sinh
Về nguyên lý, kháng sinh là chất chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nếu
trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn vẫn phát
triển được gọi là hiện tượng đề kháng kháng sinh.
Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sỡ hữu riêng các gen kháng kháng
sinh. Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi
khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng
kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh
được đưa vào sử dụng, ví dụ streptomycin được đưa vào sử dụng năm 1943
đến năm 1959 vi khuẩn đã đề kháng với khấng sinh này (Trần Huy Hoàng,
2013).
2.2.2 Phân loại đề kháng kháng sinh
Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc ở gene. Các gene kháng
thuốc hiện diện hoặc ở trong nhiễm sắc thể (đề kháng nhiễm sắc thể), hoặc
trong một yếu tố di động như các plasmide, các yếu tố có thể chuyển vị trí
hoặc integron (đề kháng ngoài nhiễm sắc thể) (Hiroshi Nikaido, 2009).
Đề kháng tự nhiên

Vi khuẩn đã có tính kháng thuốc từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh. Mỗi loài
hoặc mỗi giống được đặc trưng và phát họa phổ hoạt động kháng sinh riêng.
Các gene đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn. Đề kháng tự nhiên
là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài, và được biết ngay từ lúc
đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tác
dụng của thuốc kháng sinh (Kathleen and Arthur, 2001).
Đề kháng mắc phải

11


Vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh nhưng sau một thời gian tiếp xúc trở
nên không nhạy cảm nữa. Nguyên nhân là do: đột biến hoặc kháng qua nhiễm
sắc thể dẫn đến thay đổi đích tác động của kháng sinh; kháng qua plasmid,
thường là sản xuất các enzyme làm bất hoạt kháng sinh; hoặc làm giảm ái lực
của kháng sinh với mục đích tác động hoặc thay đổi đường chuyển hóa.
Plasmid là những đoạn DNA nhỏ có dạng vòng tròn, nằm ngoài DNA nhiễm
sắc thể. Điểm thuận lợi của plasmid là chúng có thể di chuyển dễ dàng qua các
màng tế bào và chúng có thể trao đổi các đoạn DNA với nhau giữa các vi
khuẩn (Trang Quan Sen, 2005). Plasmid được tìm thấy trong hầu hết các loại
vi khuẩn, có khả năng tồn tại một cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn. Các
plasmid kháng thuốc (R-plasmid) mang các gen mã hóa các enzyme làm bất
hoạt kháng sinh và thay đổi hệ thống vận chuyển qua màng tế bào (Bùi Văn
Nghĩa, 2012). Đáng chú ý là có nhiều gen kháng thuốc có thể cùng nằm trên
một plasmid duy nhất, do đó tính đa kháng có thể được lan truyền giữa các
chủng vi khuẩn khác nhau (Hiroshi Nikaido, 2009).
Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể phát triển sự kháng chéo với các kháng sinh
trong cùng họ. Các tính chất di truyền cũng như tính đề kháng từ một nhóm vi
khuẩn này có thể truyền sang một nhóm hoặc loài vi khuẩn khác trong môi
trường, đặc biệt là giữa các vi khuẩn đường ruột gram âm

(Enterobacteriaceace), do vậy có những vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc với
kháng sinh nhưng đã mang trong mình tính đề kháng do một vi khuẩn khác
truyền sang (Võ Văn Ninh, 2001).
Nghiên cứu của Leverstein Van Hall et al. (2011) về mặt di truyền của các
chủng E coli ESBL thì các gen ESBL nằm trên plasmid phân lập được trên
người và trên gia cầm thì tương tự nhau do đó ESBL có thể di truyền qua
chuỗi thức ăn. Ngoài ra, có thể có nhiều gen kháng thuốc đều cùng nằm trên
một plasmid duy nhất di đó một vi khuẩn có thể đề kháng với nhiều loại kháng
sinh cùng lúc (Pitout et al., 2004).
2.2.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
Theo Nguyễn Thị Yến Chi (2011), có 4 cơ chế chính gây đề kháng kháng sinh
của vi khuẩn như sau
Ức chế bằng enzyme
Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh. Sự
sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bới một yếu tố bên ngoài (một kháng
sinh khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài).

12


Sự sinh men beta-lactamase: các beta-lactamase là các men do vi khuẩn sinh
ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Các men này đề
kháng kháng sinh rất hiệu quả. Chúng làm bất hoạt các thuốc nhóm betalactamine bằng cách phá hủy nối amide của vòng beta-lactam. Trên toàn cầu,
kháng sinh họ Beta-Lactamines được sử dụng nhiều nhất trong tất cả các
nhóm, vì thế vấn đề đề kháng với kháng sinh nhóm này rất đáng lo ngại.
Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn
Các vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào
chất với môi trường bên ngoài. Các vi khuẩn gram âm còn được trang bị thêm
một vỏ bên ngoài, gọi là thành ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở
cho các bộ phận nằm ở bên trong. Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi

ngang qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong vi khuẩn, theo cách thức khuyến
tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ). Sự giảm tính thấm của tế bào làm
giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do
biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi khuẩn. Sự biến đổi
các lỗ của lớp thành tế bào vi khuẩn gram âm có thể làm giảm hoặc ngăn cản
sự khuếch tán của kháng sinh vào vị trí tác dụng. Dạng đề kháng này nói
chung xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau, do có khi
các kháng sinh khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ. Mặt khác, sự
đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng một loại lỗ. Ví dụ
sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự đề kháng đặc
hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các carbapeneme.
Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đề kháng,
đặc biệt tiếp theo sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ. Tính thấm
liên quan đến các lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamases và
tạo nên sự đề kháng cho vi khuẩn. Đôi khi, có vi khuẩn chỉ trở nên đề kháng
khi xảy ra đồng thời hai hiện tượng trên. Ví dụ, với vi khuẩn Enterobacter sp.
và vi khuẩn Serratia sp., sự đề kháng với imipeneme là do sự biến đổi đồng
thời tính thấm tế bào và tăng tổng hợp các men beta-lactamases ở nhiễm sắc
thể.
Biến đổi vị trí gắn kết
Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế
làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng. Ví dụ
Biến đổi các protein liên kết với penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với
các thuốc nhóm beta-lactamines có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc
do mắc phải gene bên ngoài có các PBP mới. Cơ chế này thường gặp với các
13


cầu khuẩn gram dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus
pneumonia, nhưng rất hiếm gặp ở vi khuẩn gram âm. Trong số các vi khuẩn

gram âm, cơ chế đề kháng này được thấy ở vi khuẩn Neisseria và hiếm gặp
hơn ở Haemophilus influenza.
Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom: Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu
đơn vị ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh macrolides,
clindamycine, nhóm aminosides, hoặc chloramphenicol. Sự biến đổi này làm
cho kháng sinh không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng
trưởng của vi khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom.
Biến đổi men DNA-gyrase và men topoisomerase: DNA-gyrase là men cần
thiết cho hoạt tính của các quinolone. Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một
acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng. Tương tư như thế đối với các
đột biến ở men topoisomerase.
Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng này có thể bị
xảy ra khi dùng vancomycine, như trường hợp các cầu khuẩn đề kháng với
vancomycine.
Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của men dihydropteroate synthetase
kháng lại sự gắn kết với sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm
mất nhạy cảm với trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc. Sự đề kháng
của các vi khuẩn gram âm đối với các sulfamide là do plasmide tạo các
enzyme đề kháng.
Bơm đẩy
Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy kháng
sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn (efflux). Các chất vận chuyển đẩy thuốc ra là các
thành phần bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đề
kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh. Các bơm này
cần năng lượng. Việc tiếp xúc với thuốc kháng sinh làm thuận lợi cho việc
tăng số lượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng
của vi khuẩn. Đây cũng có thể là nguyên nhân gây đề kháng chéo. Ví dụ,
ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với cephalosporine
theo cơ chế bơm đẩy. Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên lâm sàng có
mang bơm đẩy gây kháng thuốc là E. Coli và Shigella. Staphylococcus aureus

có thể cũng có bơm đẩy làm cho vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm
Macrolides.
2.3 Tổng quan về men beta-lactamase phổ rộng (Extended Spectrum βLactamases)
14


2.3.1 Khái niệm về men beta-lactamase phổ rộng (ESBL)
ESBL là các β-lactamases phổ rộng có khả năng tác động lên các penicillin,
cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và aztreonam (trừ kháng sinh
cefamycin và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng sinh này
nhưng chúng lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β-lactamases như acid
clavulanic, sulbactam, tazobactam (Nguyễn Thị Khánh Ly, 2013). Các chất
này không có hoạt tính kháng khuẩn, dùng phối hợp với các β – lactams để có
tác động trên β – lactamase (Trần Đức Hậu, 2007).
Men β-lactamase có thể được phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ
chất thuộc kháng sinh β-lactam và mức độ bị ức cheesbowir acid clavulanic,
nhưng các đột biến có thể làm thay đổi sự phân loại này. Ví dụ TEM-1 là một
peniccilinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi acid
clavulanic và tazobactam, Tuy nhiên, do đột biến điểm các enzyme TEM có
phổ hoạt động rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3.
Sự bất hoạt của aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone được
xem là chỉ thị cho sự hiện diện của các men β-lactamase có phổ rộng (Võ Thị
Trà An, 2010).
Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sinh ESBL
Theo Nguyễn Sâm (2012) các vi khuẩn sinh ESBL thường đề kháng cao với
nhiều nhóm kháng sinh. Các nguyên nhân chính đươc ghi nhận đó là:
Các ESBL thường được mã hóa qua trung gian plasmide các gen đề kháng
kháng sinh thường liên kết theo nhóm, dẫn đến gen đề kháng cùng bị đột biến
với các kháng sinh nhóm khác. Khi đã đề kháng kháng sinh ESBL sẽ có sự
thay thế háng sinh điều trị mới dẫn tới tăng đột biến cảm ứng tạo gen đề

kkhangs kháng sinh các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn
thông thường, Vi khuẩn sinh ESBL còn có khả năng đề kháng chéo với các
nhóm kháng sinh khác.
Nhờ vậy, nhìn từ lịch sử phát hiện cũng như các đặc điểm phân loại và cơ chế
đề khấng kháng sinh thi bản chất của vi khuẩn ESBL sẽ có những đặc điểm
sau. Gen mã hóa ESBL nằm trên plasmide do đột biến từ các gene β-lactam cổ
điển như TEM-1, SHV-1. ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử dụng
các cephalosporin phổ rộng thế hệ 3,4 và aztreonam. Kháng chéo kèm với các
kháng sinh nhóm aminoglycosides, flouroquinolones và nhiều kháng sính
khác. Tuy nhiên, còn nhạy ảm với các β-lactam kết hợp chất ức chế, nhạy cảm
carbapenem, cephamicins, temocillin các nhóm kháng sinh có cấu trúc tương
tự nhau.
15


2.3.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
Sự gia tăng tỷ lệ lưu hành của Enterobacteriaceae sinh ESBL tạo ra một nhu
cầu rất lớn cho các phương pháp kiểm tra trong phòng thí nghiệm để xác định
chính xác sự hiện diện của các enzym trong phân lập lâm sàng. Dựa trên
nguyên lý chung: Các ESBL đều bị ức chế bởi các chất ức chế βlactamase như acid clavulanic, sulbactam, tazobactam. Từ đó dựa vào các
chất ức chế nói trên kết hợp với kháng sinh chỉ điểm để phát hiện ESBL.
Nhiều phương pháp phát hiện ESBL được đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa
khuyếch tán của Kirby – Bauer đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp
đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E – test (Bradford, 2001)
Phương pháp đĩa đôi (Double disk diffusion test)
Phương pháp đĩa đôi được được các nhà nghiên cứu người Pháp Jarlier và
cộng sự tiến hành năm 1988. Sau đó tác giả người Anh David M Livermore và
các cộng sự đã tiếp tục nghiên cứu và đề xuất thêm một số tiêu chuẩn kỹ thuật
cho thử nghiệm.
Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề

kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh
cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid. Vi khuẩn
được cấy trên đĩa thạch Mueller – Hinton agar (MHA). Đặt đĩa cephalosporin
(30µg) với đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm trên
mặt thạch. Trước đây, khoảng cách yêu cầu là 30mm, nhưng hiện nay, khoảng
cách được giảm xuống để tăng độ nhảy cảm của phương pháp. Có cộng hưởng
khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với
đĩa chứa clavulanate
Ưu điểm: phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy và đặc hiệu cao > 95%.
Nhược điểm: khó lựa chọn được khoảng cách tối ưu giữa 2 khoanh giấy
ở từng vi khuẩn, âm tính giả với các ESBL hoạt tính thấp, không phát hiện
được các vi khuẩn P.aeruginosa và một số vi khuẩn có ESBL giảm ức
chế clavulanic acid thường gặp như ESBL type OXA- (Pitout, 2003).

16


Hình 2.1 Phương pháp đĩa đôi phát hiện ESBL (Pitout, 2003).
Phương pháp đĩa kết hợp (Combination disk test)
Phương pháp này được Jacoby và Hans mô tả lần đầu tiên vào năm 1999.
Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và
cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với clavulanic acid. Vi khuẩn tiết
ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối
hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm. Các loại đĩa kháng sinh
được sử dụng là cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg);
ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg); cefpodoxime (10
µg)/ cefpodoxime (10/10 µg) (CLSI, 2014).
Ưu điểm: phương pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém nhưng yêu cầu phòng
thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxime – clavulanic acid và ceftazidime
– clavulanic acid. Nhược điểm: một số trường hợp cho kết quả dương tính giả

do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô
khuẩn khi có clavulanic acid.

17


Hình 2.2 Phương pháp đĩa kết hợp phát hiện ESBL (Sohei Harada, 2008)
Chú thích
CAZ: ceftazidime
CTX: cefotaxime
CAZ/CVA: ceftazidime /clavulanic acid
CTX/CVA: cefotaxime /clavulanic acid
Phương pháp E-test
Các Etest ESBL (AB biodisk, Solna, Thụy Điển) là một dải nhựa tẩm thuốc
với một bên chứa một thang nồng độ ceftazidime 0,5-32 mg/ml và bên kia
chứa một thang nồng độ ceftazidime 0,064 - 4 mg/ml cộng với một nồng độ cố
định của clavulanate acid (4 mg/ml) (TZ / TZL). Một Etest ESBL tương tự đã
được ngâm tẩm với cefotaxime nồng độ 0,25 - 16 mg/l và cefotaxime 0,064 - 4
mg/l cộng với clavulanate acid (4mg/l) (CT / CTL) lúc này cũng có sẵn. Các
nhà sản xuất khuyến cáo việc sử dụng cả 2 dải TZ / TZL và CT / CTL để xác
nhận sản xuất ESBL (Enno Stürenburg, 2004).
Kết quả ESBL được đọc là dương tính khi giá trị MIC giảm 8 lần trở lên được
quan sát thấy trong sự hiện diện của clavulanate so với đầu còn lại hoặc quan
sát vòng kháng khuẩn dưới thang CTL, TZL hoặc sự biến dạng hình elip giảm
dần ở phần cuối cũng chỉ là sản xuất ESBL, ngay cả khi tỷ lệ MIC là <8 hoặc
không thể đọc được. Khi khuẩn lạc đột biến được quan sát trong vùng ức chế,
giá trị MIC nên được xác định bằng cách đọc các nồng độ thuốc ở đó khuẩn
lạc đột biến được ức chế hoàn toàn (Sohei Harada, 2008).
Phương pháp này dễ tiến hành, cho kết quả chính xác nhưng giá thành khá cao
nên khó tiến hành rộng rãi.

18


Hình 2.3 Phương pháp E – test phát hiện ESBL (Sohei Harada, 2008)
Ngoài ra, để phát hiện vi khuẩn sinh ESBL còn có thể sử dụng các phương
pháp khác như: máy tự động Vitek, máy định danh vi khuẩn BD Phoenix.
Ngoài ra cũng có thể áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện vi
khuẩn sinh ESBL như: PCR, DNA probes (mẫu dò DNA), LCR.
2.3.3 Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL
Vào năm 1963 tại Athens Hy Lạp từ máu một bệnh nhân tên là Temoneira
người ta phân lập được chủng E. coli kháng ampicillin có sinh loại enzyme βlactamase và lấy luôn tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này là TEM-1. Năm
1965 cũng ở nơi đây từ E. coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1 biến
đổi một amino acid. Nhờ TEM-1và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn Gram âm
kháng lại các penicillins, ampicillin và cephalosporins thế hệ 1 trong một thời
gian dài sau đó. Cho đến năm 1974 chủng K. pneumoniae có gen mã hoá
enzyme β- lactamase trên plasmide được phát hiện, enzyme này có nhiều thay
đổi về amino acid so với TEM-1 và TEM-2 nên đặt tên là SHV-1 (Sulphyryl
Variable).
Đầu những năm 1980, một loại enzyme β-lactamse có khả năng phân huỷ các
cephalosporins thế hệ 2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams, có nguồn
gốc do TEM-1, TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi một số amino acid gọi là
ESBL đã xuất hiện. Năm 1983 ở Đức đã phát hiện chủng K. ozaenae sinh
enzyme β- lactamase phân huỷ cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là
trường hợp sinh ESBL đầu tiên được ghi nhận. . Năm 1984 đến 1987 tại Pháp
19


đã phát hiện chủng K. pneumoniae có gen mã hoá ESBL trên plasmide kháng
cefotaxime đặt tên là CTX-1. Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản

Masumato và năm 1989 ở Đức Bauernfein phát hiện E. coli sinh ESBL kháng
cefotaxime không phải TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1. Đáng ngại là
CTX-M có khả năng phân huỷ hầu hết cephalosporins thế hệ 3 và cả
cephalosporins thế hệ 4 (Nguyễn Sâm, 2009).
2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E. coli ESBL trong và ngoài nước
2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Tại Tây Ban Nha, Marc Sola-Gines (2015) nghiên cứu trong số 682 con ruồi
bị bắt trong năm trang trại gà thịt (trang trại 1-5), nằm trong khu vực Catalonia
(Tây Ban Nha), khoảng cách tối thiểu và tối đa giữa các trang trại là 15 km và
200 km cho thấy có 42 con mang E. coli tạo ESBL. Tất cả các chủng là đa
kháng (kháng> 3 họ kháng sinh). Hơn nữa, 79% các chủng kháng hơn tám
kháng sinh, 98% kháng ciprofloxacin. Ngoài ra, 100% các chủng kháng
ampicillin, cephalosporin, trimethoprim, florphenicol và tetracycline, 98%
kháng sulfamethoxazol; 86% kháng streptomycin; 45% kháng
chloramphenicol; 36% kháng gentamicin; 17% kháng cho kanamycin; và 2%
kháng colistin. Ruồi là một hồ chứa nguy hiểm và là vectơ cho các mầm bệnh
của vi khuẩn kháng thuốc đến con người và động vật do tiếp xúc với phân
chuồng, thức ăn, và con người.
Nghiên cứu của Abdallah HM (2015) tiến hành phân tích từ các mẫu thịt gà
bán lẻ mua tại Zagazig, Ai Cập cho thấy có 69 trong số 106 (65,09%) là sản
xuất ESBL. Đây là nghiên cứu đầu tiên của Ai Cập báo cáo tỷ lệ cao ESBL
phân lập từ thịt gà bán lẻ. Những kết quả nêu những lo ngại nghiêm trọng về y
tế công cộng và an toàn thực phẩm từ thịt bán lẻ là một hồ chứa các vi khuẩn
kháng thuốc có thể được truyền qua cho con người thông qua chuỗi thức ăn.
Tại Ghana, Mette Marie Rasmussen (2015) tiến hành lấy mẫu và phân tích 188
mẫu từ thịt gà sản xuất trong nước. Có 153 vi khuẩn phân lập được thành công
nuôi cấy và xác định là E. Coli. Trong đó 29 E.coli sản xuất beta-lactamase
(18,95%). trong số đó kháng với ≥ 3 loại kháng sinh chiếm 56,9%,. Tần số
kháng kháng sinh cao nhất là đối với cefpodoxime kháng 100%, với
tetracycline (88,9%), tiếp theo là sulphonamide (75,0%), ampicillin (69,4%)

và trimethoprim (66,7%).
Theo Yang Lauderdale (2015) nghiên cứu tại Đài Loan cho thấy sự phổ biến
của vi khuẩn kháng thuốc từ các trang trại chăn nuôi gia súc và gia cầm là mối
đe dọa tiềm ẩn đối với sức khỏe cộng đồng. Tổng cộng 95 mẫu thịt đã được
20


nghiên cứu (23 mẫu thịt bò, 35 mẫu thịt gà, và 37 mẫu thịt lợn). Trong đó,
E.coli ESBL được phát hiện trong 60 mẫu (chiếm 63,2%), cụ thể có 30,4%
(7/23) mẫu thịt bò dương tính với ESBL, mẫu thịt gà và thịt lợn dương tính
với ESBL với tỉ lệ lần lượt là 80% (28/35), và 64,9% (24/37).
Ở Hàn Quốc, Lim Jong-Soo (2015) điều tra sự xuất hiện và kháng kháng sinh
của E. coli ESBL từ xác thịt gà (n = 156) tại các lò mổ ở Hàn Quốc. Kết quả
phân lập được 62 mẫu dương tính E. coli ESBL lấy từ 156 mẫu (39,7%).
Nghiên cứu này cho thấy một tỷ lệ kháng khá cao của E. coli ESBL trong các
mẫu thịt gà thu thập từ các lò mổ ở Hàn Quốc.
Theo nghiên cứu của Tao Yu et al. (2015) tiến hành phân lập E. coli từ mẫu
thịt gà bán lẻ ở tỉnh Hà Nam, Trung Quốc đã phát hiện 179 trong 645 mẫu
(27,7%). Trong số 179 chủng phân lập, 30 (16,7%) sản xuất ESBL. Trong đó
có 78,2% chủng đề kháng với streptomycin, kháng với tetracycline và kháng
với trimethoprim/sulfamethoxazole lần lượt là 54,2% và 74,3%.
Tại Zambia, Chishimba (2016) đã tiến hành thu thập và phân tích 384 mẫu thịt
gà được bán lẻ tại các chợ. Trong tổng số mẫu được phân tích có 20,1%
(77/384) chứa E.coli ESBL. Các thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh cho thấy
85,7% (66/77) E. coli ESBL phân lập được kháng với beta-lactam và các
kháng sinh khác. Những kết quả này chỉ ra rằng gia cầm là một hồ chứa tiềm
năng tạo E.coli ESBL. Sự hiện diện của E.coli ESBL ở gia cầm dành làm thực
phẩm cho con người đòi hỏi phải tăng cường các chính sách quản lý, sử dụng
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi phải đảm bảo an toàn và hiệu quả.
Theo nghiên cứu của Po-An Chen (2016) khi tiến hành thu thập 40 mẫu nước

sông từ các trạm trang trại chăn nuôi gia súc và gia cầm ở miền Nam Đài
Loan, tỉ lệ E. coli ESBL chiếm 186 trong 621 chủng E. coli (chiếm 30%). Kết
quả này cho thấy nước thải từ các trang trại chăn nuôi, đặc biệt là nước thải
chưa qua xử lý đã góp phần vào sự lây lan của gen kháng thuốc vào môi
trường xung quanh.
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu của Phạm Thị Cẩm Tú (2015), khi phân lập E. coli từ các mẫu
phân của gà khỏe tại Bến Tre cho thấy sự hiện diện của E. coli ESBL là
55,18% (181/328). Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ kết quả cho thấy đề
kháng cao với 10 loại kháng sinh (>80%) là ampicillin, cefuroxime, cefalor,
gentamicin, streptomycin, kanamycin, tetracycline, norfloxacin, ofloxacin,
trimethoprim/sulfamethoxazole.

21


Theo Đỗ Kim Huệ (2014), tiến hành thu thập 60 mẫu phân của gà đẻ tại Sóc
Trăng phân tích, kết quả cho thấy tỉ lệ hiện diện E. coli ESBL là 30%. Các
E. coli ESBL đề kháng mạnh với một số kháng sinh như ampicillin 100%,
trimethoprim/sulfamethoxazole 98%, streptomycin 96,6%, cefalor 96,6%,
cefuroxime 92,6%, gentamicin 88,6%.
Theo nghiên cứu của Ngô Văn Thống (2014), tỉ lệ hiện diện vi khuẩn E. coli
ESBL trên mẫu phân gà khỏe tại Trà Vinh là 65,45%. Trong đó có 99,10%
chủng đề kháng với ampicillin, 93,94% kháng với cefalor và
trimethoprim/sulfamethoxazole, đề kháng với cefuroxime và streptomycin lần
lượt là 90,91% và 85,28%.
Trương Thị Xuân Ngân (2014), kết quả phân lập từ mẫu phân của gà đẻ được
nuôi nông hộ tại tỉnh Vĩnh Long có tỉ lệ hiện diện E. coli ESBL là 51,66%.
Các khuẩn lạc E. coli ESBL đề kháng cao với amikacin 99,01%, cefalor
96,04%, ampicillin 92,08%, cefuroxime 86,14%, fosfomycin 82,18%.

22


CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2016 đến tháng 12 năm 2016.
Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu: huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long.
Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Đối tượng nghiên cứu: mẫu phân gà khỏe và môi trường chăn nuôi (thức ăn ở
máng, không khí, nước máng uống, nước nguồn) ở một số hộ chăn nuôi gà
thuộc huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long.
3.2.2 Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ: máy autoclave, máy lắc vortex, tủ sấy vô trùng,tủ nung,buồng cấy vô
trùng, tủ lạnh, tủ ấm, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que chang, đèn cồn,
micropipet các loại, cốc thủy tinh, cân điện tử, ống đong các loại, kéo, kẹp,
tăm bông vô trùng, đũa thủy tinh, thước đo vòng vô khuẩn, thùng trữ lạnh, túi
nylon, khẩu trang, găng tay.
Hóa chất: cồn 70o, 90o, nước cất, NaCl 0,9%.
Các môi trường sử dụng: MacConkey Agar (MC), Nutrient Agar
(NA),Tryptone Bile X-Glucuronide Agar (TBX), Muller-Hilton Agar (MHA).
Các kháng sinh sử dụng: ceftazidime 30µg (Cz), ceftazidime/acid clavulanic
30/10µg (Zc), cefotaxime 30µg (Ct), cefotaxime/acid clavulanic 30/10µg (Tc),
ampicillin 10µg (Am), cefuroxime 30µg (Cu), cefaclor 30µg (Cr), gentamycin
10µg (Ge) , streptomycin 10µg (Sm), kanamycin 30µg (Kn), amikacin 30µg
(Ak), tetracycline 30µg (Te), doxycycline 30µg (Dx), norfloxacin 10µg (Nr) ,
ofloxacin 5µg (Of), fosfomycin 50µg (Fo), trimethoprim+ sulfamethoxazole
1,25/23,75 µg (Bt), colistin 10µg (Col).

3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu
Đề tài thu thập ngẫu nhiên mẫu phân 30 con gà khỏe mạnh (15 gà ≤ 1 tuần
tuổi, 15 gà ≥ 1 tháng tuổi) và các mẫu thức ăn, không khí, nước ở môi trường
chăn nuôi của 5 hộ chăn nuôi tại huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long.

23