Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ THU HOÀI
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG
(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khoá học

: 2015-2019

Thái Nguyên, năm 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ THU HOÀI
Tên đề tài
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG
(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K47 - CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khoá học

: 2015-2019

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2019


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng
(Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”.
Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu
nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề
tài nghiên cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian
thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cám ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện
tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ
dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời
gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,
thành công trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 03 tháng 6 năm 2019
Sinh viên thực hiện
Dương Thị Thu Hoài


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn
Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] ...............................................................8
Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................25
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung
dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ....35
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái
sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ........................37
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................39
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài
P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ....................................................41
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả
năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) ........44
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân
nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................47
Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) .......................49
Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .......................51


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa
CNSH-CNTP ...........................................................................................11
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật ...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài
P.micranthum...........................................................................................28
Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2
đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .......................36
Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. ......................................................37
Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ......38
Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh
chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ..............................39
Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ..........40
Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................41
Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P.
micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ........................................................42
Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh
chồi lan hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ). .............................43
Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng
nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............45
Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân
nhanh chồi lan Hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )...................46
Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) .......................................47

iv

Hình 4.12. Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) .......................................48
Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .......................................50
Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................51
Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) .......................................52
Hình 4.16. Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................53


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

B5
BAP
CS
CT
CV
Đ/C
LSD

: Gamborg cs, 1976
: 6-Benzyl amino purine

: Cộng sự
: Công thức
: Coeficient of Variation – Hệ số biến động
: Đối chứng
: Least Singnificant DifferenceTest

MS
MT
GA3
NAA

: Murashighe và Skoog, 1962
: Môi trường
: Gibberellic acid
: α-Napthalene acetic acid

IAA
IBA
IUCN

: Indole-3-acetic acid
: Indole-3-butyric acid
: International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên
Quốc tế
: Paphiopedilum micranthum
: Paphiopedilum malipones
: Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

P. micranthum

P. malipoens
WPM


vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v
MỤC LỤC ..................................................................................................................vi
Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................3
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) ................................................................4
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc .....................................................................................4
2.1.2. Đặc điểm hình thái ...........................................................................................5
2.1.3. Sinh thái ............................................................................................................6
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ......................................................................7
2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum ................................................................10
2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam ......................10
2.2.2. Hình thái ..........................................................................................................10
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum ..................11
2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng ..............................12

2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .......... Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật........... Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.............. Error!
Bookmark not defined.
2.3.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................13


vii

2.3.4. Môi trường dinh dưỡng ...................................................................................14
2.3.5. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ...........................................................18
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước .......19
2.4.1. Trên thế giới ....................................................................................................19
2.4.2. Trong nước ......................................................................................................21
Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......25
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................25
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ........................................................................25
3.1.2. Hoá chất sử dụng .............................................................................................25
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu...........................................................................25
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................26
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................26
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................26
3.2.3. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................26
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................26
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử
trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. .......................................................26
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum..................................................................26
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và
hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân

mang mầm ngủ. .........................................................................................................26
3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P.
micranthum. ..............................................................................................................27
3.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................27
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................27
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống ..............................................28
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................28
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................33


viii

3.5.1. Thu thập số liệu ...............................................................................................33
3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu ...............................................................................34
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................35
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng
HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng .................................................................35
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái
sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ............................................37
4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ
tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang
mầm ngủ ....................................................................................................................39
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan
Hài P. micranthum ....................................................................................................39
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài
P. micranthum ...........................................................................................................41
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng
nhân nhanh chồi lan P. micranthum ..........................................................................43
4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh
chồi lan P. micranthum .............................................................................................46

4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.
micranthum từ mầm ngủ ...........................................................................................48
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P. micranthum. .............................................................................49
4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P.micranthum ...............................................................................51
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................54
5.1. Kết luận ..............................................................................................................54
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ix


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế
giới, được công nhận là một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái
của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc
đáo không có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy
nhiên tập trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và
Châu Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một
trong nhiều loài phong lan đẹp. Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có
158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê và phát
hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên

thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á. Trong các
loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong
phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam. Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào
mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam.. Có thể thấy 22 loài lan hài
thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự
đa dạng cho các loài lan hài Việt Nam. Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc
và kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan trong nước mà còn hấp dẫn khách chơi
lan ngoại quốc do vậy những người đi săn lan hài sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở
những vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác. Việc thu hái như vậy đã gây nên những tác
động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng. Điều này đã đẩy các loài lan hài của Việt Nam
rơi vào nguy cơ tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18].
Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ (Paphiopedilum micranthum) là một trông số
loài lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa giữa
hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa và môi là
điều hấp dẫn nhất đối với những người trồng và lai tạo Lan Hài. Hoa thường nở vào
dịp tết. Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam (tập trung
tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây,


2

Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc). Là loài Hài rất quý mới được phát hiện và được
ưa chuộng ở thị trường trong và ngoài nước [30].
Giống như thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P.micranthum cũng bị
khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiến chngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài
Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự
nhiên của chúng. Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng như vậy việc bảo tồn, phát
triển loài lan này hết sức cần thiết.
Đặc thù riêng của lan Hài P. micranthum là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy
mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan Hài Mốc Hồng có

nguy cơ rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Vì vậy việc nghiên cứu
nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn
gen thực vật quý hiếm. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các
loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những
phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất
lượng cây thấp và số lượng cây ít…Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân
giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số
lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp
truyền thống không thực hiện được. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định
về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng của thị
trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt
chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả
năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương
pháp in vitro ”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nhân giống thành công chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ bằng kĩ thuật
nuôi cấy in vitro.


3

1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu
quả tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ
lan Hài P. micranthum.
- Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm
ngủ.
- Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum.

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào
kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế
cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân
giống cây lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp
phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan Hài P. micranthum bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng lớn cây lan Hài P. micranthum góp phần bảo
tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho
nghiên cứu khoa học.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum)
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
2.1.1.1. Phân loại
Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan
(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành
hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng
dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi
sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ
ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác.
Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở
các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.
- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25
loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ
Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.
Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông,
Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales),
phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae),

ngành hạt kín

(Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1].
2.1.1.2. Nguồn gốc
Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt
Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và
miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế.
Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu
mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi


5

là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong).
Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực
hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự
giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một
nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là
dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1], [19].
2.1.2. Đặc điểm hình thái

Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất
đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:
- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá
mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều
có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1].
- Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và
mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên
thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc
khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá
có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển
hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1].
- Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm
ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống
hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có
cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có
lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy
từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá
hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có
lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.
- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh
hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với
các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp


6

hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu
tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở
mặt ngoài [1].
Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè

xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn.
Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ
ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi
sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.
Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực
hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn
cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài
lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1].
- Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả
mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ
phấn từ sáu đến mười tháng [1].
- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và
thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội
nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1].
2.1.3. Sinh thái
Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân
bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m,
nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 7002200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay
rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.
Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài
sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc,
các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc
trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá
và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ


7

cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m.
Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao.

Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải
qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi
tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng
phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của
các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự
hình thành và phát triển của quần thể lan Hài.
Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi.
Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các
sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan
Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay
đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính
gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1].
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam
Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng
như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành
kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam
Á.
Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm,
tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 22 loài thuộc chi Paphiopedilum,
Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không
những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm
mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [5]. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu
lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự
nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan
Hài càng biến mất nhanh chóng [6].
Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài
trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức


8

bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1]
Tình trạng

Tên loài (tiếng Latinh)

Tên loài (tiếng Việt)

Đã bị tuyệt chủng
ngoài thiên nhiên

P. vietnamense

Hài Việt

Đang bị tuyệt
chủng trầm trọng

p. delenatii

Hài Đỏ

P.  aspersum
P. barbigerum var. lokianum
P. callosum
P. dianthum
P. emersonii
P. gratrixianum

P. hangiannum
P. helenae
P. henryanum
P.  herrmannii
P. malipoense var. jackii
P. malipoense
P. micranthum
P. purpuratum
P. tralienianum
P. appletonianum
P. concolor
P. hirsutissimum var. chiwuawnum
P. hirsutissimum var. esquirolai
P. villosun var. annamense

Chưa rõ tên gọi
Hài Lộc
Hài Vân
Hài Xoắn
Hài Hương Lan
Hài Đuôi công
Hài Hằng
Hài hê len
Hài Henry
Hài Herman
Hài Jack
Hài Giáp
Hài Mốc Hồng
Hài Tía
Hài Trần liên

Hài Cánh Sen
Hài Gia Định
Hài Tiên biến dị
Hài Tiên
Hài Lông

P.  affine
P.  datalanse
P. villosum var. boxalli

Hài Hoà
Chưa rõ tên gọi
Chưa rõ tên gọi

Đang bị tuyệt
chủng

Sắp bị tuyệt chủng

Thiếu dẫn liệu

Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt
Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự
suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều
tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu
rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19].
Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số
lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng

9

các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến
tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy
cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến
mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái.
Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong
những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và
xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không
có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu
có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài
lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1].
Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu
quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai
gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc
hữu.
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia
về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên
cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình
hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác
giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004
[1].
Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc
biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:
- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà
(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn
loài P. callosum.
- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà
Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P. dalatensis.

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò
(Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P. micranthum.


10

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.
hangianum, P. malipoense varijackii.
- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum.
- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.
- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha
đang bảo tồn loài P. malipoense.
Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải
kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng
năm 2005 [27, 28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành
công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi
cấy mô khác nhau.
2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum
2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam
2.2.1.1. Nguồn gốc
Paphiopedilum micranthum được tìm thấy từ miền bắc Việt Nam đến phía tây
và bắc Quảng Tây, đông nam Vân Nam và phía tây Quý Châu (Trung Quốc), ở độ cao
360 - 1600 m. Cây được tìm thấy trên các vách đá, kẽ nứt bao gồm xác lá mục, đá vôi
và đất sét. Khu vực này chịu sương mù vào mùa đông và mưa lớn từ cuối mùa xuân
đến mùa hè.
2.2.1.2 Phân bố
Lan Hài P.micranthum chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh
Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn) và vùng Quảng Tây, Quý Châu, Vân
Nam (Trung Quốc)[20].

2.2.2. Hình thái
- Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường
kính 2-3 mm.
- Dạng lá: Có 3 - 5 lá xếp thành 2 dãy; thân rễ có đường kính 2 - 3 mm, dài đến
25 cm. Lá thường hình thuôn - bầu dục, dài 5 – 12, rộng 1,5 - 2 cm, mặt trên màu lục
với các đốm to màu lục thẫm, mặt dưới có nhiều chấm màu tím - tía.


11

- Dạng hoa: Cụm hoa có cuống dài 9 - 25 cm, mang 1 hoa. Hoa không có mùi,
thường màu hồng hay vàng nhạt, thẫm hơn về chóp, rộng 3 cm, dò hoa dài 9 - 25 cm,
hoa như một chiếc muôi lớn dài 10 cm, rộng 5 - 6 cm có mạng gân màu đỏ tía thẫm.
Lá đài hình trứng dài 1,5 - 3,6 cm, rộng 1,7 - 3 cm, hơi uốn ngược lại ở mép
bên, từ hình bầu dục tới hình trứng ngược, nhọn và có rãnh tới chóp.
Cánh hoa hình trứng ngược rộng, chóp tròn dài 1,9 - 4,3cm, rộng 2,3 - 4,4 cm,
có lông mép và nhiều lông dài màu trắng ở mặt trong.
Môi hình trứng rộng, lõm sâu, mép cuốn vào trong dài 5 – 10, rộng 3,4 - 5,6 cm.
Nhị lép lồi, hình thuôn rộng hay hình bầu dục, dài 5 - 10 mm.
- Dạng quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt.
Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
- Dạng rễ: Rễ chùm, màu nâu.

Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum
tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum
2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng
- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung,
những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình,
ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với

điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C.
- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài ưa


12

ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000 lux [25].
Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lá màu xanh
đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng
- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong
mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá
nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ
với 50% độ ẩm là lý tưởng.
2.2.3.2. Nhu cầu bón phân
Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung
khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân,
nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể
trồng có dấu hiệu mục nát [6].
2.2.3.3. Giá thể trồng
P. micranthum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than
củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt
mùa sinh trưởng của cây lan [8].
2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng
- Phương pháp tách chiết thông thường: Lan Hài Mốc Hồng là loài đơn thân
nên chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cột
chặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và
vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm
chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợp cho sự phát
triển lâu dài của cây [6].
- Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống

lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một
cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát triển 1cây/năm
thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triệu cây/năm. Các loài lan Hài
thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went
có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin...trong điều


13

kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ
phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng
hay chồi bên, cọng hoa, lá, đốt thân hoặc rễ [6].
2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân
hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử phát
triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm
nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn chế, đặc
biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa được khám phá.
Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
2.3.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay
bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá...), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá
mầm...), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ..) [16].
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau,
trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy
việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất
lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và
khả năng nuôi cấy [16].

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ
biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi
sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả
năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu 1quả vô trùng tuỳ
thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá
chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất
kháng sinh(gentamicin, ampixilin...) [16].


14

2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với
mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ
cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi
sinh vật. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in
vitro. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phút
sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử
trùng ở 121°C trong 25-30 phút có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [6].
- Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu
tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian
chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự
phát sinh hình thái mô nuôi cấy [13].
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của
mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường
độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000(lux), ngoài ra chất lượng ánh
sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ
làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong
ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng

của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh
sáng có cường độ 2000 - 2500(lux) người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách
bình nuôi cấy từ 35 – 40(cm).
- Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [13].
2.3.3. Môi trường dinh dưỡng
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận,
các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như
duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [11].