Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi của việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HUỲNH THỊ THIỆP
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI
CỦA VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2014 - 2019

Thái Nguyên, năm 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HUỲNH THỊ THIỆP
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI CỦA
VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ Sinh học

Lớp:

K47- CNSH

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2014 - 2019

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Bằng Phương

Thái Nguyên, năm 2019


i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại
học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực Phẩm, cùng toàn thể quý thầy cô giáo trong khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn em cho
tới ngày hôm nay.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phạm Bằng
Phương người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em, cùng toàn thể các
thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã động
viên giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị và các bạn làm việc tại Viện
khoa học sự sống – ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kỹ
năng và tạo điều kiện để đề tài “Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho một
số vật nuôi của Việt Nam” được hoàn thành đúng tiến độ và có kết quả tốt.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện tốt nhất luận văn tốt nghiệp,
nhưng trong quá trình thực hiện không thể tránh được những thiếu sót nhất
định. Vì vậy, em rất mong được sự góp ý của các thầy, cô giáo và các bạn để
khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2019
Sinh viên

Huỳnh Thị Thiệp


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu........................ 20
Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR .................................................... 21
Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị được sử dụng .............................................. 21
Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng ..................................... 22
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 24
Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA......................................................... 26
Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu
nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 32
Bảng 4.3. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê
nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI ................. 33
Bảng 4.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu
nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 36
Bảng 4.5. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên
cứu với 6 trình tự đã được công bố trên NCBI ............................. 37
Bảng 4.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B
nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 40
Bảng 4.7. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên
cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI ............................. 41


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Lợn Landrace .................................................................................... 5
Hình 2.2. Bò Vàng ............................................................................................ 6
Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình............................................................................... 8
Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai .................................. 26
Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2..... 27

Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu B, L.................................. 27
Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị
QV ............................................................................................... 29
Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của
Capra hircus đã công bố trên NCBI .......................................... 30
Hình 4.5. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4
mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI .......... 31
Hình 4.6: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của
Gallus gallus đã công bố trên NCBI........................................... 34
Hình 4.7: Kết quả BLAST chỉ thị COI của mẫu L với chỉ thị COI của Sus
scrofa đã công bố trên NCBI ...................................................... 35
Hình 4.8. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của
mẫu L nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI ...... 36
Hình 4.9. Kết quả so sánh khác loài ................................................................ 38
Hình 4.10: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu B với chỉ thị COI của Bos
taurus đã công bố trên NCBI ...................................................... 39
Hình 4.11. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của
mẫu B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI ...... 40
Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự khác loài................................................. 42


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ, thuật ngữ viết tắt

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Bp

Base pair – cặp bazơ nitơ

COI

Cytochrome C oxidase Subutnit I

Cytb

Cytochrome b

dATP

DeoxyAdenine Triphosphate

dCTP

DeoxyCytosine Triphosphate

ddATP

DideoxyAdenine Triphosphate

ddCTP

DideoxyCytosine Triphosphate

ddGTP

DideoxyGuanine Triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide Triphosphate

ddTTP

DideoxyThymine Triphosphate

dGTP

DeoxyGuanine Triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

dTTP

DeoxyThymine Triphosphate

EDTA

Etilendiamin tetraaxetic acit

GPS

Global Positioning System

ITS

Internal Transcribed Spacer

Kb

Kilo base – Kilo bazo nito

matK

Maturase K

NCBI

Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung
tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học)

PCR

Polymerase Chain Recation

QV

Quality value

RPM

Revolutions Per Minute

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
Phần 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát ................................................................................... 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài...................................................................... 3
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam ....................................... 4
2.1.1. Tổng quan về lợn...................................................................................... 4
2.1.2. Tổng quan về bò vàng .............................................................................. 6

2.1.3 Tổng quan về dê ........................................................................................ 7
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài .......................................................................... 9
2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA ........................................................................ 9
2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số....................................................... 11


vi
2.4. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose ........................................... 12
2.5. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 13
2.6. Phương pháp xác định các trình tự nucleotide ......................................... 14
2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch trong và ngoài nước...................... 15
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................... 17
Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 20
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................. 20
3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 21
3.2.1. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 21
3.2.2. Hóa chất................................................................................................. 22
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 22
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................. 23
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.................................................... 23
3.5.3. Phương pháp PCR .................................................................................. 24
3.5.4. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide ....................................... 25
3.5.5. Phân tích dữ liệu..................................................................................... 25
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 26
4.1. Kết quả tách DNA tổng số ....................................................................... 26

vii
4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI ........................................................ 27
4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding .......................................... 28
4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự ............................................. 28
4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu ................... 30
4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê.......................................................................... 30
4.4.2. Chỉ thị COI của mẫu lợn ........................................................................ 34
4.4.3. Chỉ thị COI của mẫu bò ......................................................................... 38
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 43
5.1. Kết luận .................................................................................................... 43
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44
PHỤ LỤC


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi ở Việt Nam là một bộ phận quan trọng cấu thành của
nền nông nghiệp cũng như một bộ phận quan trọng của nền kinh tế Việt Nam.
Tình hình chăn nuôi phản ánh thực trạng sử dụng, khai thác, chế biến và tiêu
thụ các sản phẩm động vật. Các sản phẩm từ vật nuôi là một nguồn cung cấp
thực phẩm với tỷ trọng cao, chất lượng tốt và giá trị dinh dưỡng lớn cho con
người, các sản phẩm phụ như da, mỡ, thịt là nguồn cung cấp cho các ngành
công nghiệp chế biến khác. Đồng thời phụ phẩm của ngành chăn nuôi là một
nguồn cung cấp phân bón hữu cơ cho trồng trọt. Để phục vụ các nhu cầu ngày
càng lớn của xã hội, việc chọn lọc và phát triển các giống vật nuôi ngày càng

được chú trọng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc, xác định
giống vật nuôi bằng chỉ thị phân tử, trong đó có các nghiên cứu về phương
pháp “DNA barcode” (mã vạch DNA). Đây là phương pháp xác định nhanh
chóng cho một cơ thể sinh vật tới cấp độ loài.
Về nguyên tắc mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm
trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai
loài sinh vật với nhau. Phương pháp này đã được ví tương tự như máy quét
trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm khác nhau mà nhìn bên ngoài
chúng rất giống nhau. Như vậy, phương pháp mã vạch DNA là một phương
pháp định danh có thể xác định giống vật nuôi tới cấp độ loài. Những nghiên
cứu mã vạch DNA là cơ sở vững chắc đáng tin cậy cho những nghiên cứu
phân loại dựa trên hình thái, là sự phát triển tất yếu và có tính kế thừa từ các
nghiên cứu phân loại học trước đây.


2

Một trong những gen được sử dụng để xác định loài ở động vật có vú là
gen COI. Gen COI có thể đóng vai trò là trình tự dùng để phân biệt các loài
vật nuôi có quan hệ gần và đây cũng là trình tự bảo thủ giữa các thành viên
của loài. Điều này gợi ý rằng sử dụng phương pháp mã vạch DNA sẽ có hiệu
quả trên nhiều loài sinh vật.
Xuất phát từ những giá trị khoa học và thực tiễn, dựa trên những cơ sở
khoa học về trình tự gen đã biết, nhằm đóng ghóp, bổ sung những trình tự
DNA phục vụ cho mục đích xác định loài vật nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi tại Việt Nam

1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nhân gen COI của một số vật nuôi: Bò, lợn, dê
- Giải trình tự gen COI
- Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam
- Đánh giá và so sánh cơ sở dữ liệu DNA barcode của vật nuôi Việt
Nam với cơ sở dữ liệu quốc tế
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số giống vật nuôi
như bò, lợn, dê của Việt Nam.


3

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo tồn nguồn gen động vật
nuôi có giá trị của Việt Nam.
- Tạo cơ sở dữ liệu cho các các nghiên cứu khoa học sau này.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nghề chăn nuôi có vai trò rất quan trọng. Ở nhiều địa
phương, đây là nghề đem lại thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình. Một số
giống vật nuôi được người dân chăn nuôi trên các quy mô lớn, đem lại thu
nhập ổn định cho người dân. Trong thời gian thực hiện đề tài, một số giống
vật nuôi như: Lợn, bò, dê được lựa chọn để xây dựng DNA barcode (mã

vạch DNA).
2.1.1. Tổng quan về lợn
Lợn thuộc lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ lợn
(Suidae), thuộc chi lợn (Sus), loài lợn rừng (Sus scrofa). Một trong các giống
lợn được nuôi nhiều nhất ở Việt Nam là lợn Landrace. Lợn Landrace có
nguồn gốc từ Đan Mạch được hình thành vào khoảng 1924–1925 do quá trình
tạp giao giữa các giống lợn đến từ Anh, Tây Ban Nha, Ý, Bồ Đào Nha, Trung
Quốc tạo thành. Theo nhiều tài liệu, chúng được tạo thành bởi quá trình lai
tạo chính giữa giống lợn Youtland có nguồn gốc từ Đức với lợn Yorkshire có
nguồn gốc từ Anh.
Giống lợn này chủ yếu được nuôi nhiều ở Đan Mạch. Sau năm 1990,
chúng được chọn lọc và có năng suất cao nên được nuôi nhiều ở các nước
Châu Âu. Hiện nay giống lợn này được xuất đi khắp nơi để cải thiện giống
lợn của nhiều nước và trở thành các giống “Lợn Landrace Mỹ”, “Lợn
Landrace Anh”, “Lợn Landrace Pháp”, “Lợn Landrace Canada”, giống này
cũng đã được nhập vào Việt Nam và nuôi trên diện rộng.
Lợn Landrace được coi là giống lợn tốt nhất trên thế giới hiện nay và
được nuôi rất phổ biến ở nhiều nơi, giống lợn này vừa có tỷ lệ nạc cao vừa có


5

thể để nái, rất thích hợp cho hộ chăn nuôi và trang trại. Giống lợn này được
nhập vào Việt Nam vào khoảng năm 1970 qua Cuba. Giống lợn Landrace là
một trong những giống tốt để thực hiên chương trình nạc hóa đàn lợn của Vệt
Nam.[20]
Ngoại hình lợn Landrace có màu trắng tuyền, đầu nhỏ, dài, tai to rủ
xuống kín mặt, tai cúp về phía trước, cổ nhỏ và dài, vai-lưng-mông-đùi rất
phát triển, mông đùi to, mõm thẳng, mông nở, ngoại hình thể chất vững chắc.
Toàn thân có dáng hình thoi nhọn, do chúng nhiều hơn các giống lợn khác 12 đôi xương sường nên thân hình rất dài. Đây là giống lợn tiêu biểu cho

hướng nạc. Lợn có khả năng tăng trọng từ 750 – 800 g/ngày, 6 tháng tuổi lợn
thịt có thể đạt 105 – 125 kg. Khi trưởng thành con được nặng tới 400 kg, con
cái 280 – 300 kg. Lợn Landrace có khả năng sinh sản cao, mắn đẻ và đẻ
nhiều trung bình đạt 1,8 – 2 lứa/năm. Mỗi lứa đẻ 10 – 12 con, trọng lượng sơ
sinh (Pss) trung bình đạt 1,2 – 1,3 kg, trọng lượng cai sữa (Pcs) từ 12 – 15 kg.
Sức tiết sữa từ 5 – 9 kg/ngày. Khả năng sinh trưởng của lợn rất tốt. Giống lợn
này kén ăn và đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng cao và cũng đòi hỏi điều kiện
chăm sóc tốt.[21]

Hình 2.1. Lợn Landrace


6

2.1.2. Tổng quan về bò vàng
Bò vàng là một giống bò u da lông vàng được tìm thấy ở Nam Trung
Quốc, Việt Nam và Đài Loan. Chúng được tạo ra trong quá trình lai tạo giữa
hai giống bò Bos taurus và Bos indicus. Chúng có tên là bò vàng vì màu sắc
lông màu vàng. Đây là giống bò gốc làm nền để tạo ra rất nhiều giống bò
khác nhau ở Trung Quốc, Việt Nam.
Về phân loại động vật học, bò thuộc giới động vật (Animalia), ngành
động vật có dây sống (Chordata),lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn
(Artiodactyla), họ trâu bò (Bovidae), phân họ trâu bò (Bovinae), thuộc chi bò
(Bos), loài Bos primigenius, phân loài (B.p.taurus, B.p.indicus).
Bò vàng có một số ưu điểm nổi bật chịu đựng tốt với điều kiện nhiệt
đới nóng ẩm, chịu đựng kham khổ tốt, thích nghi với nhiều vùng khí hậu,
thích nghi được với phương thức chăn nuôi tận dụng, đầu tư ít. Bò có nhược
điểm lớn nhất là tầm vóc nhỏ, không đáp ứng với yêu cầu chăn nuôi thâm
canh, năng suất thịt và sữa rất thấp. Năng suất thịt không cao, tỉ lệ thịt xẻ 4044%. Tuổi phối giống lần đầu vào khoảng 20-24 tháng.

Hình 2.2. Bò Vàng

Bò vàng có khả năng sinh sản tốt, 18-24 tháng tuổi bò đã động dục và
có khả năng phối giống, 30-34 tháng tuổi đẻ lứa đầu, nhịp đẻ năm một (1 năm


7

1 lứa) và 3 năm 2 lứa là phổ biến. Khả năng sinh sản tốt là đặc điểm có ích
lớn nhất của bò vàng.
2.1.3 Tổng quan về dê
Nhiều nhà khoa học ở các nước khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc
của dê nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhưng đại đa số các nhà khoa học
cho rằng dê là một trong những loại vật nuôi được thuần hóa sớm nhất.
Người ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc
khác nhau. Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính:
+ Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) được tìm thấy ở Iran và các nước
vùng tiểu Á, là tổ tiên của phần lớn dê nhà đang được nuôi ở châu Á và châu
Âu. Nó được coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà. Dê thuộc nhóm này có
sừng thẳng nhưng xoắn vặn.
+ Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về
phía sau và được coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi
Hymalaya và đang được nuôi nhiều ở hai bên sườn phía Đông và Tây của dãy
núi này. Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir –
Karakorum.
Hiện nay, người ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nước
Trung Đông, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nước châu Âu,
châu Á và châu Phi. Khu vực nuôi dê mới nhất là Đông Nam Á.
Về phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành
động vật có dây sống (Chordata), phân ngành động vật có xương sống

(Vertebrata), lớp động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla),
họ trâu bò (bovidae), họ phụ dê cừu (capra rovanae), thuộc loài dê (Capra).
Dê có đặc điểm màu lông không thuần nhất, có nhiều màu lông khác
nhau nhưng tập trung chủ yếu ở một số màu lông chính như: Màu vàng (vàng


8

tro, vàng cánh gián, vàng nâu), màu đen (đen tuyền, xám đen), khoang trắng
đen, trắng xám. Dê đực và dê cái đều có sừng và râu, tai nhỏ và hướng về
phía trước hoặc sang ngang, đầu nhỏ, mình ngắn, bụng to, tầm vóc nhỏ.
Khối lượng sơ sinh bình quân đạt từ 1,6 - 1,8kg, khối lượng trưởng
thành của dê cái khoảng 25 - 30kg và dê đực là 30 - 45kg, con cái cao khoảng
50 - 54cm và con đực cao khoảng 55 - 58cm. Dê cỏ có khả năng sinh sản tốt,
tuổi phối giống lần đầu là 6-7 tháng, đẻ 1,7 lứa/năm và 1,5 con/lứa, khoảng 2
năm đẻ 3 lứa, mỗi lứa 1-2 con. Dê cái mang thai trung bình từ 145 - 155 ngày
là đẻ. Dê con lúc mới đẻ đến khi cai sữa mất khoảng 3 tháng. Dê cái non phải
đạt 7 tháng tuổi và có trọng lượng xấp xỉ 24 kg mới cho phối giống lần
đầu[7].

Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình


9

2.2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA
Năm 2003, Paul Hebert – nhà nghiên cứu đại học Guelph, Canada, sáng
lập ra phương pháp “mã vạch DNA” dùng để nhận diện các loài [15]. Theo
định nghĩa thông thường, mã vạch là phương pháp lưu trữ và truyền tải thông

tin bằng một loại ký hiệu chuyên biệt, có quy ước. Khi nhìn vào dãy ký hiệu
này người ta sẽ biết được nguồn gốc xuất xứ của sản phẩm. Tương tự, mã
vạch DNA sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp trong
hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện và phân biệt
các loài sinh vật với nhau [22]. Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của
gen Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là trình tự
DNA có trong tất cả các loài động vật. Tuy nhiên trình tự các nucleotide của
đoạn DNA này khác nhau giữa các loài. Hệ gen ty thể của động vật thích hợp
để phân tích hơn là sử dụng bộ gen nhân vì không chứa các đoạn intron, 13
gen mã hóa protein trong ty thể động vật là những vùng gen có nhiều tiềm
năng dùng để làm mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến
sự thay đổi trong khung đọc rất hiếm xảy ra. Gen COI có đủ các yếu tố quan
trọng để có thể sử dụng làm mã vạch DNA [16]. Một mã vạch DNA điển
hình cần đáp ứng được các yêu cầu sau:
(1) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài.
(2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất tái bản cao.
(3) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài.
Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự mã vạch
DNA. Đầu tiên, mẫu vật phải được thu nhận và xác định bởi các nhà phân loại.
Một mẫu mô được lấy từ cơ thể vật nuôi và tiến hành tách chiết thu DNA tổng
số, sau đó trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR


10

(Polymerase chain reaction) và được giải trình tự để tạo ra một “mã vạch”.
Cuối cùng, các mã vạch được nhập vào hệ thống các ngân hàng dữ liệu
Barcode (BOLD). Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu
thu thập, quản lý và phân tích mã vạch DNA. Mỗi mục được tổ chức trong
BOLD có các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi

mà loài đó đã được tìm thấy và trình tự mã vạch quy ước cho đối tượng.
Thông tin này có thể được cung cấp cho bất cứ ai có nhu cầu thông qua
BOLD và bất cứ nơi đâu trên thế giới [10]. Ví dụ, mã vạch DNA sẽ giúp định
danh nhanh chóng các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng),
hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng.
Gen COI có thể dùng để xác định động vật có xương sống và côn trùng.
Gen COI của bọt biển và san hô rất bảo thủ, nhưng ở các loài lưỡng cư và
giáp xác lại có sự biến đổi quá cao, trong khi ở các loài như giun tròn, sán lá
và nhóm động vật cổ xưa “tardigrades” (gấu nước) thì vùng gen này có sự tái
sắp xếp lớn nên sẽ là trở ngại cho việc sử dụng các cặp mồi phổ biến trong
phản ứng PCR. Ngoài locut gen COI, các đoạn gen khác trong ty thể Cytb
(Cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như DNA mã vạch
trong nhận dạng ở động vật. [17]
Với hàng triệu loài động vật luôn biến đổi không ngừng theo từng giai
đoạn sống, việc phân loại và định danh các loài luôn gặp các thách thức
không nhỏ. Nhiều sinh vật nhỏ hiện nay có thể vẫn chưa được biết đến. Tuy
nhiên, ngay cả những loài động vật lớn hơn vẫn có những tranh luận về nhận
dạng giữa các loài. Việc định danh loài thông qua các đặc điểm hình thái
không còn thuyết phục. Vì vậy việc tìm ra phương pháp mã vạch DNA như
một giải pháp mới và hữu ích cho việc phân loại là sự kiện quan trọng và có ý
nghĩa thực tiễn.


11

2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu thí nghiệm là việc cần thiết bởi các thí nghiệm
của công nghệ gen đều tiến hành với DNA. Cho đến nay đã có rất nhiều quy
trình tách chiết thành công DNA được công bố và báo cáo bởi nhiều nhà
nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô hay tế bào, quy trình tách chiết có thể sẽ

khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước
cơ bản gồm: 1) Phá màng tế bào; 2) Loại bỏ protein; 3) Tủa và thu DNA.
Nguyên lý tách chiết DNA cụ thể như sau:
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông
thường tế bào, mô được nghiền trong nitơ lỏng -1960C hoặc dùng hỗn hợp
chất tẩy rửa (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Khi đó màng tế bào, màng nhân
sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên
kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu
là các protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform,
dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan
DNA, sau khi li tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa hai lớp là nước và
phenol/chloroform. Nước có chứa DNA được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa DNA nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần để
bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy các enzyme, mặt khác có thể hòa tan lại chúng
trong dung dịch có nồng độ mong muốn. Có thể tủa DNA trong ethanol, môi
trường có nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong
isopropanol (không cần muối). Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần phải rửa
trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào.


12

Bước 4: Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô tự nhiên hòa
tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho các nghiên cứu
tiếp theo.
2.4. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các
đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện
thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện

trường. Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào khích thước, cấu
hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có
kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có
kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng DNA tái
tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
Chuẩn bị gel
+ Cân 1gam agarose cho vào 99 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi sao cho
agarose tan hoàn toàn.
+ Để gel nguội đến 600C, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho
gel đông lại.
+ Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
+ Đổ dung dịch đệmTAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Tra mẫu điện di
+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỷ lệ 1µl “loading dye” với 5 µl mẫu.
+ Cài đặt trương trình điện di ở 100-110V, 100-200mA, trong 30 phút
(khi vị trí vạch mẫu chạy được khoảng 2/3 gel).
Nhuộm gel


13

+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide
(nồng độ 30 µl/l) trong 15 phút.
+ Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.
2.5. Kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm
1985. Phản ứng PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lượng lớn bản sao của
gen trong một thời gian ngắn. Cơ sở của phản ứng PCR dựa trên tính chất
biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cở sở trình tự

của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA
polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA đích mong muốn. Từ thời điểm
DNA biến tính cho tới khi sợi DNA mới được tổng hợp gọi là một chu kỳ [3].
Phản ứng PCR khuếch đại gen đích mong muốn được lặp lại nhiều lần
các chu kỳ nhân gen, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo
thành sẽ tăng theo cấp số nhân.
Các bước chủ yếu của một chu kỳ PCR như sau:
Bước biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA tách đôi dưới tác dụng
của nhiệt độ. Bước này thường được tiến hành ở 94 – 950C sẽ làm đứt các liên
kết hydro của phân tử DNA, hay mạch DNA tách rời nhau thành hai mạch
đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến
1 phút.
Bước gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ thấp. Trong hỗn hợp
phản ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNAvừa tách khỏi nhau và hai loại
mồi. Mỗi loại mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo
nguyên tắc bổ sung. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài trình thự mồi,
thông thường nằm trong khoảng 45 – 600C và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.


14

Bước kéo dài: Nhiệt độ 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động
của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động
tổng hợp các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung
tổng hợp nên sợi DNA mới.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thường thực hiện
khoảng 20 – 40 chu kỳ [2].
2.6. Phương pháp xác định các trình tự nucleotide
Giải trình tự là phương pháp xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide
(adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với việc phát

triển phương pháp giải tình tự tự động việc xác định trình tự DNA của hệ gen
sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ
bản, cũng như trong các lĩnh vự chuẩn đoán hoặc pháp y.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp
dideoxynucleotide cải tiến của Sanger; đó là sử dụng các phân tử triphosphate
dideoxynucleotide (ddNTPs) như là các điểm kết thúc trong trong quá trình
tổng hợp chuỗi DNA. Các thành phần sử dụng trong phương pháp này đó là:
Mẫu DNA sợi đơn, DNA mồi, Enzyme taq-DNA polymerase, bốn loại
dNTPs, dung dịch đệm và có thêm một lượng nhỏ ddNTP (trong đó có một
loại đánh dấu bằng cách gắn với một phân tử huỳnh quang). Mẫu DNA được
chia thành bốn phản ứng riêng biệt có chứa tất cả bốn deoxynucleotides chuẩn
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) và polymerase DNA. Mỗi phản ứng chỉ được
thêm vào một trong bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP),
các dideoxynucleotide này bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí carbon số 3 và
carbon số 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn một ddNTP thì
không có nhóm 3’- OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp
không được tiếp tục kéo dài vì vậy phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [8]. Mỗi
ddNTP sử dụng được gắn với một phân tử huỳnh quang và mỗi nucleotide


15

cho một màu khác nhau. Các đoạn DNA thu được phân tách theo kích thước
bằng điện di trên cùng một ống mao quản. Các đoạn DNA khác nhau sẽ phân
tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh và các màu đi kèm.
Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser. Đọc trình tự DNA
bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát hiện và thông
tin này sẽ đượcchuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định được trình tự
của đoạn DNA [15].
2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch trong và ngoài nước

2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2010, Locke SA và cộng sự đã sử dụng mã vạch COI để phân biệt
Diplostomum spp (ấu trùng ký sinh trong mắt cá). Tiến hành thu thập được
497 mẫu ấu trùng từ mắt các loài cá của sông St. Lawrence ở Canada. Sử
dụng chỉ thị mã vạch ITS và COI để phân loại các loài gây bệnh nghiêm
trọng. Tuy nhiên kết quả cho thấy chỉ thị COI cho kết quả tốt hơn [13].
Năm 2012, Emre Keskin và cộng sự đã sử dụng tiểu đơn vị COI ty thể
để làm sáng tỏ tính đa dạng di truyền của các loài cá nước ngọt không phải
bản địa. Thông qua toàn bộ dữ liệu tìm thấy có 145 chuỗi COI, sự khác biệt
về mã vạch COI giữa các quần thể cùng loài thấp, đặc biệt đối với quần thể C.
gibelio, G. holbrooki và L. gibbsus lần lượt là 0,5%, 0,6% và 0,3%. Từ kết
quả nghiên cứu cho thấy phương pháp mã vạch DNA giúp nhận dạng ở cấp
độ loài và cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể, có thể được sử dụng để
quản lý hiệu quả các loài xâm lấn và các chiến lược bảo tồn với các loài bản
địa và đặc hữu [9].
Năm 2015, Joana Costa và cộng sự nghiên cứu hai mã vạch DNA là
ITS1 và matK để nhận biết 2 loài H. perforatum và H. androsaemum.
Hypericum perforatum nổi tiếng với các đặc tính chống viêm, chống trầm
cảm và chống virut, cũng như một chất chữa bệnh. Hypericum androsaemum


16

được sử dụng chủ yếu cho tính chất bảo vệ gan và lợi tiểu. Các kết quả phân
tích từ ITS1 và matK là cơ sở để phát triển các thử nghiệm PCR đặc hiệu
cho từng loài, kết hợp kỹ thuật HRM (High Resolution Melt analysis) góp
phần xây dựng cách tiếp cận đơn giản để phân biệt hai loài một cách đáng
tin cậy. Các vùng mã vạch đã thành công trong việc nhận dạng từng nhóm
đối tượng [11].
Năm 2015, Locke SA, và cộng sự sử dụng mã vạch DNA nghiên cứu

tính đa dạng của ấu trùng Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) trong
mắt cá nước ngọt. Những nghiên cứu hình thái học rất khó có thể có ích trong
việc xác định loài của loại ấu trùng này. Nghiên cứu được thực hiện cho hơn
2000 ấu trùng Diplostomidae từ Châu Phi, Trung Đông, Châu Âu, Châu Á và
châu Mỹ. Hai mươi hai loài Diplostomum, Tylodelphys và Austrodiplostomum
được phân biệt. Các mối liên kết vòng đời mới, hồ sơ địa lý, lưu trữ, và dữ
liệu di truyền đã được ghi nhận cho một số loài, bao gồm Tylodelphys
jenynsiae, Tylodelphys immer và Diplostomum ardeae [18].
Năm 2016, Mariana L. Lyra đã tiến hành nghiên cứu mã vạch DNA
trong đánh giá tính đa dạng di truyền và ước tính độ phong phú của các loài
lưỡng cư. Sử dụng vùng 5' của tiểu đơn vị oxidase (COI) để thu thập mã vạch
DNA. Các tác giả đã nghiên cứu điều kiện PCR mới và thử nghiệm mồi mới
(AnF1 + AnR1). Kết quả thấy nhiệt độ gia tăng trong phản ứng PCR cải thiện
đáng kể hiệu quả khuếch đại. Có thể khôi phục chuỗi COI đối với 100% loài
được phân tích. Đó là một cải tiến quan trọng đối với các nghiên cứu trước
đây. Kết luận chỉ ra rằng mã vạch DNA là một phương pháp hiệu quả, đơn
giản và được chuẩn hóa để xác định sự đa dạng bí ẩn ở động vật lưỡng cư và
sử dụng nó trong kiểm kê đa dạng sinh học và trên khắp quần thể rộng khắp
các loài đã biết [14].