TỔNG hợp và THỬ HOẠT TÍNH SINH học của một số dẫn CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ức CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

1

I. MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là
các histon deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về các HDAC đã xác định
hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư.
Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung
thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza ®, 2006) và
depsipeptid (Romidepsin®, 2009) là hai chất ức chế HDAC đã được Cục
quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị
u lympho da tế bào T. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng
đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm sàng như NVLLAQ824, MS-275, CI-994, PXD-101.... Các chất ức chế HDAC được
chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid
hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu
nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC
mạnh.
Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức
chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và
thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng
ức chế enzym histon deacetylase” được thực hiện với 2 mục tiêu:
2. Mục tiêu của luận án
1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid
hydroxamic mới hướng ức chế HDAC.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của
các chất tổng hợp được.
3. Những đóng góp mới của luận án
Về thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic
Đã thiết kế, tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 51 acid hydroxamic
mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được.
Về thử hoạt tính sinh học của các chất

Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot của 51 dẫn
chất cho thấy ở nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính. Với
hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở
nồng độ 1 µg/ml. Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 đối với các chất
9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với IC 50 mạnh hơn
SAHA từ 2 – 20 lần.
51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo
phương pháp MTT. Kết quả 15 chất đã có khả năng ức chế sự phát triển


2

tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm và chất 9b, 9g tác dụng tương
đương SAHA.
Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và ức chế HDAC
tốt được lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo. Thử nghiệm
trên mô hình ghép dị chủng trên chuột trụi lông với dòng tế bào ung thư
tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy ở nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức chế sự
phát triển khối u tương đương SAHA.
4. Bố cục luận án
Luận án có 152 trang, 28 bảng, 73 hình, 33 sơ đồ. Bố cục gồm các
phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (46 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội
dung và phương pháp nghiên cứu (10 trang), kết quả nghiên cứu (53
trang), bàn luận (41 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các
bài báo đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 92 tài liệu
tham khảo (7 trang) và 61 phụ lục (106 trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan đã trình bày về:
- Histon deacetylase (HDAC): phân loại, cấu trúc; mối liên quan giữa ung

thư và sự bất thường hoạt động của HDAC.
- Các chất ức chế HDAC: phân loại, cơ chế tác dụng và cấu trúc.
- Tổng hợp tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế
HDAC, đặc biệt chú trọng đến các hydroxamat và dẫn chất.
- Các phương pháp tạo liên kết amid, tổng hợp các acid hydroxamic.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
- Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam.
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ.
- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng
hưởng từ hạt nhân. Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy
điện di.
- Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế và tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic.
- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu
phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1HNMR, 13C-NMR).


3

- Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được và định
lượng tác dụng ức chế HDAC2 của một số chất.
- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vitro của các chất
tổng hợp được.
- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vivo của một chất
đại diện.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ

3.1.1. Nhóm các dẫn chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Gồm 6 dãy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f và chất 23 được
tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây:
a) Dãy 3a-f, 5a-f, 7a-f và 9a-h

b) Chất 23

c) Dãy 11a-d và 13a-f


4

3.1.2. Nhóm các dẫn chất của SAHA
Gồm 2 dãy dẫn chất 17a-c, f, h; 20a-f và chất 26 được tổng hợp theo
sơ đồ sau:
a) Dãy 17a-c, f, h và 20a-f

b) Chất 26

Bảng 3.13. Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án
TT

Chất

H (%)

Rf*

tnc (oC)

NHOH

51,2

0,58

250-251

NHOH

40,5

0,52

252-253

NHOH

40,6

0,46

215-216

NHOH

32,3

0,54

232-234

NHOH

51,1

0,34

330-331

NHOH

63,6

0,35

265-266

72,0

0,40

149-150

NHOH

68,0

0,40

180-182

NHOH

66,0

0,40

189-191

CTCT

Dãy các chất 3a-f
O

1

N

3a

N
H

S

O
O

2

N

3b

N
H

S

H3C

O

O

3

N

3c

N
H

S

H3CO

O

O

4

N

3d

N
H

S

C2H5O

O

O

5

N

3e

N
H

S

H3CO2S

O
O

6

N

3f

N
H

S

O2N

O

Dãy các chất 5a-f
O

7

O

N

5a

N
H

S

NHOH
O

8

N

5b
H3C

S

N
H

O

9

O

O

N

5c
H3CO

S

N
H


5
O

10

O

N

5d

N
H

S

C2H5O

O

11

65,0

0,41

176-177

NHOH

53,0

0,39

148-149

42,0

0,39

171-173

78,0

0,44

176-177

78,0

0,48

204-205

NHOH

84,0

0,41

189-190

NHOH

86,0

0,42

193-194

NHOH

74,0

0,39

220-221

NHOH

80,0

0,39

214-215

NHOH

83,3

0,42

176-177

80,9

0,45

204-205

90,3

0,43

189-190

83,3

0,46

193-194

90,5

0,40

220-221

NHOH

80,0

0,38

214-215

NHOH

78,0

0,37

196-198

75,0

0,40

186-187

90,6

0,39

178-180

NHOH

89,9

0,40

189-190

NHOH

74,5

0,42

194-196

68,5

0,38

182-184

N

5e

N
H

S

H3CO2S

O

12

NHOH

O

O

N

5f

N
H

S

O2 N

NHOH

Dãy các chất 7a-f
O

13

N

7a

NHOH
N
H

S

O
O

14

N

7b

NHOH

N
H

S

H3 C

O
O

15

N

7c

N
H

S

H3CO

O
O

16

N

7d

N
H

S

C2H5O

O
O

17

N

7e

N
H

S

H3CO2S

O
O

18

N

7f

N
H

S

O2N

O

Dãy các chất 9a-h
O

19

N

9a

N
H

S

O
O

20

N

9b

NHOH
N
H

S

H 3C

O

O

21

N

9c

NHOH
N
H

S

H3CO

O

O

22

N

9d

NHOH
N
H

S

C2H5O

O
O

23

N

9e

NHOH
N
H

S

H3CO2S

O

O

24

N

9f

N
H

S

O2N

O
O

25

N

9g

N
H

S

Cl

O
O

26

N

9h

NHOH
N
H

S

F3C

O

Dãy các chất 11a-d
O

27

N

11a

NH

N
H

S

NHOH

O

O

O

28

N

11b
H3 C

NH

N
H

S

O

O

O

29

N

11c
H3CO

NH

N
H

S

O

O

O

30

N

11d
C2H5O

S

NH

N
H
O

NHOH
O


6

Dãy các chất 13a-f
O

31

O

N

13a

S

N
H

S

0,39

194-195

NHOH

93,3

0,40

198-199

NHOH

88,2

0,40

186-187

85,0

0,36

210-211

50,0

0,31

230-231

34,4

0,30

197-198

NHOH

50,2

0,30

195-196

NHOH

42,1

0,32

189-190

79,1

0,27

205-206

36,5

0,28

195-197

50,5

0,37

189-191

51,2

0,27

173-174

42,2

0,29

172-173

42,0

0,31

162-163

63,0

0,29

128-130

55,0

0,34

178-179

56,0

0,32

175-176

NHOH

50,0

0,28

185-186

NHOH

47,8

0,37

166-167

81,5

0,41

187-188

O

13c

N
H

S

NH

O
O

O

N

13d

N
H

S

C2H5O

NH
O

O

O

N

13e

NHOH

N

H

S

H3CO2S

NH
O

O

36

82,4

NH
O

N

H3CO

35

NHOH

O

O

34

187-188

O
N

13b
H3C

33

0,36

NH
O

32

86,7

NHOH

N
H

O

N

13f

NHOH

N
H

S

O2 N

NH
O

Dãy các chất 17a-c, f, h
O

37

H
N

17a

O
N
H

NHOH

O

O

38

O

H
N

17b

N
H
O

F
O

39

O

H
N

17c

N

H
O

Cl
O

40

O

H
N

17f

N
H

NHOH

O
H3CO
O

41

O

H
N

17h

N
H

NHOH

O
NC

Dãy các chất 20a-h
O

42

H
N

20a

NH
O

NHOH

O
O

43

H
N

20b

NH
NHOH
O

O

F

O

44

H
N

20c

NH
O

NHOH

O

Cl

O

45

H
N

Cl

20d

NH
NHOH
O

O
O

Cl

46

H
N

20e

NH

O

NHOH

O
O

47

H
N

20f

NH
NHOH
O

O

H3 CO
O

48

H
N

20g

NH
NHOH
O

O

O2N

O

49

H
N

20h

NH
O

O

NC

O

50

N

23

S

N
H
O
O

51

O

H
N

26

N
H
O
Cl

NHOH


7

* Hệ dung môi sắc ký: DCM-MeOH-AcOH (90:10:1). Các chất 9a-h, 23, 26 hệ dung môi
sắc ký DCM-MeOH-AcOH (90:8:1). Dung môi kết tinh: Nước-HCl 5%.

3.2. Hoạt tính sinh học
3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá
gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế
bào ung thư đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western blot có thể
khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl
hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Thử nghiệm được tiến
hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Các chất
được đánh giá tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 10 µg/ml, nếu có tác
dụng thì tiếp tục được đánh giá ở nồng độ 1 µg/ml. Kết quả các chất 7a-f,
9a-h, chất 23 có tác dụng ức chế HDAC được trình bày trong bảng 3.14,
những chất còn lại không ức chế HDAC ở nồng độ 10 µg/ml.
Bảng 3.14. Tác dụng ức chế HDAC của một số chất tổng hợp
TT

Chất

Tác dụng ức chế HDAC
10 µg/ml
1 µg/ml
O

Các dẫn chất benzothiazol
R

Các chất có cầu nối 4C (m = 4)
1
7a (R = -H)
2

7b (R = -CH3)
3
7c (R = -OCH3)
4
7d (R = -OC2H5)
5
7e (R = -SO2CH3)
6
7f (R = -NO2)
Các chất có cầu nối 6C (m = 6)
7
9a (R = -H)
8
9b (R = -CH3)
9
9c (R = -OCH3)
10 9d (R = -OC2H5)
11 9e (R = -SO2CH3)
12 9f (R = -NO2)
13 9g (R = -Cl)
14 9h (R = -CF3)
15 23 (vòng thiazol)
SAHA**
* KT: Không thử; ** Chuẩn dương tính

* Nhận xét:

O

N

S

N
H

m

NHOH

+
+
+
+
-

-

+
+
+
+
+
+
+
+
+
KT

+

+
+
+
+
+
+
+


8

Kết quả phân tích Western blot cho thấy 4 chất mang khung
benzothiazol có cầu nối 4C (7a-d) ức chế HDAC ở nồng độ 10 µg/ml.
Với tác dụng mạnh hơn, hầu hết các chất mang khung benzothiazol cầu
nối 6C (9a-c, 9f-h) và chất 23 (cấu trúc vòng thiazol, cầu nối 6C) đều thể
hiện tác dụng ở nồng độ 1 µg/ml.
Dựa trên kết quả phân tích Western blot, các chất 9a-h và chất 23
được lựa chọn để định lượng tác dụng ức chế HDAC2. Kết quả IC 50 của
các chất 9a-h, 23 trên HDAC2 được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất
9a-h, 23
TT

Chất

1 9a (R = -H)
2 9b (R = -CH3)
3 9c (R = -OCH3)
4 9d (R = -OC2H5)
5 9e (R = -SO2CH3)

6 9f (R = -NO2)
7 9g (R = -Cl)
8 9h (R = -CF3)
9 23 (vòng thiazol)
SAHA

IC50
(µg/ml)
0,013
0,036
0,039
0,159
0,120
0,009
0,050
0,262
0,157
0,530

(µM)
0,040
0,107
0,102
0,435
0,300
0,024
0,140
0,673
0,578
2,005

KLPT
321,39
335,42
351,42
365,45
399,49
366,39
355,84
389,39
271,34
264,30

* Nhận xét:
Cả 9 chất đều có khả năng ức chế HDAC2 mạnh hơn cả SAHA với
giá trị IC50 từ 0,013 – 0,262 µg/ml.
3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các chất tổng hợp được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư
người trên dòng tế bào SW620 (ung thư đại tràng). Nếu có tác dụng
kháng dòng tế bào trên thì tiếp tục được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào
khác: MCF-7 (ung thư vú), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (ung
thư tụy), NCI-H460 (ung thư phổi). Thử nghiệm được tiến hành tại khoa
Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) theo phương pháp MTT.
Kết quả giá trị IC50 của các chất có hoạt tính (dãy 5, 7, 9 và chất 23) được
trình bày trong bảng 3.16. Những chất dãy 3, 11, 13, 17, 20 và chất 26
đều không kháng dòng tế bào SW620.
Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro
TT

Chất

IC50 (µg/ml)


9

SW620

MCF-7

PC-3

AsPC-1
O

N

Các dẫn chất benzothiazol
R

Các chất có cầu nối 3C (m = 3)
5a (R = -H)
>30
5b (R = -CH3)
18,96
5c (R = -OCH3)
20,65
5d (R = -OC2H5)
20,41
5e (R = -SO2CH3)

>100
5f (R = -NO2)
>30
Các chất có cầu nối 4C (m = 4)
7
7a (R = -H)
7,85
8
7b (R = -CH3)
4,69
9
7c (R = -OCH3)
9,07
10 7d (R = -OC2H5)
9,26
11 7e (R = -SO2CH3)
>30
12 7f (R = -NO2)
>30
Các chất có cầu nối 6C (m = 6)
13 9a (R = -H)
4,01
14 9b (R = -CH3)
0,56
15 9c (R = -OCH3)
0,96
16 9d (R = -OC2H5)
10,43
17 9e (R = -SO2CH3)
5,42

18 9f (R = -NO2)
0,29
19 9g (R = -Cl)
0,32
20 9h (R = -CF3)
0,35
21 23 (vòng thiazol)
2,55
0,50
SAHA
* KT: Không thử
1
2
3
4
5
6

NCI-H460

O

S

N
H

m

NHOH

KT
KT
KT
KT
KT
KT

KT
KT
KT
KT
KT
KT

KT
KT
KT
KT
KT
KT

KT
KT
KT
KT
KT
KT

4,02

4,27
5,91
8,72
>30
>30

12,51
6,23
15,29
6,69
>30
>30

10,19
13,33
23,93
16,70
>30
>30

14,41
10,97
21,41
7,96
>30
>30

6,61
1,60
1,85

11,61
15,35
3,83
1,45
0,78
5,47
0,13

5,44
0,53
1,56
16,89
5,69
1,28
0,82
2,91
4,15
0,94

5,69
0,54
0,79
9,88
13,52
1,65
0,34
2,20
2,10
0,69

5,71
0,84
1,25
6,58
6,54
1,90
0,39
1,28
4,24
0,68

* Nhận xét:
Kết quả cho thấy các chất 5b-d với cầu nối 3C bắt đầu có hoạt tính
nhưng yếu. Các chất cầu nối 4C, chất 7a-d tác dụng trên cả 5 dòng tế bào
thử nghiệm. Cầu nối 6C đã giúp mang lại hoạt tính tốt cho các chất 9a-h.
Trong đó, 5 chất 9b, 9c, 9f, 9g, 9h có hoạt tính trên cả 5 dòng tế bào (IC 50
từ 0,29 – 3,83 µg/ml). Đặc biệt chất 9g ức chế 4/5 dòng tế bào với giá trị
IC50 đều thấp hơn SAHA (0,32 – 0,82 µg/ml). Việc thay nhóm nhận diện
bề mặt bằng vòng thiazol với độ dài cầu nối 6C cũng thu được chất 23 có
tác dụng kháng 5 dòng tế bào thử nghiệm.
3.2.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo


10

Từ kết quả trên, chất 9g có hoạt tính tốt đã được lựa chọn để thử độc
tính in vivo. Thí nghiệm được tiến hành trên mô hình ghép dị chủng ở
chuột trụi lông, sử dụng dòng tế bào PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến người),
tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Hoạt tính
kháng tế bào ung thư được tính toán dựa trên phần trăm ức chế sự phát

triển khối u của mẫu thử ở liều xác định so với mẫu trắng đối chiếu. Kết
quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3.17. Sự thay đổi khối lượng của khối u trên chuột ở nhóm thử,
nhóm trắng đối chiếu và SAHA
Nhóm
(n=7)

Liều
(mg/kg)

Trắng

0
3
10
30
30

9g
SAHA

Thể tích khối u (mm3)
Ngày 1
0,0± 0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0

11

35,4±13,4
32,2±16,8
28,9±7,6
29,1±7,2
35,9±14,3

13
74,6±20,3
57,9±22,1
53,1±26,2
43,0±10,0b
44,7±13,1b

15
105,1±21,5
81,6±22,7
76,8±33,9
66,8±14,1b
70,7±14,6b

KL khối u
18
184,2± 40,3
143,2±32,7
121,1±49,1a
105,3±22,1c
111,6±21,8b

21
341,7± 88,5

266,6±58,1
205,9±58,9b
174,8±29,7c
179,6±31,8c

(mg)
733,4± 180,58
567,5± 232,20
429,5± 114,23b
374,0± 77,78c
379,2± 54,40c

* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng.

Để sơ bộ đánh giá độc tính trên động vật của mẫu thử, chuột được cân
để xác định sự thay đổi trọng lượng trong quá trình thí nghiệm (bảng
3.18).
Bảng 3.18. Phần trăm thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm
Nhóm
(n=7)

Liều
(mg/kg)

Trắng

0
3

9g

10
30

SAHA

30

Cân nặng thay đổi của các ngày thí nghiệm (%)
Ngày 1
100,0±
0,0
100,0±0
,0
100,0±
0,0
100,0±
0,0
100,0±
0,0

4
101,3
± 2,88
101,5
± 1,94
102,0
± 4,35
99,6±
4,57

102,5
± 2,88

6
103,5
± 2,45
101,6
± 3,38
103,6
± 3,70
101,4
± 4,10
105,8
± 4,31

8
102,9
± 2,34
100,6
± 3,41
100,3
± 4,11
103,9
± 6,49
105,4
± 6,40

11
103,1
± 2,99

102,1
± 3,80
102,5
± 3,49
104,0
± 5,32
105,9
± 5,69

13
106,6
± 3,25
102,7
± 4,40
105,1
± 4,50
102,9
± 5,45
108,9
± 8,25

15
107,4±
1,79
103,9±
4,34
104,9±
5,35
103,0±
4,51a

106,7±
7,37

18
113,8±
2,61
105,9±
3,98c
105,9±
3,97c
106,7±
5,11b
108,8±
9,15

* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng.

* Nhận xét:
Kết quả sau 21 ngày, với liều 30 mg/kg, chất 9g ức chế sự phát triển
khối u tương đương SAHA (bảng 3.17). Mặc dù, cân nặng của chuột ở
nhóm thử giảm nhẹ, tuy nhiên không ghi nhận độc tính nghiêm trọng nào
của nhóm thử so với nhóm trắng và không con chuột nào chết trong quá
trình thí nghiệm.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Tổng hợp hóa học

21
114,7±
1,43
109,4±

3,14b
106,8±
5,45b
108,5±
5,42a
110,4±
9,79


11

Phản ứng tổng hợp 51 chất trong luận án là phản ứng thế ái nhân acyl
với tác nhân thế ái nhân là nhóm amin. Trong luận án này, một số tác
nhân acyl hóa được sử dụng là acid carboxylic, anhydrid acid và ester.
4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid
Đây là tác nhân acyl hóa mạnh, dùng để tổng hợp chất 2a-f, 4a-f, 15ac, 15f, 15h, 18a-h tạo các acid carboxylic, là chất trung gian trong quá
trình tổng hợp các dãy chất 3, 5, 11, 13, 17 và 20 (sơ đồ 4.1).
O

N

O

N

Ar =

C
Ar

NH2

+

OH

O

Ar

DMF

S

R

N
H

2a-f
O

C

Ar = R

O
15a,b,c,f,h

O

Ar

NH2

+

O

N

N

O

Ar =

C

S

R

Ar

DMF

O

N
H

OH

C

4a-f
Ar = R

O
18a-h

Sơ đồ 4.1. Tổng hợp các chất trung gian 2a-f, 4a-f, 15a-c, f, h, 18a-h
Phản ứng sử dụng anhydrid succinic hoặc anhydrid glutaric với xúc
tác pyridin. Lượng anhydrid acid có thể dùng dư và dễ dàng loại bỏ do
tan tốt trong nước. Với các chất chứa vòng benzothiazol, hiệu suất phản
ứng từ 66,0-88,0%. Đối với các dẫn chất anilin, hiệu suất 50,2–96,9%.
4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic
Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa trung bình. Trong phản ứng tạo
các chất 3a-f và 5a-f (sơ đồ 4.2), các acid carboxylic trung gian phản ứng
với hydroxylamin không phải là tác nhân ái nhân mạnh nên phản ứng
khó xảy ra.
O

O

O

R

S

O

N

N
N
H

2a-f (m=2)
4a-f (m=3)

m

OH
R

S

N
H

3a-f (m=2)
5a-f (m=3)

m

NHOH

a, R = -H

b, R = -CH3
c, R = -OCH3
d, R = -OC2H5
e, R = -SO2CH3
f, R = -NO2

Sơ đồ 4.2. Tổng hợp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f
Để hoạt hóa acid carboxylic, một số chất được lựa chọn để tạo tác
nhân hoạt hóa ngay trong phản ứng bằng cách tạo anhydrid hoạt hóa.
N,N’-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) là chất hoạt hóa nhóm carboxyl rất
hiệu quả trong tổng hợp peptid và là hóa chất sẵn có, rẻ tiền. Vì vậy,
DCC là lựa chọn đầu tiên để tổng hợp thử acid hydroxamic 3a-f từ acid
carboxylic. Tuy nhiên, kết quả tổng hợp thử cho thấy phản ứng xảy ra
không hoàn toàn. Vì vậy, tác nhân isobutyl cloroformat được lựa chọn để
tiến hành tổng hợp thử các chất 3a-f. Kết quả sau nhiều lần tổng hợp đều


12

chỉ thu được vết sản phẩm. Sau khi tham khảo tài liệu, tác nhân hoạt hóa
khác là N,N’-carbonyldiimidazol (CDI) được lựa chọn. Kết quả tổng hợp
cho thấy phản ứng xảy ra hoàn toàn, không còn vết nguyên liệu ban đầu
(sơ đồ 4.6). Ưu điểm của việc sử dụng CDI là sản phẩm thu được khá
tinh khiết, quá trình tinh chế đơn giản do imidazol tạo thành và CDI dư
tan trong nước nên dễ dàng loại ra khỏi sản phẩm.

Sơ đồ 4.6. Tổng hợp 3a-f sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI
CDI được dùng làm tác nhân hoạt hóa cho các phản ứng tạo liên kết
amid. Các chất 3a-f, 5a-e được tổng hợp (hiệu suất 32,3 – 72,0%).
Riêng chất 5f phải tổng hợp bằng phản ứng giữa acid carboxylic với

hydroxylamin đã được bảo vệ nhóm OH. Đây là phương pháp rất hay
được sử dụng. Tuy nhiên, giá thành các hydroxylamin có chứa nhóm bảo
vệ rất cao. Lựa chọn NH2OTHP làm tác nhân ái nhân cho phản ứng tổng
hợp acid hydroxamic 5f (sơ đồ 4.7). Sau khi sản phẩm trung gian được
tạo thành, loại bỏ nhóm bảo vệ -OH bằng phản ứng thủy phân với acid
para-toluensulfonic thu được acid hydroxamic 5f (hiệu suất 42%).
O

O

O

O

N

O2N

S

O

N
N
H

3

ONH2

OH

CDI, Et3N, DMF

S

O2N

4f
O

N
H

3

NHOTHP

O

N

pTSA/ DMF
O2N

N
H

S

3

NHOH

5f

Sơ đồ 4.7. Tổng hợp acid hydroxamic 5f
Sau khi lựa chọn được CDI làm tác nhân hoạt hóa cho phản ứng tổng
hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic, một loạt các phản ứng tạo liên
kết amid để tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất 7, 9, 11, 13,
17 và 20 và chất 22 được tiến hành cũng dùng CDI.
4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester
Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin chỉ
xảy ra ở pH > 10. Phương pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và
ester trong alcol. Qua tham khảo tài liệu và để phù hợp với khả năng hòa


13

tan trong dung môi của các chất, phản ứng tổng hợp các chất dãy 7, 9, 11,
13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester và hydroxylamin được tiến hành với
xúc tác NaOH, dung môi methanol (một số chất khó tan thì sử dụng hỗn
hợp dung môi MeOH - DMF) ở 0 oC trong thời gian từ 30 phút đến 1giờ
30 phút. Phản ứng diễn ra nhanh với hiệu suất 34,4 – 93,3%.
4.2. Khẳng định cấu trúc
51 chất trong luận án đều được nhận dạng cấu trúc bằng các phương
pháp phổ hồng ngoại (IR), phổi khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR). Sau đây là một số bàn luận về việc nhận
dạng cấu trúc thông qua các dữ liệu phổ.
4.2.1. Phổ hồng ngoại

Việc phân tích phổ hồng ngoại trong luận án chủ yếu tập trung vào
vùng nhóm chức để xác định sản phẩm phản ứng đã tạo thành với các
nhóm chức đặc trưng.
- 51 chất đều là acid hydroxamic nên đều có vân hấp thụ của dao động
hóa trị O-H acid mạnh và tù từ 3500 - 2400 cm-1.
- Toàn bộ 51 chất trong cấu trúc có 2 hoặc 3 liên kết -NH-CO- nên trong
phổ đồ một số chất xuất hiện 2 - 3 vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H
amid cũng như vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O amid (5a, 5b, 5e,
5f, 7b-7e, 9b, 9e, 9g, 11a, 11b, 13b, 13c, 17f, 20b, 20g, 20h), còn một số
chỉ xuất hiện 1 vân hấp thụ của νNH, 1 vân hấp thụ νC=O (3a-3f, 5c, 9c, 9d,
9h). Dao động νNH có số sóng từ 3361–3124 cm -1. Dao động νC=O có số
sóng từ 1707–1625 cm-1.
- Cầu nối alkyl cũng cho thấy sự có mặt với dao động hóa trị bất đối
xứng CH2 từ 2993–2912 cm-1 và dao động đối xứng từ 2875–2789 cm-1.
Bên cạnh đó, phổ đồ hồng ngoại còn thể hiện sự có mặt của các nhóm
thế gắn trên vòng benzothiazol hay vòng phenyl.
4.2.2. Phổ khối lượng
Quá trình phân tích phổ khối được thực hiện qua 2 bước: phân tích
cụm pic ion phân tử và biện giải các phân mảnh xuất hiện trên phổ đồ.
4.2.2.1. Phân tích cụm pic ion phân tử
Pic ion phân tử của các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch
riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn
tại các đồng vị như 13C là đồng vị của 12C, 2H là đồng vị của 1H, 33S, 34S là
đồng vị của 32S, 15N là đồng vị của 14N, 37Cl là đồng vị của 35C, 18O là
đồng vị của 16O... Bởi vậy, bên cạnh vạch chính ứng với [M+H] + (hoặc
[M-H]-) còn có các vạch [M+H+1] + (hoặc [M-H+1]- = M-), [M+H+2]+,
[M+H+3]+...là các vạch được tạo nên bởi các nguyên tử đồng vị có số
khối lớn hơn 1 đvk (13C), 2 đvk (34S) so với nguyên tử bền (12C), (32S). Sự

14

có mặt của các pic đồng vị giúp tính toán công thức cộng của hợp chất và
kiểm tra sự phù hợp giữa CTPT dự kiến với CTPT trên phổ đồ. Qua phân
tích cụm pic ion phân tử của các dẫn chất có thể nhận thấy hầu hết kết
quả chỉ sai lệch không quá 5% so với cường độ lý thuyết tương ứng.
Điều đó cho phép kết luận, các dẫn chất tổng hợp có CTPT phù hợp với
CTPT dự kiến.

Hình 4.5. Phổ khối lượng của chất 7a
4.2.2.2. Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến
Lựa chọn chất 20f làm đại diện để xây dựng cơ chế phá mảnh theo
cấu trúc dự kiến. Cơ chế phá mảnh của 20f được xây dựng cho 5 cụm pic
mảnh m1, m2, m3, m4, m5 là những cụm pic có cường độ tương đối đủ lớn
(> 9% so với pic cơ bản).


15

Sơ đồ 4.14. Sơ đồ phá mảnh của chất 20f
Sự tạo thành 5 mảnh vỡ của 20f là hoàn toàn phù hợp với cơ chế phá
mảnh theo chế độ bắn phá ESI (+) và cấu trúc phân tử dự kiến.
4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Cùng với dữ liệu phổ hồng ngoại và phổ khối, 51 chất tổng hợp còn
được đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR để khẳng định chính xác cấu trúc.
4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
khung benzothiazol
Phổ đồ của các dãy 3, 5, 7, 9, 11 và 13 đều thể hiện sự có mặt của
khung benzothiazol, cầu nối alkyl với đầy đủ tín hiệu proton và carbon.
* Phổ 1H-NMR:

Khung benzothiazol có các proton ở vị trí 4’, 5’, 6’ và 7’ được xác
định rõ ràng trên phổ đồ. H-4’ có δ trong khoảng 7,60-7,99 ppm, vân phổ
dạng doublet, hằng số tương tác JH4’-H5’(ortho) = 7,5–9,0 Hz. H-5’có δ từ
7,00–8,27 ppm, vân phổ có dạng doublet (d) (Jortho=7,5–9,0 Hz), một số


16

chất quan sát thấy cả tương tác với H-7’ nên vân phổ dạng doublet of
doublets (dd) (Jmeta= 2,0–2,5 Hz). Các chất không có nhóm thế R (3a, 5a,
7a, 9a, 11a và 13a), H-5’ có thể có vân phổ dạng triplet (t) hoặc dạng
doublet of triplets (dt) (hình 4.7), còn H-7’ có δ=7,72 ppm, vân phổ dạng
doublet, Jortho = 8,0 Hz. Ở các chất có nhóm thế R ở 6’, tính chất hút đẩy
điện tử của nhóm thế có ảnh hưởng đến độ chuyển dịch hóa học cũng
như dạng vân phổ của H-7’. H-6’ chỉ có ở 6 chất không gắn nhóm thế với
δ=7,42 ppm, vân phổ dạng triplet hoặc dạng doublet of triplets.

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất 5a
Một nhóm các proton quan trọng khác trong cấu trúc là các proton
mạch nhánh. Hầu hết các chất đều có đủ số proton mạch nhánh với độ
dịch chuyển hóa học của các nhóm -CH2- trong khoảng 1,23–3,73 ppm.
Cấu trúc của các chất còn nhóm chức hydroxamic và liên kết amid
nên còn quan sát thấy sự có mặt của proton -NH (δ=10,30–12,77 ppm),
-OH acid (δ=8,62–8,78 ppm). H của –NHCO- vị trí 1 sẽ cộng hưởng ở
trường yếu nhất với độ dịch chuyển hóa học khoảng 12,13–12,77 ppm.
Đó là do hiệu ứng hút điện tử mạnh của vòng benzothiazol làm hạt nhân
bị giảm sự chắn tại chỗ. Trong dung môi không proton như DMSO, H
của N-H hoạt động như là proton acid hơn là N-OH. Do linh động hơn
nên -NH cộng hưởng ở trường yếu hơn (δ=10,31–10,44 ppm). Còn H của
–OH có độ dịch chuyển hóa học là 8,66 ppm. Tuy nhiên, các proton này

linh động và dễ bị trao đổi hoặc hỗ biến nên ở một số chất cho tín hiệu
-NH, -OH rất yếu (3a, 3b, 5e) hoặc không cho tín hiệu trên phổ đồ (3e,
3f, 7f, 7c, 13f).
Các dẫn chất có nhóm thế chứa proton như -CH 3, -OCH3, -OC2H5,
-SO2CH3 đều cho tín hiệu của các proton trong nhóm thế.


17

* Phổ 13C-NMR:
Carbon trong nhóm C=O có δ=165,91–173,01 ppm. 7 carbon của
khung benzothiazol có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng
104,67–165,94 ppm. Cầu nối alkyl cho tín hiệu của carbon khoảng
20,30–35,30 ppm. Phổ đồ các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hưởng của
các carbon có trên nhóm thế. Riêng chất 9h có gắn nhóm thế -CF3 nên
còn xuất hiện tương tác C-F ở 123,71 và 123,46 ppm với hằng số tương
tác J = 31,87 Hz.
Tóm lại, dữ liệu các phổ thực nghiệm cho phép khẳng định cấu trúc
các chất dãy 3, 5, 7, 9, 11 và 13 đúng như dự kiến và sản phẩm tinh khiết.
4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
vòng phenyl
* Phổ 1H-NMR:
Ở các chất không có nhóm thế R (17a, 20a) hoặc nhóm thế ở vị trí 4R (17b, 17c, 17f, 17h, 20b, 20c, 20f-20h, 26), H-2’ và H-6’ cũng như H3’ và H-5’ có tính chất đối xứng nên từng cặp H-2’ và H-6’; H-3’ và H-5’
sẽ có cùng độ dịch chuyển hóa học và tùy thuộc bản chất nhóm thế sẽ
làm thay đổi δ. Các chất 20d, 20c có nhóm thế 3-Cl và 2-Cl nên không
còn cấu trúc đối xứng, phổ đồ cho đủ tín hiệu proton còn lại của vòng
phenyl trong khoảng 7,07 – 7,82 ppm với vị trí cộng hưởng tùy thuộc vào
ảnh hưởng của nguyên tử Cl.
Phần mạch nhánh alkyl cho đầy đủ tín hiệu của các nhóm -CH 2- với
dạng vân phổ triplet hoặc mutiplet (m), δ=1,78-3,27 ppm. Độ dịch

chuyển hóa học của proton -OH acid cũng giống như các chất dãy 11 và
13, khoảng 8,69–8,80 ppm. Điểm khác biệt là do hiệu ứng hút e của vòng
phenyl yếu hơn vòng benzothiazol nên H trong -NHCO- vị trí 1 cộng
hưởng ở trường mạnh hơn (δ=9,48-10,35 ppm). H của nhóm -NHCOnằm giữa cầu nối alkyl do có tương tác với 2 proton của -CH 2- bên cạnh
nên vân phổ dạng triplet, δ=7,90–8,08 ppm, J = 5,5-6,5 Hz.
* Phổ 13C-NMR:
Độ dịch chuyển hóa học của carbon nhóm C=O và phần cầu nối alkyl
trong các chất dãy 17 và 20, chất 26 tương tự như của các acid
hydroxamic mang khung benzothiazol (phần 4.2.3.1). Về vòng phenyl,
tương tự phổ 1H-NMR, các chất 17a, 20a và các chất có nhóm thế 4-R,
do cấu trúc có trục đối xứng nên các carbon C2’ và C6’, C3’ và C5’ đối
xứng và có cùng độ dịch chuyển hóa học trên phổ đồ, cường độ tín hiệu
mạnh. Hai chất 17b, 20b có nhóm thế 4-F nên còn xuất hiện tương tác
C4’-F và ảnh hưởng từ trường của flo làm tách đôi tín hiệu của các
carbon C3’ và C5’, C2’ và C6’ (hình 4.14).


18

Hình 4.14. Phổ 13C-NMR dãn rộng của chất 20b
Từ kết quả biện luận các loại phổ đồ, có thể khẳng định các chất 17ac, f, h và 20a-h có cấu trúc đúng như dự kiến và sản phẩm tinh khiết.
4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của acid hydroxamic mang vòng
thiazol
Chất 23 mang vòng thiazol được thiết kế với mục đích khảo sát ảnh
hưởng của nhóm nhận diện bề mặt đến hoạt tính sinh học. Kết quả các dữ
liệu phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 23 cho thấy xuất
hiện đầy đủ tín hiệu của proton cũng như carbon trong cấu trúc. Kết quả
cho phép khẳng định chất 23 đã được tổng hợp và sản phẩm tinh khiết.
4.3. Hoạt tính sinh học
Dựa trên cấu trúc của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA), 51

dẫn chất acid hydroxamic của luận án được thiết kế với đích tác dụng
hướng ức chế HDAC.
4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Từ cấu trúc của SAHA và qua tham khảo nhiều bài báo, dãy dẫn chất
đầu tiên được tổng hợp có cấu trúc nhân phenyl thay bằng vòng
benzothiazol. Do nhóm khóa hoạt động thay đổi nên phải khảo sát xác
định độ dài thích hợp của phần cầu nối. Lựa chọn độ dài cầu nối đầu tiên
là 2 carbon (chất 3a-f). Kết quả phân tích Western blot để xác định khả
năng ức chế HDAC ở nồng độ 10 µg/ml cho thấy các chất 3a-f không có
tác dụng đồng thời cũng không gây độc trên dòng tế bào SW620 thử
nghiệm. Như vậy, có lẽ mạch 2 carbon còn ngắn nên độ dài cầu nối tăng
thành 3, 4 carbon thu được các dẫn chất 5a-f, 7a-f. Kết quả Western blot
cho thấy các chất 7a-d đã có tác dụng ở nồng độ 10 µg/ml. Đối với hoạt


19

SA
HA

tính kháng dòng tế bào ung thư người, các chất 5a-f cầu nối 3C đã bắt
đầu có hoạt tính nhưng còn yếu (bảng 3.16). Với các chất cầu nối 4C, độc
tính tế bào đã được cải thiện. Các chất 7a-d có tác dụng ức chế trên cả 5
dòng tế bào. Như vậy, chất 7a-d có ức chế HDAC bằng thử nghiệm
Western blot, đồng thời ức chế sự phát triển của cả 5 dòng tế bào. Từ mối
tương quan này có thể đưa ra nhận xét bước đầu rằng cơ chế gây độc tế
bào của các acid benzothiazol-hydroxamic này là do ức chế HDAC.
Tiếp tục kéo dài mạch thành 6C (cầu nối tương tự SAHA), tổng hợp
được 8 dẫn chất 9a-h. Ở nồng độ 1 µg/ml, hầu hết các chất đều thể hiện
tác dụng ức chế HDAC, minh họa bằng hình ảnh điện di trên gel của 6

chất 9a-f (hình 4.20).
Trắng 9a 9b 9c 9d 9e 9f
Acetyl-histone-H3
17kDa
Acetyl-histone-H4

11kDa

GAPDH

Hình 4.20. Kết quả phân tích Western blot của các chất 9a-f
Kết quả thử độc tính tế bào in vitro cũng khá tương đồng với tác dụng
ức chế HDAC. Chất 9a không có nhóm thế trên vòng benzothiazol ức
chế 5 dòng tế bào với giá trị IC 50 4,01-6,61 µg/ml. Khi gắn nhóm thế vào
vị trí số 6 trên vòng benzothiazol, hoạt tính tăng lên rõ rệt. Các chất có
nhóm thế đẩy điện tử như -CH3, -OCH3 cho tác dụng mạnh hơn so với
chất 9a. Chất 9b (nhóm thế 6-CH3) cho giá trị IC50 trên 4 dòng tế bào
tương đương SAHA (bảng 3.16). Chất 9g (nhóm thế 6-Cl) cho hoạt tính
mạnh nhất. Trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460, 9g có tác
dụng mạnh gần gấp đôi so với SAHA, giá trị IC 50 = 0,32; 0,34; 0,39
µg/ml (tương ứng với từng dòng tế bào) so với của SAHA là 0,50; 0,69;
0,68 µg/ml. Với dòng PC-3, tác dụng gần tương đương nhau với IC 50 (9g)
= 0,82 µg/ml và IC50 (SAHA) = 0,94 µg/ml. Nhìn vào bảng độc tính tế
bào nhận thấy tất cả 8 chất đều tác dụng trên MCF-7 yếu hơn SAHA từ 6
lần trở lên. Có lẽ là do dòng tế bào MCF-7 nhạy cảm hơn với SAHA.
Bên cạnh đó, chất có nhóm thế hút điện tử như 9f (nhóm -NO2) cũng cho
hoạt tính tốt, đặc biệt trên dòng SW620, 9f tác dụng mạnh hơn cả SAHA.
Tuy nhiên, chất có nhóm hút điện tử khác là –SO 2CH3 (9e) và chất có
nhóm đẩy điện tử -OC2H5 (9d) cho kết quả âm tính trên thử nghiệm
Western blot, độc tính trên 5 dòng tế bào cũng rất kém. Hoạt tính ức chế

sự phát triển tế bào của 2 chất này yếu hơn cả 9a là chất không gắn nhóm


20

thế. Như vậy, việc gắn các nhóm thế nhỏ vào vị trí 6 trên vòng
benzothiazol đem lại hoạt tính tốt. Các nhóm thế cồng kềnh có vẻ không
thích hợp cho tương tác với phần vành của túi enzym, từ đó dẫn đến giảm
hoạt tính ức chế HDAC và ức chế sự phát triển tế bào. Mặt khác, không
quan sát thấy ảnh hưởng của tính chất hút - đẩy điện tử của các nhóm thế
đến hoạt tính sinh học của các acid benzothiazol-hydroxamic.
Lựa chọn được độ dài cầu nối, tổng hợp chất 23 có vòng thiazol thay
cho vòng benzothiazol. Độc tính của chất 23 trên 5 dòng tế bào thử
nghiệm đều lớn hơn so với chất 9a (bảng 3.16).
Từ kết quả thử hoạt tính sinh học có thể thấy các acid benzothiazolhydroxamic cầu nối 6 carbon cho tác dụng tốt nhất. Điều này một lần nữa
khẳng định sự phù hợp của vòng benzothiazol cho vai trò nhóm khóa
hoạt động và cầu nối 6 carbon trong thiết kế các acid hydroxamic hướng
ức chế HDAC của luận án.
4.3.2. Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid
Qua tham khảo nhiều bài báo, việc thay đổi cầu nối alkyl cũng là
hướng tổng hợp được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm. Việc đưa dị tố
vào cầu nối alkyl đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện nhưng dị tố
N chưa được nhóm nghiên cứu nào sử dụng. Vì vậy, từ các acid
hydroxamic 9a-h, giữ nguyên vòng benzothiazol, thiết kế thay hai nhóm
methylen ở cầu nối bằng liên kết amid, thu được các chất 11a-d và 13a-f.
Song song, các dẫn chất 17 và 20 với cầu nối giống hệt các chất 11a-d
và 13a-f được tổng hợp nhưng nhân phenyl với các nhóm thế khác nhau
đóng vai trò nhóm khóa hoạt động. Nói cách khác, các dẫn chất 17 và 20
là dẫn chất của SAHA với cầu nối đưa liên kết amid vào thay cho 2 nhóm
methylen. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC bằng Western blot ở nồng

độ 10 µg/ml cho thấy các dẫn chất của 4 dãy trên đều không ức chế
HDAC nên histon H3, H4 đều bị deacetyl hóa. Trên hình ảnh điện di gel
không còn quan sát thấy acetyl histon H3, H4 (hình 4.24).

Hình 4.24. Kết quả phân tích Western blot của một số chất đại
diện dãy 13 và 20


21

Tương đồng với tác dụng ức chế HDAC, thử nghiệm trên dòng tế bào
SW620 của các dẫn chất cả 4 dãy đều không có hoạt tính với giá trị IC 50
lớn hơn 30 µg/ml. Xét về cấu trúc, dãy 17 và 20 khá tương đồng với
SAHA. Tuy nhiên, liên kết C-C có độ dài 1,5Å trong khi liên kết C-N độ
dài ngắn hơn khoảng 1,35Å. Do đó, việc thay liên kết -CH 2-CH2- bằng
liên kết amid -CONH- làm độ dài cầu nối ngắn lại. Có thể điều đó dẫn
đến giảm hoạt tính của các chất. Theo hướng giả thuyết đó, chất 26 được
tổng hợp với cầu nối vẫn có 1 liên kết amid nhưng độ dài mạch tăng
thêm 2 nhóm methylen. Tuy nhiên, chất 26 vẫn không ức chế HDAC
đồng thời không kháng dòng tế bào SW620. Như vậy, độ dài cầu nối
không phải là yếu tố chính làm giảm hoạt tính mà có lẽ sự có mặt của
liên kết amid là yếu tố gây nên sự giảm hoạt tính này. Liên kết amid làm
cho mạch alkyl phân cực hơn trong khi kênh enzym thân dầu đồng thời
tạo liên kết hydro với các acid amin của phần vành trên miệng túi enzym.
Như vậy, thực chất phần cầu nối bị ngắn lại, nhóm chức -NHOH không
đến gần được ion Zn2+ trong trung tâm hoạt động nên không ức chế được
HDAC và do đó cũng không gây độc với tế bào.
Như vậy, thay thế cấu trúc của phần cầu nối bằng cách đưa thêm liên
kết amid mang lại cấu trúc không thuận lợi cho hoạt tính nên không thu
được các chất ức chế HDAC như mong đợi.

4.3.3. Docking
Để bước đầu lý giải sự khác nhau về tác dụng ức chế HDAC của các
hợp chất do ảnh hưởng của cấu trúc, các chất 9a-h, 23 được tiến hành
docking, sử dụng chương trình AutoDock Vina. Phân tích docking được
tiến hành với HDAC8. Tiến hành docking độc lập SAHA, các chất 9a-h
và chất 23 với HDAC8 cho thấy các hợp chất này gắn kết với ái lực khác
nhau vào trung tâm hoạt động của protein này (bảng 4.6). Kết quả cho
thấy các chất đều có ái lực với HDAC8 mạnh hơn so với SAHA. Tuy
nhiên, nhìn vào hình ảnh docking của các chất so với SAHA vào HDAC8
thấy rằng cấu trúc của nhóm khóa hoạt động khác nhau làm thuận lợi hay
cản trở nhóm hydroxamat tiến gần đến ion Zn 2+. Chất không có nhóm thế
(9a) hoặc có nhóm thế nhỏ trên vòng benzothiazol như -CH 3 (9b), -OCH3
(9c), -Cl (9g), -CF3 (9h), nhóm hydroxamic tiến được gần đến ion Zn 2+ ở
trung tâm hoạt động nên ức chế HDAC mạnh. Trong khi đó, nhóm thế
cồng kềnh gắn vào vòng benzothiazol làm phần cầu nối methylen bị vặn
xoắn, kéo nhóm hydroxamat ra xa ion Zn2+ hơn so với SAHA. Do đó,
hoạt tính ức chế HDAC của các chất 9d, 9e yếu hơn các chất nhóm thế
nhỏ. Vòng benzothiazol của các chất 9b, 9g, 9h tiến sâu hơn vào túi
enzym, nơi mà nó có thể tương tác kỵ nước nhiều hơn với các acid amin


22

của túi. Chính các tương tác thêm này có thể giải thích cho hoạt lực mạnh
hơn của các chất 9b, 9g, 9h so với SAHA và các chất khác trong cùng
dãy 9. Ngoài ra, khi thay vòng benzothiazol bằng vòng thiazol, chất 23
có hình ảnh docking vào túi enzym tương tự SAHA. Vì vậy, ái lực với
HDAC8 yếu hơn một số chất dãy 9.
Bảng 4.6. Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC
TT

1
2
3
4
5

Chất
9a
9b
9c
9d
9e

R
-H
-CH3
-OCH3
-OC2H5
-SO2CH3

kcal/mol
-6,4
-6,1
-6,1
-6,0
-4,7

TT
6
7

8
9
10

Chất
9f
9g
9h
23
SAHA

R
-NO2
-Cl
-CF3

kcal/mol
-5,4
-6,7
-6,8
-5,5
-4,4

Kết quả docking cũng phù hợp với kết quả hoạt tính ức chế HDAC và
độc tính tế bào của các chất. Dựa trên kết quả đạt được, có thể khẳng
định vòng benzothiazol gắn nhóm thế nhỏ phù hợp cho vai trò là nhóm
khóa hoạt động thay cho nhân phenyl của SAHA.
4.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo
Chất 9g có hoạt tính tốt nhất nên được lựa chọn thử độc tính in vivo
trên tế bào ung thư PC-3. Phần trăm ức chế sự phát triển của khối u của

mẫu thử ở liều khác nhau được xác định dựa trên so sánh với mẫu trắng
đối chiếu. Kết quả ở liều 30 mg/kg, chất 9g ức chế 49,00% sự phát triển
của khối u, tương đương với SAHA (48,30%) (bảng 4.7, hình 4.29).
Bảng 4.7. Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất 9g ở các
liều khác nhau với dòng tế bào ung thư PC-3
Thay đổi cân
Tỷ lệ ức chế
Khối lượng
nặng của chuột
phát triển
khối u (mg)
d
(%)
khối u (%)
Trắng
0
7
114,7± 1,43
733,4±180,5
3
7
109,4± 3,14b
567,5±232,2
22,65
b
b
9g
10
7
106,8± 5,45

429,5±114,2
41,44
30
7
108,5± 5,42a
374,0±77,7c
49,00
SAHA
30
7
110,4± 9,79
379,2±54,4c
48,30
* Chú thích:(t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với nhóm trắng đối chiếu; d:
Cân nặng sau 21 ngày thí nghiệm.
Chất

Liều
(mg/kg)

Số chuột/thí
nghiệm (con)


23

Hình 4.29. Sự thay đổi kích thước khối u trung bình của nhóm thử so với SAHA

Để sơ bộ đánh giá độc tính của chất 9g trên động vật, cân nặng của
chuột được theo dõi trong toàn bộ quá trình thí nghiệm (hình 4.28). Kết

quả không quan sát thấy độc tính nghiêm trọng nào và các nhóm đều
không có chuột chết trên trong quá trình thí nghiệm.

Hình 4.30. Sự thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm
Tóm lại, kết quả trên cho thấy 9g cần được nghiên cứu sâu hơn và rất
có triển vọng để trở thành ứng viên thử nghiệm lâm sàng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1) Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc của các chất
Đã tổng hợp được 51 dẫn chất acid hydroxamic mới, chưa thấy công
bố trong các tài liệu tham khảo được. 51 dẫn chất này được chia thành 2
nhóm cấu trúc:
- Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol (dãy chất 3, 5, 7, 9,
11 và 13) (36 chất) có cấu trúc vòng thơm là khung benzothiazol, độ dài
cầu nối giữa vòng thơm và nhóm chức acid hydroxamic thay đổi từ 2 - 6
carbon.


24

- Các acid hydroxamic có vòng thơm là nhân phenyl gắn các nhóm
thế khác nhau (dãy 17 và 20) (13 chất), chất 26, cầu nối có độ dài tương
tự SAHA nhưng 1 liên kết amid được đưa vào thay cho 2 nhóm -CH2-.
- Để khảo sát ảnh hưởng của vòng benzen liên hợp đến hoạt tính, chất
23 được thiết kế, vòng thơm là vòng thiazol, độ dài cầu nối 6 carbon.
Đã khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp nhờ phân tích các dữ
liệu của phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ HMBC.
2) Về thử hoạt tính sinh học của các chất
- Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot cho thấy ở

nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-f, 9a-h có hoạt tính. Kết quả thể hiện bằng
sự không xuất hiện của các dải protein acetyl histon H-3, H-4 trên hình
ảnh điện di. Với hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng
ức chế HDAC ở nồng độ 1 µg/ml. Định lượng tác dụng ức chế HDAC2
đối với các chất 9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với
IC50 mạnh hơn SAHA từ 2 – 20 lần.
- 51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo
phương pháp MTT. Kết quả các chất 7a-f đã có khả năng ức chế sự phát
triển tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm với IC 50 từ 4,02 – 23,93
µg/ml. Tác dụng kháng tế bào ung thư thể hiện tốt nhất trên các chất 9a-h
và chất 23 với IC50 từ 0,32 – 16,89 µg/ml, chất 9b, 9g tác dụng tương
đương SAHA.
- Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và ức chế
HDAC tốt được lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo. Thử
nghiệm trên mô hình ghép dị chủng trên chuột trụi lông với dòng tế bào
ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy ở nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức
chế 49,00% sự phát triển khối u, tương đương SAHA (48,30%).
Tóm lại, luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và mang lại đóng
góp có ý nghĩa cho quá trình nghiên cứu các acid hydroxamic mới hướng
ức chế HDAC. Kết quả cho thấy vòng benzothiazol rất có triển vọng để
thay thế nhân phenyl của SAHA với vai trò là nhóm nhận diện bề mặt.
2. Kiến nghị
Thành công bước đầu cho thấy chất N1-(6-clorobenzo[d]thiazol-2-yl)8
N -hydroxyoctandiamid (9g) cần được tiến hành nghiên cứu tiền lâm
sàng sâu hơn với hy vọng đưa chất 9g thành ứng viên thử lâm sàng.
Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu thay thế nhóm nhận diện bề mặt của
SAHA bằng các hệ vòng thơm khác sẽ có khả năng thu được chất ức chế
HDAC có hoạt tính tốt hơn. Vì vậy, đây sẽ tiếp tục là hướng nghiên cứu
tiếp tục với mong muốn tìm được các ứng viên khác cho thử lâm sàng.