Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Đánh Giá Tác Dụng Diệt Tế Bào Ung Thư Của Lá Xạ Đen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT

HÀ NỘI - 2017


i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt. Các số liệu, kết quả nêu trong luận
văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
đề tài của mình.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Thủy


ii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến
Đạt, Trung tâm nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa
Học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học
tập và thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới
Việt – Nga và các bạn đồng nghiệp phòng Thích nghi và Y học quân sự đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện, bảo vệ luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật, các cán bộ nghiên cứu của phòng Hoạt tính Sinh học
- Viện Hóa sinh biển, phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp
chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt

tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành
phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
từ cây Xạ đen tại tỉnh Hoà Bình. Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm
chức năng từ các cao chiết tiềm năng”, do GS. TS. Đặng Đình Kim, Viện
Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam làm
chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Đặng Đình Kim, ThS. Vũ Thị
Nguyệt đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân và đồng
nghiệp – những người đã luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ
dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thu Thủy


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi
KÝ HIỆU VIẾT TẮT.................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen. ............................................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố. ..................................................... 3
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các
hợp chất của cây xạ đen ............................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................ 12
1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền: .................................................... 13
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí. ........................................ 13
1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM). .......................................... 13
1.2.2. Phương pháp sắc ký cột.................................................................... 17
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc. ............................................. 19
1.3.1. Phổ khối lượng MS .......................................................................... 20
1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .................................................. 21
1.3.3. Phổ 1H-NMR .................................................................................... 22
1.3.4. Phổ 13C-NMR ................................................................................... 22
1.3.5. Phổ DEPT ......................................................................................... 23
1.3.6. Phổ 2D-NMR ................................................................................... 23
1.4. Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ................ 25
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 27
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 27


iv

2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất .................................................................. 28
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu .................................................. 28
2.2.2. Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc ................................................... 29
2.2.3. Hoá chất............................................................................................ 29
2.2.4. Dòng tế bào (cell lines) ................................................................... 30
2.3. Chiết phân đoạn. ..................................................................................... 30
2.4. Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen. ........................................... 32

2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ................................................. 33
2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3 ................................................................ 35
2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4 ................................................................ 36
2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm .............................................. 37
2.5.1. Hợp chất Ed 3.2 ................................................................................ 37
2.5.2. Hợp chất Ed 5.5 ................................................................................ 37
2.5.3. Hợp chất Ed 17.3 .............................................................................. 38
2.5.4. Hợp chất Ed 11.4 .............................................................................. 38
2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) ...................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42
3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2 .................................................................................. 42
3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5 .................................................................................. 44
3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3 ................................................................................ 47
3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4 ................................................................................ 50
3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào. ........................................ 54
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 56
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 56
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58
PHỤ LỤC PHỔ ............................................................................................. 62


v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor ........................................................... 3
Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu ............................................. 8
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ....................................... 9
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu . .................................... 10

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu ........................................... 11
Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 12
Hình 2.1. Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình ................................................ 27
Hình 2.2. Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định ........................................ 28
Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen ................................... 32
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ...................................... 34
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 .................................................... 35
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 .................................................... 36
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2 ................ 42
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ................ 44
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ............... 45
Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5....................................................... 45
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3 .............. 47
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3 ............. 48
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4 .............. 50
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4 ............. 51
Hình 3.9. Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4 .................................... 52
Hình 3.10. Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4 ................................. 52


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram
dương Gram âm................................................................................................. 5
Bảng 3.1. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu phổ 1HNMR của caffeic acid ..................................................................................... 43
Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte .......................................................... 46
Bảng 3.3. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số
liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid ......................................................... 49

Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate .................................................... 53
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 54


vii

KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Việt

Ehretia asperula Zoll. & Mor

Xạ đen

C-NMR

Carbon (13) Nucleaedr
Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
carbon (13)

H-NMR

Hydro (1) Nucleaedr Magnetic
Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton (1)

DEPT

Distortionless Enhancement by

Phổ DEPT

HMBC

Polarization Transfer
Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Heteronucleaedr Multiple Bond
nhiều liên kết
Coherence

HSQC

Heteronucleaedr Single
Quantum Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua
một liên kết

δ

Chemical shift

Độ chuyển dịch hóa học

ppm

Part per million

Một phần triệu

Ed
13

1

Tiếng Anh

s

Singlet

d

Doublet

dd

Double of doublet

Rf

retardation factors

Hep-G2

Phát triển chậm

Human hepatocellular carcinoma Tế bào Ung thư gan
Human lung adenocarcinoma

Tế bào Ung thư phổi

Human breaedst
adenocarcinoma

Tế bào Ung thư vú

HeLa cervical cancer cells

Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa

W

Water

nước

D

Dichloromethane

H

n-Hexane

M

Methanol

E

Ethyl acetate

A

Acetone

LU-1
MCF-7
HeLa


1

LỜI MỞ ĐẦU
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã
được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị
của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có
thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát
triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên
dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này
nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn
13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây
là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc

sống. Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con
đường ngắn nhất và hiệu quả nhất để tìm kiếm có chọn lọc các hoạt chất từ
nguồn tài nguyên thiên nhiên.
Ung thư được coi là một trong những căn bệnh nan y do khả năng
kháng thuốc, gây di căn mạnh của các tế bào ung thư. Chính vì thế, việc phát
triển những loại dược phẩm mới đặc trị hoặc ngăn ngừa quá trình di căn ung
thư đang là vấn đề cấp thiết của y học hiện đại. Cây xạ đen có tên khoa học là
Ehretia asperula Zoll. & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae). Xạ đen phân bố
chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự
nhiên trong rừng. Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn,
không lông. Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu
đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ. Tại Việt Nam đã có một số công
trình nghiên cứu về cây Xạ đen như: Lê Thế Trung và cộng sự (1999) đã
nghiên cứu về khả năng chữa ung thư của cây xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy
Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học
cây xạ đen.


2
Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính trên tế bào ung thư cho thấy cao
chiết lá xạ đen có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh. Chính vì vậy việc lựa
chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào
ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)” là một việc cấp thiết
có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính sau:
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ lá xạ đen (Ehretia
asperula Zoll. & Mor) và đánh giá được tác dụng diệt tế bào ung thư của
chúng.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung
sau:

 Nghiên cứu về thành phần hóa học:
-

Phân lập các chất sạch

-

Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng
tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen.
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố.

Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor
Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor thuộc họ
Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không
có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hoặc mềm. Hoa hầu
như luôn đều, đài hợp nhiều hoặc ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên. Nhị
luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hoặc lớn hoặc nhỏ rời nhau.
Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô.
Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được
sớm phân chia bằng một vách ngăn giả. Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô
chứa mỗi ô một noãn. Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu

làm cho bầu chở lên có 4 thùy, còn vòi nhụy đâm ra ở chỗ lõm giữa 4 thùy
của bầu đó. Vòi nhụy thường mag ở phía trên một đầu nhụy, và đầu nhụy
hơi lõm, đôi khi cũng có 2 đầu nhụy. Khi quả chín thì các thùy của bầu


4
tách nhau ra thành 4 quả hạch nhỏ riêng biệt có một hạt. Hạt thường kông
có nội nhũ hay rất ít khi có nội nhũ. [1]
Ở Việt Nam Ehretia asperula Zoll. & Mor còn được gọi là Dót, Thân
cây gỗ nhỏ cao đến 1m. Lá có phiến bầu dục thon, 4 – 10 x 2-5cm, đáy tròn,
mép có răng hay nguyên, gân phụ 6 cặp, cuống dài 1,7cm. Chùm sim ở đầu
cành, có vài lá nhỏ ở đáy. Hoa ống ngắn, bộ nhị 5 bầu không lông, quả tròn,
to 4-5mm, có 4 cạnh, có 4 hột. Loài phân bố chủ yếu ở Indonesia và Việt
Nam (Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình). [1]
Về phân bố, họ Vòi voi là một họ khá lớn phân bố rộng rãi ở khắp nơi
trên thế giới, nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là vùng Địa
Trung Hải, Tây và Trung Á và Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, ở nước ta loài
mọc khắp cả nước. Ehretia asperula Zoll. & Mor phân bố chủ yếu ở Indonesia
và ở Việt Nam cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội,
Hòa Bình.
 Sơ lược về chi Ehretia
Cây bụi hoặc gỗ, lá nguyên hay có răng cưa ở mép, cụm hoa ngù hay
chùy, đài chia làm 5 phần, tràng hoa hình ống hay hình chuông, hiếm khi hình
phễu, hoa mẫu 5 chỉ nhị thò ra, bao phấn hình trứng hay thon dài. Bầu nhụy
hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn. Vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu
nhụy, hình tròn hay thon dài. Quả hạch màu vàng, cam, hay đỏ nhạt, hình cầu,
nhẵn, khi chín vỏ quả trong chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hoặc chia làm 4
thùy mỗi thùy có 1 hạt, hạt cứng.[5]
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các
hợp chất của cây xạ đen

Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học
quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch
trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông


5
kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh
lậu. Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch,
tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an
thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới
đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính
sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây
thuốc này. Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài
nước đối với cây xạ đen.
Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên,
Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học
Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh
học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Họ thử
nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết
EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương
(Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC
25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Kết quả hoạt tính sinh học
được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3].
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn
Gram dương Gram âm
D-d (mm)

B. subtilis

Sarcina sp.

E. coli

P. aeruginosa

n-Hexane

-

-

-

-

EtOAc

-

-

-

-

MeOH

2

-

-

-

Nước

7

-

-

-

Dịch chiết


6
Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề
tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2,
10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính
sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư. Trong luận án có bốn
chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedoolednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là: lup20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clionasterol (10),
axit glucosyringic (11). Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan (HepG2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không
thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này. Một số hợp chất của xạ
đen có cấu trúc như sau:


7

8

Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu [2, 10]
Năm 2000 Huang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của celahin
D: 1β,2β,6α,15β-tetracetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-β-dihydroagarofuran (12), 1βacetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-4α,6α-dihydroxy-2β(α-methylbutanoyloxy)-βdihydroagarofuran (13), 1β-acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-6α-hydroxy-2β
(a-methylbutanoyloxy)-β-dihydroagarofuran (13), emarginatine-E (15),
lupenone (16), friEdelinol (17) có trong cây xạ đen bằng phổ 1H-NMR,
13

C-NMR, phổ COSY, HMBC, HMQC và thử hoạt tính sinh học của các

hợp chất này. Kết quả cho thấy emarginatine-E (15) gây độc tế bào chống
lại tế bào ung thư hầu họng (ED50 = 1,7 µg/ml), và tế bào ung thư ruột kết
(ED50 = 4,1 µg/ml), ngược lại các giá trị ED50 cho các hợp chất 12, 14, 16
tất cả vượt 10 µg/ml. [14]


9

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [14]


10
Năm 2007 nhóm nghiên cứu gồm Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh
Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Lê Thị Hồng Nhung thuộc Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, đã phân lập và xác địch cấu trúc của một
phenolic glycoside và ba hợp chất triterpenes trong cây xạ đen. Cấu trúc của
các hợp chất được xác định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR và một số phổ hai

chiều, phổ phân giải cao. Các hợp chất phân lập được là glucosyringic acid
(18), lup-20(29)-ene-3β,11β-diol (19), lup-20(29)-ene-3-one (20) và lup5,20(29)-diene-3-one (21).[8, 10]

Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [8,10].
Vào năm 1995 một số nhà khoa học của Trung quốc tên là Yao-Haur
Kuo, Chieh-Fu Chen và Li-Ming Yang Kuo[16] đã phân lập được hai hợp
chất từ cây xạ đen, một hợp chất là celahinine A (22) và một hợp chất
alkaloid mới tên của nó là sesquiterpene pyridine alkaloid emarginatine A
(23). Hợp chất mới này có tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với tế bào Hepa2 (hepatoma), Hela, Colo 205 và các tế bào ung thư biểu mô KB (in-vitro), có


11
ED50 (KB)=4,0 µg/ml. Công thức hóa học của chúng được các tác giả xác
định bằng các phương pháp phổ 1H, 13C-NMR, COSY, NOESY và HMBC.

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu [16]
Vào năm 1997 Kuo YH và Kuo LM đã phân lập được bốn hợp chất
triterpene là celasdin A, celasdin B, celasdin C và maytenfolone A từ xạ đen.
Trong bốn hợp chất hai hợp chất celasdin A và celasdin C là hai hợp chất
mới, celasdin B. Hợp chất maytenfolone A có tác dụng gây độc tế bào,


12
Maytenfolone A được tiếp tục nghiên cứu X-ray và kết quả sinh học đã cho
thấy Maytenfolone A gây độc tế bào chống lại gan (HEPA-2B ED50

=

2,3

µg/ml) và ung thư vòm họng (ED50 = 3,8 µg/ml).[15]

Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [12]
1.1.3. Tác dụng sinh học
 Theo Đông y:
Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều
trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và
đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông kinh lợi niệu. Cây dùng trị
kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. [22]
Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu
hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm
đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. [22]
 Về Tây y:
Từ năm 1987 GS. Lê Thế Trung và các bác sĩ của Học viện Quân y đã
đi tiên phong trong nghiên cứu, tìm hiểu về cây xạ đen. Sau nhiều năm nghiên
cứu, hiện Học Viện Quân Y đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh


13
thể thuộc nhóm Fanavolnoid có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư. [22, 23]
Qua nghiên cứu về thực vật học, hoá dược, dược lý, nghiên cứu thực
nghiệm trên động vật được gây ung thư, các bác sĩ đã phát hiện ở loài cây này
tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính. Hơn nữa, theo GS. Trung,
một số hợp chất lấy từ xạ đen nếu được kết hợp với chất Phylamin có thể kéo
dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư. [22, 23]
Nghiên cứu cho thấy trong xạ đen có các hoạt chất Fanavolnoid ;
Quinon (có tác dụng phòng chống Ung thư và làm cho tế bào Ung thư hóa
lỏng dễ tiêu), hợp chất Saponin Triterbenoid (có tác dụng chống nhiễm
khuẩn). [22, 23]

1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền:
Bài thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ xạ đen lưu truyền trong dân gian là:
Dùng 50g cây xạ đen khô, 40g cây bạch hoa xà và 20g cây hoàng cầm râu, tất
cả các nguyên liệu trên đem sắc với 1,5 lít nước, sắc đến khi còn khoảng 1 lít
thì chắt ra uống. [24]
Điều trị các bệnh về gan, giúp thanh nhiệt, giải độc: Dùng 50g cây xạ
đen khô, 10g cây bá bệnh và 30g cây cà gai leo đem sắc với nước uống. [24]
Để giúp điều trị mụn, tiêu viêm lấy lá cây xạ đen đem rửa sạch rồi đun
sôi dùng thay trà uống hàng ngày, nó còn giúp cho tăng cường sức khỏe, cải
thiện giấc ngủ hiệu quả. [24]
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí.
1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM).
a. Nguyên tắc.
Dựa vào hệ số phân tích khác nhau của chất cần phân tích giữa pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc


14
vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động) trên pha tĩnh
trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu chất
được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác
nhau. Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha
tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành
phần sau khi phân tách riêng biệt ra khỏi hỗn hợp được lưu trữ trên pha
tĩnh.[6]
Sau đó có thể nhận biết các chất cần phân tích bằng ánh sánh thường
(nếu chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở bước sóng 254 nm, 365
nm hay phun thuốc thử hiện màu[6]….tùy thuộc bản chất chất cần phân tích
mà sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn

hợp cần phân tách.
b. Đại lượng đặc trưng.
 Hệ số lưu trữ Rf. [6]
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi:
Rf = (a/b)
Trong đó:
- a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm).
- b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng
đường đi của vết (cm).
- Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
 Hệ số lưu giữ tương đối Rr
Rr = dx/dc


15
Trong đó:
- dx là đường đi của chất phân tích (cm).
- dc là đường đi của chất chuẩn (cm).
Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất.
 Dụng cụ:
- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù
hợp với kích thước bản mỏng dùng triển khai và có nắp đậy kín.
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng
dài 365 nm.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để
sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Tủ hút chân không.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần

những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản.
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel.
c. Cách tiến hành.
Chuẩn bị bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình
trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử
dụng.Hệ dung môi thích hợp được cho vào bình triển khai sắc kí cho bão hòa
dung môi.[6]


16
Chấm một lượng chất phân tích vừa phải lên bản mỏng, nếu lượng chất
quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf
gần nhau sẽ bị chồng lấp còn nếu lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện
được do độ nhạy của thuốc thử không đủ. Lượng mẫu thông thường cần đưa
lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước
hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml
đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml
khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều
chế. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp
trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi
lần chấm.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và kẻ
vạch xuất phát cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1cm, vạch tiền tuyến dung môi
là vạch kết thúc đường đi của dung môi. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản
mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Với những trường hợp phân tích bán
định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định

lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín
bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản
mỏng chạy tới vạch tiền tuyến đã định sẵn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh
dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện
vết chất.
Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết
quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự
giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.