NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

V TH HO

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR
đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus
gây tiêu chảy cấp ở trẻ em

LUN VN THC S Y HC

H NI 2018


B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

V TH HO

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR
đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus
gây tiêu chảy cấp ở trẻ em
Chuyờn ngnh: Vi sinh

Mó s

: 60720115

LUN VN THC S Y HC

Ngi hng dn khoa hc:
1. PGS.TS. Lờ Vn Phng
2. TS. Phựng Th Bớch Thy


HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy đã hướng
dẫn tận tình, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài này. Sự hướng dẫn tận tình và
những kiến thức quý báu của các thầy đóng vai trò vô cùng quan trọng trong
quá trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô trong hội đồng thông
qua đề cương và hội đồng chấm khóa luận đã dành thời gian đọc và đóng góp
ý kiến quý báu để em hoàn chỉnh luận văn này.
Em xin cám ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại khoa
nghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương đã
giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặt trong quá trình thu thập, xử lí bệnh
phẩm, cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị kỹ thuật viên, các bác sỹ nội trú
vi sinh khóa 39, 40, 41 đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, và động viên em trong
quá trình học tập và hoàn thiện luận văn.
Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng

ban chức năng của Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than trong gia
đình và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2018


Vũ Thị Hảo
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên
ngành Vi sinh. Tôi xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS Lê Văn Phủng và TS Phùng Thị Bích Thủy.
2. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực và
chính xác.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2018

Vũ Thị Hảo


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS

Acquired Immune Deficiency Syndrome

BPS

Phosphate-buffered saline

Ct

Chu kì ngưỡng phát hiện

dsRNA

Double-stranded Ribonucleic acid

(+) ssRNA Positive-sense single-stranded Ribonucleic acid
DNA

Deoxyribonucleic acid

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

ORF

Open reading frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcription Polymerase Chain Reaction

TCC

Tiêu chảy cấp

VP
NSP

Viral protein (protein cấu trúc)
Non-Structure protein (protein phi cấu trúc)


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................3
1.1. Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus...................................3
1.1.1. Tình hình trên thế giới.........................................................................3
1.1.2. Tình hình tại Việt Nam........................................................................5
1.2. Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus.............................6
1.2.1. Đặc điểm của Rotavirus......................................................................6
1.2.2. Đặc điểm của Norovirus......................................................................9
1.3. Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus.......................................10

1.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy..............................................................................10
1.3.2. Kỹ thuật phát hiện bằng kính hiển vi điện tử........................................11
1.3.3. Các kỹ thuật miễn dịch......................................................................13
1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử..................................................................16
1.3.4.3. Kỹ thuật Realtime PCR đa mồi.......................................................20
1.4. Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu........................................................20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............22
2.1. Địa điểm nghiên cứu............................................................................22
2.2. Thời gian nghiên cứu............................................................................22
2.3. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................22
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu....................................23
2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị.......................................................................23
2.4.2. Hóa chất...........................................................................................23
2.5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................26


2.5.1. Thiết kế nghiên cứu:..........................................................................26
2.5.2. Phương pháp Realtime PCR đa mồi phát hiện Rotavirus và Norovirus. 27
2.5.3. Phản ứng Realtime PCR xác định Norovirus và Rotavirus...................29
2.5.4. So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR đa mồi với kit
thương mại có chứng chỉ IVD...........................................................31
2.6. Xử lý số liệu.........................................................................................31
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu....................................................................31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................................32
3.1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................32
3.1.1. Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA........................................32
3.1.2. Kết quả phản ứng Realtime PCR........................................................33
3.1.3. So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với kit
thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng chỉ IVD......................36

3.2. Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................38
3.2.1. Tỉ lệ phát hiện TCC do Rotavirus, Norovirus......................................38
3.2.2. Phân bố bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus theo giới tính...........39
3.2.3. Phân bố bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi........40
3.2.4. Một số chỉ số xét nghiệm trong máu, trong phân.................................43
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..............................................................................46
4.1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em....................................................46
4.1.1. Kết quả xử lí bệnh phẩm và tách chiết RNA........................................46
4.1.2. Phản ứng Realtime PCR đa mồi.........................................................48


4.2. Một số đặc điểm dịch tễ của Rotavirus, Norovirus..............................51
4.2.1. Tỉ lệ phát hiện tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus.........................51
4.2.2. Phân bố bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus theo giới tính...........53
4.2.3. Phân bố bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus theo tuổi.................54
4.2.4. Một số chỉ số xét nghiệm trong máu, trong phân..................................56
KẾT LUẬN.....................................................................................................59
KIẾN NGHỊ....................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các đoạn gen của Rotavirus............................................................7
Bảng 1.2. Cấu trúc và protein của Rotavirus.................................................8
Bảng 2.1. Trình tự Primer, Probe của gen GAPDH, Rotavirus, Norovirus. .25
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gen GAPDH.............................................29
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng..................................................................30

Bảng 3.1. Nồng độ RNA sau khi tiền xử lý mẫu và tách chiết nucleic acid..32
Bảng 3.2. Phân bố giá trị Ct của kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi và kỹ
thuật Realtime PCR đa mồi..........................................................33
Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Rotavirus của kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi
và kỹ thuật Realtime PCR đa mồi................................................34
Bảng 3.4. Kết quả phát hiện Norovirus của kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi
và kỹ thuật Realtime PCR đa mồi................................................35
Bảng 3.5. Kết quả giá trị Ct so sánh giữa kỹ thuật Realtime PCR đa mồi và
kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng chỉ IVD........36
Bảng 3.6. Kết quả phát hiện Rotavirus của kỹ thuật Realtime PCR đa mồi
và kit thương mại FTD.................................................................37
Bảng 3.7.

Kết quả phát hiện Norovirus của kỹ thuật Realtime PCR đa mồi
và kit thương mại FTD.................................................................37

Bảng 3.8. Bảng phân bố các căn nguyên Rotavirus và Norovirus gây tiêu
chảy cấp ở trẻ em..........................................................................38
Bảng 3.9. Đặc điểm giới của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus.......39
Bảng 3.10. Phân bố tuổi của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus.........40
Bảng 3.11. Kết quả soi phân của bệnh nhân TCC do Rotavirus, Norovirus......45


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tỉ lệ tử vong của bệnh nhân tiêu chảy cấp do Rotavirus............... 4
Hình 1.2. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus ................................. 6
Hình 1.3. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus ................................. 9
Hình 1.4. Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử ........................... 12
Hình 1.5. Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử ........................... 12
Hình 1.6. Nguyên lí của phương pháp ELISA ............................................14

Hình 1.7. Nguyên lí của kỹ thuật sắc kí miễn dịch ..................................... 15
Hình 1.8. Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong phản
ứng Realtime PCR. .......................................................................18
Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của TaqMan Probe trong Realtime PCR ..... 19
Hình 2.1. Nguyên lí hoạt động của hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0...28


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ các căn nguyên Rotavirus, Norovirus gây TCC ở trẻ em.....39
Biểu đồ 3.2.

Phân bố tỉ lệ bệnh nhân TCC do Rotavirus theo nhóm tuổi........41

Biều đồ 3.3. Phân bố tỉ lệ bệnh nhân TCC do Norovirus theo nhóm tuổi........42
Biểu đồ 3.4. Sự thay đổi nồng độ Natri máu của bệnh nhân TCC do Rotavirus,
Norovirus...................................................................................43
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi nồng độ Kali máu của bệnh nhân TCC Rotavirus,
Norovirus..................................................................................44


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tiêu chảy là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 ở trẻ em dưới 5
tuổi trên toàn thế giới sau bệnh lí đường hô hấp. Trên thế giới, mỗi năm ước
tính có khoảng 2,5 tỉ trường hợp trẻ tiêu chảy; 1,5 triệu trường hợp tử vong vì
tiêu chảy cấp (TCC), con số này nhiều hơn số trẻ tử vong do AIDS, sốt rét và
sởi . Bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em do nhiều căn nguyên như virus, vi khuẩn, kí
sinh trùng, trong đó, Rotavirus, Norovirus là căn nguyên gây tử vong hàng

đầu ở trẻ dưới 5 tuổi trên toàn thế giới . Người ta ước tính mỗi năm có khoảng
47% các trường hợp TCC nhập viện được chẩn đoán là do Rotavirus và 12%
các trường hợp là do Norovirus . Tại Việt Nam, tỉ lệ TCC do Rotavirus dao
động từ 31%-60% ,,, và tỉ lệ TCC do Norovirus dao động từ 6,6%-33% ở
nhóm trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do TCC ,,. Hiện nay, các phương pháp chủ
yếu để chẩn đoán Rotavirus, Norovirus trong phòng xét nghiệm là phương
pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch và phương pháp sinh học phân tử.
Phương pháp nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng nhưng khó thực hiện
trong bệnh viện vì đòi hỏi kĩ thuật cao và trang thiết bị đầy đủ, thời gian nuôi
cấy kéo dài nhiều ngày. Phương pháp miễn dịch hiện đang được sử dụng phổ
biến tại bệnh viện do đơn giản, dễ thực hiện, nhưng độ nhạy của kỹ thuật còn
chưa cao. Gần đây, phương pháp sinh học phân tử ra đời và phát triển mạnh
đã khắc phục được phần nào nhược điểm của hai kỹ thuật trên. Trong đó, PCR
là kỹ thuật phát hiện tác nhân thông qua khuếch đại đặc hiệu đoạn gen của tác
nhân đó. Cho đến nay, Realtime PCR gần như thay thế kỹ thuật PCR thường
do độ đặc hiệu của phản ứng cao hơn và thao tác đọc kết quả thuận tiện hơn.
Đặc biệt, kỹ thuật Realtime PCR đa mồi đang là một hướng đi nhằm phát hiện
nhiều tác nhân đồng thời trong một phản ứng giúp tiết kiệm được sinh phẩm,
hóa chất, hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng phát hiện sớm căn nguyên gây bệnh. Vì
vậy, để ứng dụng sớm trong sàng lọc tại bệnh viện, chúng tôi thực hiện đề tài


2
“Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện
Rotavirus và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em” với hai mục tiêu:
1. Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi trong phát hiện Rotavirus
và Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.
2. Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus và
Norovirus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em.

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình tiêu chảy cấp do Rotavirus, Norovirus
1.1.1. Tình hình trên thế giới
Tiêu chảy cấp là nguyên nhân thứ hai gây tử vong của trẻ em trên toàn
thế giới. Trong các tác nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em, Rotavirus, Norovirus
là hai tác nhân quan trọng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu. Mỗi năm, Rotavirus
gây ra trung bình 440.000 trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi, chủ yếu tập
trung ở các nước đang phát triển . Rotavirus có phạm vi lưu hành trên khắp
các châu lục. Ở Châu Á, Rotavirus gây ra 37,5% các trường hợp tiêu chảy
cấp, trong đó Bangladesh, Hàn Quốc, Taiwan, Thái Lan, Việt Nam là các quốc
gia có tỉ lệ cao nhất . Trong khi ở các quốc gia Châu Âu, tỉ lệ này dao động từ
25,3% đến 63,5% . Người ta nhận thấy tỉ lệ TCC do Rotavirus ở các nước
phát triển cao hơn các nước đang phát triển, điều này cho thấy điều kiện về
kinh tế cũng như vệ sinh môi trường không làm giảm đáng kể tỉ lệ mắc
Rotavirus .
Nghiên cứu gần đây của WHO tại Azerbaijan trên 3159 trẻ TCC dưới 5
tuổi từ năm 2011 đến năm 2016 cho thấy tỉ lệ TCC do Rotavirus dao động từ
13%-21%, trong đó 58% số trẻ mắc bệnh có độ tuổi trẻ từ 6 đến 23 tháng .
Một nghiên cứu khác của WHO trên 7562 trẻ TCC dưới 5 tuổi ở Bangladesh,
từ năm 2012 đến năm 2017 chỉ ra tỉ lệ TCC do Rotavirus là 64%, trong đó
57% trẻ mắc bệnh dưới 12 tháng tuổi . Cùng với sự ra đời của vắc xin
Rotavirus và những nỗ lực không ngừng của WHO trong giảm thiểu gánh
nặng bệnh tật do TCC ở trẻ em thì cho đến nay Rotavirus vẫn là tác nhân phổ
biến gây TCC ở trẻ em trên toàn thế giới.

4

Hình 1.1. Tỉ lệ tử vong của bệnh nhân tiêu chảy cấp do Rotavirus
( />Rotavirus/en/)
Cùng với Rotavirus, Norovirus đang được xem là một trong những
nguyên nhân phổ biến hàng đầu gây tiêu chảy cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi trên
toàn thế giới. Theo thống kê công bố năm 2008, người ta ước tính mỗi năm
Norovirus gây ra 64.000 trường hợp tiêu chảy nhập viện, 900.000 lượt khám
bệnh ở trẻ dưới 5 tuổi tại các nước công nghiệp hóa, chiếm 12% trong số các
căn nguyên gây tiêu chảy nhập viện ở trẻ em tại các quốc gia này. Căn nguyên
này cũng gây ra khoảng 218.000 trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi tại các
nước đang phát triển. Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng trên 235.000 lượt khám
bệnh, 23.000 trường hợp nhập viện vì TCC do Norovirus . Một thống kê gần
đây trên 48 quốc gia công bố năm 2014 cho thấy Norovirus chiếm 18% trong
các căn nguyên gây TCC trẻ em. Trong đó ở các nước đang phát triển tỉ lệ
TCC do Norovirus là 14%-19%, ở các nước phát triển tỉ lệ này là 20% .


5
Tương tự như Rotavirus, tỉ lệ TCC do Norovirus ở các nước phát triển cao
hơn ở các nước đang phát triển. Điều này cho thấy điều kiện kinh tế cũng như
môi trường không làm giảm thiểu đáng kể tỉ lệ mắc Norovirus. Khác với
Rotavirus, thế giới hiện chưa có vắc xin phòng Norovirus, trong khi
Norovirus đang là căn nguyên quan trọng gây TCC ở trẻ em trên toàn thế giới
và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây.
1.1.2. Tình hình tại Việt Nam
Trong mô hình bệnh tật chung của toàn thế giới, Việt Nam, một nước
đang phát triển cũng chịu gánh nặng bệnh tật của TCC do Rotavirus,
Norovirus gây ra. Theo Nguyễn Văn Mẫn và cộng sự (năm 2005) tiến hành

trên 6 bệnh viện ở cả miền Bắc và miền Nam, tỉ lệ TCC do Rotavirus dao
động từ 50% đến 70% . Tại miền nam, nghiên cứu của Đoàn Thị Lan Phương
và cộng sự (năm 2003) cho thấy tỉ lệ trẻ TCC do Rotavirus là 65,6% . Tại
miền bắc, nghiên cứu của Đỗ Phương Thảo (năm 2016) tại bệnh viện Nhi
Trung ương công bố tỉ lệ TCC do Rotavirus là 41,2% . Như vậy, ở nước ta,
TCC do Rotavirus có xu hướng giảm nhưng vẫn chiếm tỉ lệ cao trong các căn
nguyên gây TCC ở trẻ em.
Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước cho thấy tỉ lệ TCC do
Norovirus khá dao động. Theo nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự
(năm 2007) trên 1010 trẻ TCC nhập viện ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy
tỉ lệ TCC do Norovirus là 5,5% . Nghiên cứu của Nguyễn Vân Trang (năm
2013) trên 501 trẻ tiêu chảy cấp tại bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy tỉ lệ
TCC do Norovirus là 36%, trong đó 100% là nhóm GII . Tỉ lệ trẻ TCC do
Norovirus trong nước có sự dao động lớn như vậy do nhiều nguyên nhân như
địa lí, độ tuổi của trẻ tham gia nghiên cứu, kỹ thuật phát hiện virus.


6
1.2. Đặc điểm tính chất hệ gen của Rotavirus, Norovirus
1.2.1. Đặc điểm của Rotavirus

Hình 1.2. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Rotavirus
(Nguồn: Jayaram và cộng sự, 2004).
Rotavirus thuộc họ Reoviridae có hình khối cầu 20 mặt, đường kính
trung bình 65-75nm. Rotavirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 từ
mảnh sinh thiết ruột non của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử . Rotavirus
có cấu trúc gồm capsid và acid nucleic. Vật chất di truyền của Rotavirus là
ARN sợi kép (dsRNA) gồm 11 đoạn dsRNA, chứa khoảng 18.500 cặp base
(bảng 1.1). Mỗi đoạn có chiều dài nằm trong khoảng từ 667 đến 3302 bp và
mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc protein phi cấu trúc, trừ đoạn gen 11 mã

hóa 2 protein ,. ARN của Rotavirus được bao bọc bởi 3 lớp protein đồng tâm
lần lượt là lớp ngoài, lớp trong và lớp lõi. Lớp ngoài được cấu tạo gồm 780
phân tử protein VP7 và 60 gai nhú dimer VP4. Lớp trong bao gồm 780 phân
tử protein VP6 phân bố đều trên 20 mặt của capsid. Protein VP6 đóng vai trò
kết nối giữa lớp ngoài và lớp lõi. Lớp lõi chứa 120 phân tử protein VP2 sắp
xếp đều trên 20 mặt của capsid và 12 phức hợp VP1/VP3 gắn bên trong bề


7
mặt của lớp VP2. Các phân tử protein được chia làm 2 nhóm là protein cấu
trúc và protein phi cấu trúc. Protein cấu trúc bao gồm 6 loại là: VP1, VP2,
VP3, VP4, VP6, VP7. Protein phi cấu trúc bao gồm 6 loại là: NSP1, NSP2,
NSP3, NSP4, NSP5, NSP6.
Bảng 1.1. Các đoạn gen của Rotavirus
Đoạn

Kích

Protein

Kích cỡ

gen

cỡ (bp)

mã hóa

(kDa)

1

3302

VP1

125

Nhân

12

2

2687

VP2

94

Nhân

120

3

2592

VP3

88

Nhân

12

4

2362

VP4

86

Lớp ngoài

180

5

1581

NSP1

58

Protein phi cấu trúc

-

6

1356

VP6

44

Lớp trong

780

7

1062

VP7

37

Lớp ngoài

780

8

1059

NSP2

36

Protein phi cấu trúc

-

9

1074

NSP3

34

Protein phi cấu trúc

-

10

751

NSP4

20

Protein phi cấu trúc

Rất ít

NSP5

21

Protein phi cấu trúc

NSP6

12

Protein phi cấu trúc

11

666

Vị trí

Số
phân tử

-

Quan sát trên kính hiển vi điện tử người ta thấy 3 loại hạt virus là hạt
virus hoàn chỉnh, virus có vỏ capsid đơn và lõi virus (bảng 1.2).

Bảng 1.2. Cấu trúc và protein của Rotavirus
Hạt virus

Hoàn chỉnh

Vỏ capsid đơn

Lõi

Cấu trúc

3 lớp

2 lớp

1 lớp


8
Protein

VP1, 2, 3, 4, 6, 7

VP1, 2, 3, 6

VP1, 2, 3

Hiện nay, người ta chia Rotavirus thành 8 nhóm A, B, C, D, E, F,G và H
dựa vào đặc tính kháng nguyên của VP6 . Trong đó Rotavirus nhóm A, B, C
là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy ở người. Đặc biệt, nhóm A là
nguyên nhân phổ biến chiếm khoảng 90% các trường hợp lây nhiễm. Nhóm B
xuất hiện ít hơn và thường gây tiêu chảy ở người lớn. Nhóm C gây tiêu chảy ở
trẻ em nhưng hiếm gặp ,. Rotavirus lây truyền phổ biến qua đường phân
miệng. Ổ chứa chủ yếu là người bệnh nhiễm Rotavirus. Số lượng virus thải ra

có thể đạt 1011 trong 1 gram phân. Sau khi thải ra môi trường, Rotavirus tồn
tại bền vững sau nhiều ngày ở nhiệt độ 4C và duy trì được khả năng gây
bệnh . Nghiên cứu trên nhóm người tự nguyện cho thấy liều 10 virus đủ gây
mắc bệnh trên người . Rotavirus là nguyên nhân hàng đầu gây TCC ở trẻ em
dưới 5 tuổi, đặc biệt ở trẻ từ 6 đến 24 tháng. Ngoài ra, Rotavirus có thể gây ra
bệnh viêm phổi, viêm ruột hoại tử, lồng ruột, tắc mật ngoài gan, nhiễm trùng
huyết, viêm não… . Rotavirus đi qua đường phân miệng bám vào rồi nhân lên
trong tế bào trưởng thành nằm ở đỉnh nhung mao niêm mạc ruột non. Chúng
làm tổn thương các vi nhung mao đồng thời làm tăng sản các tế bào hẽm
tuyến ở niêm mạc ruột. Hậu quả gây ra thiếu hụt các enzyme tiêu hóa, rối loạn
nhu động ruột, rối loạn hấp thu nước, điện giải và chất dinh dưỡng ,,. Vì vậy,
bệnh nhân tiêu chảy cấp có các triệu chứng tiêu chảy phân lỏng, sốt và nôn,
dấu hiệu mất nước có thể từ nhẹ tới nặng .

1.2.2. Đặc điểm của Norovirus


9

Hình 1.3. Hình ảnh minh họa cấu trúc của Norovirus
(Nguồn: Hiroshi Ushijima và cộng sự, 2014)
Norovirus là thành viên của họ Caliciviridae, có hình khối 20 mặt đường kính
27- 40nm. Norovirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1972 khi Kapikian quan
sát mẫu phân của bệnh nhân dưới kính hiển vi điện tử , . Norovirus được cấu
tạo gồm cấu trúc capsid đơn và acid nucleic. Vật chất di truyền của Norovirus
là một sợi RNA dương (+ ss RNA), dài khoảng 7,7 kb. Bộ gen mã hóa ba
khung đọc mở ORF (open reading frame) gồm ORF1, ORF2, ORF3. ORF1
mã hóa cho các protein phi cấu trúc bao gồm p48 (p37), p41 (p40), NTPase,
p22 (p20), VPg, CL pro, RdRp. Protein VPg liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của
RNA virus mang chức năng bắt đầu quá trình nhân lên của virus. Chức năng

của protein phi cấu trúc còn lại chưa được hiểu biết đầy đủ. ORF2 mã hóa
protein cấu trúc chính (major) VP1 và ORF3 mã hóa protein cấu trúc nhỏ
(minor) VP2 . RNA của virus được bao bọc bởi cấu trúc capsid đơn gồm 90
dimer protein VP1 và một hoặc hai protein cấu trúc VP2 . Protein VP1 chứa
530-555 amino acid, có trọng lượng phân tử 58-60 kDa. Protein VP2 chứa
208-268 amino acid, có trọng lượng 22-29 kDa. Hiện nay, Norovirus được
phân chia thành 6 nhóm gen khác nhau từ GI đến GVI. Trong đó, Norovirus
gây bệnh ở người chủ yếu thuộc nhóm GI, GII và GIV . Theo chương trình


10
giám sát dịch tễ của Norovirus trên thế giới, nhóm GII đang chiếm ưu thế,
ước tính chiếm 80% các trường hợp lây nhiễm . Chúng có khả năng lây
truyền từ người sang người qua đường phân miệng với liều lây nhiễm từ 10
đến100 virus ,. Ổ chứa chủ yếu là người bệnh nhiễm Norovirus. Chúng có khả
năng tồn tại bền vững ngoài môi trường trong nhiều ngày và bị bất hoạt ở
63°C trong 30 phút, 100°C trong vài giây . Vì vậy, khả năng lây nhiễm từ
người bệnh sang người lành cao. Norovirus là tác nhân gây TCC ở người đặc
biệt là trẻ nhỏ. Ngoài ra, Norovirus còn được xem là tác nhân liên quan đến
một số bệnh lý khác như: viêm ruột hoại tử ở trẻ đẻ non, hội chứng ruột kích
thích, bệnh lí não, đông máu rải rác lòng mạch . Norovirus đi qua đường tiêu
hóa, bám vào biểu mô ruột non gây ra sự thay đổi mô học và chức năng của
ruột non tương tự như Rotavirus. Hậu quả gây ra sự tổn thương của các vi
nhung mao ruột, sự rối loạn nhu động dạ dày ruột, sự rối loạn bài tiết các
enzyme tiêu hóa, gây ra sự kém hấp thu các chất dinh dưỡng như D-xylose,
lactose, chất béo . Vì vậy, bệnh nhân tiêu chảy cấp có các triệu chứng tiêu
chảy phân lỏng, sốt và nôn, dấu hiệu mất nước có thể từ nhẹ tới nặng . Gần
đây, người ta nhận thấy người bệnh nhiễm Norovirus phụ thuộc vào sự hiện
diện kháng nguyên nhóm máu Histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong ống tiêu
hóa . Sự mẫn cảm của người nhiễm khác nhau được giải thích dựa trên liên

kết đặc hiệu của virus và sự biến đổi trên thụ thể HBGA ,.
1.3. Các kỹ thuật phát hiện Rotavirus, Norovirus.
1.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy
Nuôi cấy luôn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán. Kỹ thuật
nuôi cấy virus thường yêu cầu cao về kỹ thuật bao gồm: lựa chọn tế bào, lựa
chọn môi trường nuôi cấy tế bào thích hợp, gây nhiễm tế bào, quan sát bệnh
lý tế bào sau khi gây nhiễm. Hiện nay, người ta hoàn toàn có thể tiến hành
nuôi cấy Rotavirus, Norovirus trong phòng thí nghiệm. Rotavirus có thể nuôi


11
cấy trên tế bào HEK, CK, LLC-MK2 . Norovirus được nuôi cấy trên tế bào
đại thực bào, tế bào trình diện kháng nguyên của chuột, của người , và tế bào
B của chuột, của người ,. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy yêu cầu phòng xét
nghiệm có đủ trang thiết bị và đặc biệt thời gian nuôi cấy kéo dài nhiều ngày .
1.3.2. Kỹ thuật phát hiện bằng kính hiển vi điện tử
Phương pháp phát hiện Norovirus, Rotavirus bằng kính hiển vi điện tử ra
đời rất sớm từ những năm 1972, 1973 , , . Kỹ thuật này chủ yếu dựa vào nhận
định về hình thái virus. Các tiêu chuẩn chính nhận định Rotavirus dưới kính
hiển vi điện tử là hạt virus hình cầu đường kính 70 nm, lớp capsid ngoài
mỏng, mịn. Tương tự, Norovirus dưới kính hiển vi điện tử có hình cầu, đường
kính từ 27-40 nm, không vỏ. Theo nghiên cứu của Rabenau và cộng sự (năm
2003) khi so sánh 3 phương pháp phát hiện Norovirus: bằng kính hiển vi điện
tử, ELISA, PCR, độ nhạy của 3 phương pháp lần lượt là: 58,3%; 31,3%;
94,1%; độ đặc hiệu của 3 phương pháp lần lượt là: 98%; 94,9%; 94,1% . Như
vậy, phương pháp phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử có ưu điểm tương
đối nhanh, đơn giản. Nhưng nhược điểm chính là phụ thuộc nhiều vào kinh
nghiệm của người quan sát và độ nhạy chưa cao.

12

Hình 1.4. Hình ảnh Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử
(nguồn: Hans R. Gelderblom/RKI)

Hình 1.5. Hình ảnh Norovirus dưới kính hiển vi điện tử
(nguồn: Kapikian và cộng sự).


13
1.3.3. Các kỹ thuật miễn dịch
1.3.3.1. Kỹ thuật miễn dịch ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Kỹ thuật ELISA phát hiện virus sử dụng nguyên lí dùng kháng thể đặc
hiệu để bắt giữ kháng nguyên Rotavirus, Norovirus. Kháng nguyên virus được
phát hiện nhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu bậc 2 có
gắn enzyme. Hiện nay, trên thị trường có nhiều bộ kit thương mại sử dụng
nguyên lí này để phát hiện Rotavirus như Premier™ Rotaclone® (Meridian
Bioscience, Inc.), ProSpecT™ (Oxoid, Ltd.) và RIDASCREEN® (R-biopharm
AG). Khi so sánh với kỹ thuật RT-PCR, ba bộ kit này có độ đặc hiệu là 100%
và độ nhạy lần lượt là 76,8%, 75% và 82,1% . Một số bộ kit thương mại sử
dụng kĩ thuật ELISA để chẩn đoán Norovirus như IDEIA Norovirus EIA,
SRSV(II)-AD, RIDASCREEN,… Các kỹ thuật ELISA chẩn đoán Norovirus
có độ nhạy của kỹ thuật dao động từ 35% - 52%, độ đặc hiệu thường trên 90%
. Như vậy, kỹ thuật ELISA có ưu điểm đơn giản, thời gian trả kết quả ngắn
dao động từ 2 đến 3 giờ, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm không có
kính hiển vi điện tử. Tuy nhiên, nhược điểm chính của kỹ thuật là độ nhạy còn hạn
chế ,.


14

Kháng thể
Vị

trí

Cơ chất
Kháng thể

gắn
Kháng

bậc hai

nguyên
Mẫu

Bước gắn

Bước rửa

Bước gắn kháng Bước đọc kết quả
thể-enzyme

Hình 1.6. Nguyên lí của phương pháp ELISA
( nguồn: />Kháng thể được cố định vào đáy giếng nhựa. Kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm
sẽ kết hợp với kháng thể tạo phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Bước rửa loại bỏ thành
phần không kết hợp với kháng thể. Kháng thể bậc hai kết hợp với enzym gắn với phức hợp
kháng nguyên – kháng thể. Phức hợp này được nhận biết bằng phản ứng màu sau khi bổ
sung cơ chất đặc hiệu với enzyme cộng hợp.

1.3.3.2. Kỹ thuật sắc kí miễn dịch
Kỹ thuật sắc kí miễn dịch dùng dạng que nhúng để phát hiện kháng
nguyên virus thông qua nhận định vạch màu. Que nhúng có chứa kháng thể
gắn cộng hợp với các hạt keo vàng được phân bố trên bản sắc kí. Kháng thể
đặc hiệu được cố định tại vị trí vạch kết quả. Kháng nguyên trong bệnh phẩm
sẽ kết hợp với kháng thể gắn hạt keo vàng và di chuyển. Phức hợp này sẽ kết
hợp với kháng thể cố định trên bản sắc kí tạo vạch màu hồng tại vị trí vạch kết
quả. Phần phức hợp còn lại không gắn với kháng nguyên di chuyển đến vạch