PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh,
tủ ổn nhiệt, cân điện tử, máy khử trùng, bộ pipette, bình nuôi cấy, đĩa Petri, que cấy khuẩn
hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn.
2.1.2. Hóa chất và môi trường
Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm này là: Ethanol, NaClO, Ka,
Hygromycin, AS, 2,4-D, BAP, IAA, Agar.
Các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là: LB, MS, C1, C2, C3, C4, C5, C6
(xem thành phần các loại môi trường ở phần phụ lục).
2.1.3. Vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được sử dụng là: A.tumefaciens AGL1 và GV3101. Cả hai chủng
đều mang vector pCAMBIA 1301 có gen gus làm chỉ thi sàng lọc, gen kháng kanamycin
làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng hygromycin làm chỉ thị chọn lọc thực vật.
Hai chủng có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực
vật, viện Di truyền nông nghiệp.
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu
Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông
nghiệp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng
♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở
giai đoạn khử trùng mẫu.
- Nguyên tắc: Sử dụng các dung dịch khử trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào
các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi khuẩn (bởi vì
hạt đậu tương được thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm).
- Chỉ tiêu đánh giá: mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát
triển bình thường.
- Hóa chất: Ethanol, NaClO, nước cất vô trùng.
- Tiến hành: khử trùng hạt được tiến hành trong tủ cấy vô trùng và theo quy trình

khử trùng hạt được cải tiến từ quy trình của Xue R.G. et al. (2006)[31].
* Ngâm hạt với nước cất vô trùng trong 30 phút (hạt được bỏ trong bình tam giác
250ml với số lượng 20-25 hạt).
* Lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút.
* Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 1 lần.
* Lắc hạt với NaClO với các nồng độ 10%; 12,5%; 15%; 20% trong thời gian 5; 10;
13,5 phút.
* Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 5-6 lần (rửa đến khi hết bọt).
* Dùng dao và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt.
* Cấy hạt vào môi trường nảy mầm MS, cho hạt nảy mầm trong 2-3 ngày.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa,
mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.
2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương
Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị
trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa
vào nghiên cứu của Xue R.G. et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. X-gluc được sử dụng
để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft et al. [30].
♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26
- Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực vật và
có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật. Tuy nhiên, mỗi chủng có
cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật.
- Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thể chuyển gen
gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao
- Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi
khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB,
AS, Ka, môi trường C
1
và C
2,
X-gluc.

- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có chứa Ka,
nuôi trong tủ 28
0
C qua đêm. Sau đó đem bảo quản trong tủ 4
0
C (sử dụng 2-3 tháng kể từ
ngày nuôi).
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên
vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 28
0
C cho đến khi
đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm,
giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4):
Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch
khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2.
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon
50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37
0
C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục
của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa,
mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26.
Hình . Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26

♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD)
đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26.
- Nguyên tắc: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của
A.tumefaciens. Nếu trong dịch khuẩn mà mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ làm cho hiệu quả
biến nạp vào mẫu thấp và gây chết mẫu. Còn nếu mật độ vi khuẩn ít thì hiệu quả biến nạp
thấp.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sống và phát triển bình thường có màu xanh chàm đặc
trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường) , hiệu
quả biến nạp cao.
- Vật liệu: : hạt đậu tương đã nảy mầm 1 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí
nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường
LB, AS, Ka, môi trường C
1
và C
2.
- Tiến hành:
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen
Nuôi phục hồi A.tumefaciens AA43 từ đĩa thạch rên vào dung dịch LB có chứa
AS 200mg/l, Ka 200mg/l trong tủ lắc 28
0
C cho đến khi đạt nồng độ OD lần lượt là 0,0; 0,2;
0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 thì được sử dụng cho biến nạp.
* Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen
Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ
lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1.
• Tiến hành chuyển gen theo quy trình được tóm tắt như hình 5:
Ngâm nửa hạt một ngày tuổi có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn A.tumefaciens có
OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4.
Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C
1

(có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C
2
trong 5 ngày.
Hình . Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch
khuẩn (OD) lên biểu hiện gus của giống đậu tương ĐT26
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon
50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 37
0
C trong 48h.
Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp
lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu.