Khóa luận tốt nghiệp: Phân Lập Và Tuyển Chọn Các Chủng Bacillus Ứng Dụng Trong Sản Xuất Nông Nghiệp
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.53 MB, 242 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS
ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1411100668
: Quách Hồng Thúy
Lớp: 14DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2018
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý
thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai. Các
số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……
Sinh viên
Quách Hồng Thúy
1
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
LỜI CÁM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Viện Khoa Học Ứng Dụng
cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt
những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Hai, người đã
định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời
gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin c ảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí
nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những
lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc
sống
Tp. Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……
Sinh viên
Quách Hồng Thúy
2
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
i
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1
1.
Tính cấp thiết của đề tài…………………………………………………….. 1
2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………… 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu……………………………………………….. 2
4. Ý nghĩa đề tài khoa học………………………………………………………….. 2
5. Các kết quả đạt được của đề tài…………………………………………………...3
6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:……………………………………………………. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………. 4
1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp………………………………………………. 4
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu……………………………………………………………. 4
1.1.2 Phân loại……………………………………………………………………… 5
1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên………………………………. 5
1.1.4 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 6
1.1.5 Đặc điểm sinh hóa…………………………………………………………….. 6
1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử…………………………………….. 8
1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp………………….. 10
1.1.8 Mức độ an toàn sinh học……………………………………………………… 16
1.2 Tổng quan về các chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long……………. 16
i
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
1.2.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng………………………………………………… 16
1.2.2 Tác hại của bệnh đốm trắng: ………………………………………………….19
1.2.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh…………………………………………… 19
1.2.4 Phân loại……………………………………………………………………… 21
1.2.5 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 22
1.2.6 Lịch sử nghiên cứu…………………………………………………………… 22
1.3 Nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Fusarium sp.)…………………………… 25
1.3.1 Giới thiệu về bệnh héo vàng trên cây ớt……………………………………… 25
1.3.2 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh chủ yếu…………………………………... 25
1.3.3.Lịch sử nghiên cứu……………………………………………………………. 27
1.3.4 Phân loại……………………………………………………………………… 27
1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên………………………………. 27
1.3.6 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 28
1.4 Giới thiệu về enzyme ngoại bào……………………………………………….. 29
1.4.1 Tổng quan về Enzyme Chitinase……………………………………………... 29
1.4.2 Tổng quan về Enzyme Cellulase……………………………………………... 32
1.5 Phân giải lân khó tan trong đất ………………………………………………….35
1.5.1 Khái niệm…………………………………………………………………….. 35
1.5.2 Sự chuyển hóa lân trong đất………………………………………………….. 36
1.5.3 Vi sinh vật phân giải lân khó tan……………………………………………... 37
ii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
1.6 Khả năng sinh IAA……………………………………………………………... 39
1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA……………………………………………………… 40
1.6.2 Khái niệm…………………………………………………………………….. 41
1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)…………………. 42
1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)……… 44
1.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông
nghiệp………………………………………………………………………………..45
1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài……………………………………………………….. 45
1.7.2 Nghiên cứu trong nước……………………………………………………….. 46
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 48
2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………. 48
2.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………………... 48
2.2.1 Vật liệu……………………………………………………………………….. 48
2.2.2 Hóa chất………………………………………………………………………. 48
2.2.3 Môi trường……………………………………………………………………. 49
2.3.Thiết bị và dụng cụ……………………………………………………………... 50
2.3.1 Thiết bị……………………………………………………………………….. 50
2.3.2 Dụng cụ………………………………………………………………………. 51
2.4 Bố trí thí nghiệm………………………………………………………………... 52
2.5 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………….. .54
iii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 54
2.5.2 Phương pháp pha loãng………………………………………………………. 55
2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn……………………………………….. 55
2.5.4 Phương pháp tăng sinh………………………………………………………... 56
2.5.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào……………………………………….. 57
2.5.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa…………………………………… 58
2.5.7 Phương pháp cấy chuyển để bảo quản giống…………………………………. 65
2.5.8 Phương pháp bảo quản giống bằng giữ lạnh…………………………………. 65
2.5.9 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của
các chủng vi khuẩn…………………………………………………………………. 66
2.5.10 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn……………………………………... 69
2.5.11 Khả năng phân giải phosphate khó tan……………………………………... 75
2.5.12 Khả năng sinh IAA………………………………………………………….. 77
2.5.13 Phương pháp đối kháng nấm……………………………………………….. 78
2.5.13 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên trái thanh long……………….. 79
2.5.14 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt………………………… 81
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………… 83
3.1 Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp. từ đất nông nghiệp…………………. 83
3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng…………………………………………… 83
3.1.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các chủng…………………………... 89
iv
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng………………………............ 90
3.2.1 Khả năng sinh enzyme chitinase……………………………………………... 90
3.2.2 Khả năng sinh enzyme cellulase....................................................................... 92
3.3 Khả năng đối kháng nấm của các chủng……………………………………….. 95
3.3.1. Khả năng đối kháng nấm Fusarium sp……………………………………… 95
3.3.2. Khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh
long…………………………………………………………………………………..97
3.4. Khả năng phân giải lân khó tan của các chủng………………………………… 100
3.5 Khả năng sinh IAA của các chủng……………………………………………… 102
3.9 Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn đối với thanh long ứng
dụng bảo quản sau thu hoạch……………………………………………………… 105
3.10 Kết quả hiệu quả đối kháng nấm Fusarium sp. gây chết cây ớt………………. 110
3.11 Định danh các chủng có triển vọng…………………………………………… 117
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………….. 120
4.1. Kết luận …………………………………………………………………………120
4.2. Kiến nghị……………………………………………………………………….. 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………….
122
PHỤ LỤC…………………………………………………………………………
1
v
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
NB: Môi trường Nutrient Broth
NA: Môi trường Nutrient Agar
NMSL: Nước muối sinh lý
PDA: Môi trường Potato D-glucose Agar
PDB: Môi trường Potato D- glucose Broth
LBNT: Lây bệnh nhân tạo
vi
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo
Malarkodi Chelladurai et al (2013)
Hình 1.2: Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long (Nguồn: Viện bảo
vệ thực vật, 2014)
Hình 1.3: Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chin (Nguồn: Viện bảo vệ thực
vật,2014)
Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.
Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum (Jeon CS et al, 2013)
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải cellulase của các chủng
Bacillus spp.
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải chitinase c ủa các chủng
Bacillus spp.
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn – dựng đường chuẩn tế
bào
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ nấm – dựng dường chuẩn nấm
Hình 3.1.: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn. Quan sát ở 100x
Hình 3.2: Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn. Quan sát 100X
Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải chitin (cm)
Hinh 3.4: Đường kính vòng phân giải CMC (cm)
Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của các chủng Bacillus spp.
vii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum của các chủng
Bacillus spp.
Hình 3.7: Hàm lượng photphat khó tan do các chủng Bacillus sp.p. phân giải (Trong đó
A: thí nghiệm; B: đối chứng)
Hinh 3.8: Lượng photphat các chủng Bacillus spp. phân giải theo thời gian
Hình 3.9: Khả năng sinh IAA c ủa các chủng vi khuẩn. (Trong đó A: Bổ sung
tryptophan, B: là không bổ sung tryptophan)
Hình 3.10: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp.
Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 7 ngày
Hình 3.13: Chiều cao cây qua các nghiệm thức
Hình 3.14: Chiều dài rễ qua các nghiệm thức
Hình 3.15: Số lá qua từng nghiệm thức
Hình 3.16: Kết quả giải trình tự gen 16S của mẫu BPS6
Hình 3.17: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BPS6
Hình 3.18: Kết quả giải trình tự 16S của chủng BTA7
Hình 3.19: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BTA7
viii
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp.
Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin,
The Prokaryotes, 2006)
Bảng 3.1 : Hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được
Bảng 3.2 : Kết quả thử nghiệ sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng sau 24 giờ
Bảng 3.4: Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập
Bảng 3.5: Hiệu quả ức chế nấm Fusarium sp. của các chủng vi khuẩn
Bảng 3.6: Hệu lực ức chế nấm bệnh sau 3 ngày, 5 ngày (%)
Bảng 3.7: Khả năng phân giải photphate khó tan sau các khoảng thời gian (𝜇𝑔/𝑚𝑙)
Bảng 3.8: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp. sau 5 ngày
Bảng 3.9: Chỉ số bệnh đốm trắng trên thanh long ở các nghiệm thức
Bảng 3.10: Tỷ lệ (%) nảy mầm, tỷ lệ (%) sống sót, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá
trên cây.
ix
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam ngày càng được nhiều nước
trên thế giới biết đến với những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực như: lúa, gạo, cà
phê, hồ tiêu, ớt, thanh long, vú sữa... Đáp ứng được những tiêu chí về chất lượng của
các nước trên thế giới. Tuy nhiên, nông nghiệp ở nước ta vẫn còn dựa chủ yếu vào
phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Hệ quả, nông dân không chỉ tốn nhiều chi
phí cho hóa chất mà sự đa dạng hệ vi sinh vật đất và chất lượng đất bị suy giảm nghiêm
trọng. Vì vậy, biện pháp sinh học được tập trung nghiên cứu và thay thế dần các biện
pháp hóa học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn Bacillus có khả năng
đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các vi sinh
vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt
(Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017). Do đó, nhiều
chủng Bacillus đã được sản xuất thành chế phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt
Nam, việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo phân bón vi sinh đã được quan tâm và
triển khai (Phạm Văn Toản, 2002). Tuy nhiên, việc sử dụng Bacillus để trừ bệnh hại
vẫn còn khá hạn chế, chủ yếu là nhập chế phẩm từ nước ngoài. Mặt khác, hiệu lực đối
kháng bệnh của các chủng Bacillus vẫn khá biến động. Xuất phát từ những lý do trên,
sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong
sản xuất nông nghiệp.”
2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tổng hợp tài liệu:
+ Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến
đề tài.
+ Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.
1
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và tuyển chọn các
chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ các nguồn đất.
+ Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các chủng
Bacillus spp. để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có nguy cơ gây
bệnh.
+ Bố trí các thí nghiệm khảo sát tương ứng từng thí nghiệm
- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) và Microsoft Excel
2013.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm
bệnh từ các nguồn đất khác nhau.
- Phạm vi giới hạn đề tài: Vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ đất.
4. Ý nghĩa đề tài khoa học
- Ý nghĩa khoa học:
Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng ức chế nấm bệnh đạt hiệu quả
cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của
một số chủng vi khuẩn nhóm Bacillus subtilis.
- Ý nghĩa thực tiễn:
2
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng vi khuẩn
có khả năng ức chế nấm bệnh mạnh ứng dụng để tạo ra các chế phẩm bảo quản sau thu
hoạch thanh long, các loại phân bón sinh học góp phần nâng cao sự phát triển ở cây
trồng, thay thế dần các sản phẩm hóa học góp phần bảo vệ môi trường.
5. Các kết quả đạt được của đề tài
-Phân lập được 8 chủng vi khuẩn, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các
phản ứng test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp.
-Kết quả khả năng ức chế nấm bệnh được thực hiện cho các chủng vi khuẩn phân lập
được làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học.
-Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào quá trình bảo quản sau
thu hoạch thanh long và nâng cao sự phát triển ở cây ớt
6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:
- Phần Mở đầu.
- Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan
đến tài liệu nghiên cứu.
-Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các
dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
-Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài
thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.
-Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề
nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.
3
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp.
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới
kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một số nơi gọi là
khuẩn que hoặc trực khuẩn.
Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩn
hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes.
Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg, có chứa
vi khuẩn hình que (trực khuẩn). Ông đã có bảy năm trước đó được đặt tên là chi
Bacterium. Bacillus sau đó đã được Ferdinand Cohn sửa đổi để mô tả thêm chúng như
là bào tử hình thành bào tử, vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc vi khuẩn kỵ khí.
Giống như các chi khác liên quan đến lịch sử vi sinh vật như Pseudomonas và Vibrio,
267 loài Bacillus có mặt khắp nơi. Chi này có sự đa dạng 16S ribosome rất lớn và đa
dạng về môi trường.
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và
tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn
xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm
1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của
Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến
đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết
của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi
trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng
ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường
4
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy… Ngày nay, Bacillus subtilis
đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong
chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
1.1.2 Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus thuộc:
Kingdom: Bacteria
Division: Firmicutes
Class: Bacilli
Order: Bacillales
Family: Bacillaceae
Genus: Bacillus
1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân
bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đ ất và rơm rạ, cỏ khô nên
được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 6– 10 7 triệu
cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất
hiếm.
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi
một số loài khác như Bacillus haericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,
Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi
trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)
theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita (2007).
5
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
1.1.4 Đặc điểm hình thái học
Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo
Malarkodi Chelladurai et al (2013)
Bacillus spp. là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương
tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Các chủng
Bacillus spp. có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển
nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-0,8µm × 1,8-3
µm. Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus spp. sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện
bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus spp. sẽ nảy mầm và phát triển như
một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, kích
thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần
tâm nhưng không chính tâm theo Hong et al (2009).
1.1.5 Đặc điểm sinh hóa
Bacillus spp. có một số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men nhưng không sinh hơi
các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylose; Indol (-); VP (+); nitrate
6
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
(+); H2 S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+); có kh ả năng di
động và hiếu khí.
Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp.
Phản ứng sinh hóa
Kết quả
Catalase
+
Indol
-
MR
+
VP
+
Citrate
+
Nitrate
+
Gelatin
+
Di động
+
Amylase
+
Arabinose
+
Xylose
+
Saccharose
+
Mannitol
+
Glucose
+
Lactose
-
7
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
Maltose
+
(Theo Holt,1992, trích từ Lý Kim Hữu,2005)
1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử
1.1.6.1 Đặc điểm tế bào
Tế bào Bacillus spp. thường có hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng
sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như
nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa học chủ
yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang điện tích dương đóng vai trò là duy
trì cấu trúc của vách tế bào theo McKenney et al(2013).
1.1.6.2 Cấu tạo bào tử
Bacillus spp. sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế
bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử. Bào tử là một cấu
trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của
quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào
phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng
tạo bào tử là Bacillus và Clostridium. Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp bào
tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp
vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein
mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng c ủa bào tử. Vỏ của
bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide
và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu
trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt theo McKenney
et al (2013).
1.1.6.3 Đặc điểm của bào tử
8
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
Bào tử ở Bacillus spp. không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là
dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn
điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện
khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong
xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ
250 triệu năm đến nay vẫn còn sống theo Hong et al (2009). Nhiệt độ 1000C, bào tử
của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được
nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại
hóa chất cũng như các loại tia sáng.
Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức
ăn hoặc có tích lũy các s ản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình
hình thành bào tử. Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+.
1.1.6.4 Sự nảy mầm của bào tử
Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong những đặc điểm quan
trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất
định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất lợi.
Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8 giờ để
hoàn tất. Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được
gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm
và sinh trưởng.
Nảy mầm
Protein chứa nhiều cystenin trong áo bào tử hóa xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến
sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong áo bào tử giảm xuống.
Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử
lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp vỏ bào
9
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hóa, bắt đầu quá trình
tổng hợp thành tế bào.
Trong quá trình nảy mầm, các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang,... bắt đầu giảm dần,
lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polypeptide dần dần mất đi, bắt đầu việc tổng hợp
DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng.
Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành tế bào
còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngo ại
lai để thực hiện quá trình biến nạp.
Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực
tím, áp suất và chất sát trùng.
Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố:
Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến
tính protein khi tăng nhiệt độ.
Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2 + và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp
với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ.
Các enzyme và các ho ạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng
không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.
Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các
chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp.
Bacillus spp. là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây
trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng,
10
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, có thể phân hủy các thành phần
thực vật già cõi, hệ sợi nấm đã chết của các loài nấm khác nhau thành các hợp chất hữu
cơ nhỏ hơn, theo thời gian tạo thành lớp mùn cho đất (Markovich và Kononova, 2003;
Narasimhan và Shivakumar, 2012). Vi khuẩn Bacillus subtilis nằm trong nhóm vi
khuẩn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cho cây. Trong các vi sinh vật
đối kháng, vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại
nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi
khuẩn khác nhờ vào khả năng sinh ra các chất kháng sinh (Lê Đức Mạnh và cộng sự,
2003; Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thu Hoa, 2005; Nguyễn Xuân Thành và cộng sự,
2003; Võ Thị Thứ, 1996).
Tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng
sinh. Cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh
hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng
thời tạo ra một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng
và Hoàng Đức Thuận, 1976).
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt,
các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi
trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có
thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên
trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình
thành bào tử, một vài tế bào Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế
bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng
tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình
thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng,
phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng
11
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp
tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn
kiệt, vi khuẩn Bacillus subtilis sẽ tiết ra các chất kháng sinh tiêu diệt vi khuẩn bên cạnh
để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang
sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
Chủng vi sinh vật có thể tiết ra chất kháng sinh, cạnh tranh về dinh dưỡng hoặc tấn
công trực tiếp lên tơ nấm gây bệnh, hay tiết ra những chất kích thích sinh trưởng giúp
cho cây trồng tăng khả năng kháng bệnh.
* Tiết kháng sinh:
- Chi vi khuẩn Bacillus tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner et al., 1996),
bacillomycin (Volpo n et al., 1999), iturin A2 (Yoshida et al., 2002), prodigrosin và (+)(S)- dihydroaeruginoic acid (Carmi et al., 1994; Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). Theo
Carmi et al. (1994) thì DAPG, PRN, PLT và (+)-(S) dihydroaeruginoic acid có khả
năng hạn chế các nấm gây bệnh cây như Sclerotium rolfsii, Colletotrichum
gloeosp.orioides và Rhizoctonia solani. Trong các loại kháng sinh trên, DAPG và
PRN được phát hiện khá nhiều ở các chi vi khuẩn đối kháng. Có loại kháng sinh có phổ
ức chế rộng như DAPG, nó có thể ức chế được cả nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây hại
(Nguyễn Thị Thu Nga, 2003).
Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin,
The Prokaryotes, 2006)
Loài
TÁC DỤNG CỦA CÁC LOẠI KHÁNG SINH
Đối kháng Ức
vi
chế Kháng
khuẩn quá trình phổ rộng
Gram
tạo sợi
sinh Đối
nấm
kháng Đối
kháng
vi
12
