Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus kháng vibrio gây bệnh trên tôm sú (penaeus monodon)

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường đại học Nha Trang đã tạo một môi
trường học tập và cơ hội quý báu cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện (Công nghệ
sinh học và môi trường) đã tận tình dìu dắt, dạy bảo tôi trong suốt khóa học 2006 – 2010.
Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
 TS. Nguyễn Văn Duy, người thầy đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn chính cho
tôi.
 Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện khóa luận tại trường.
 Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã
nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại phòng thí
nghiệm.
 Các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh
học của khóa 48, 49, 50 Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã giúp đỡ nhiều cho tôi.
Các bạn lớp 48 CNSH, phòng 304.K5 – những người bạn đồng hành luôn bên cạnh và giúp
đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!
Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết ơn vô
hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi.
Nha Trang, 25/6/2010
Sinh viên


Dư Thị Lưu


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software

For evaluation only.
ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. Tổng quan về Vibrio 2

1.1.1. Đặc điểm sinh học của Vibrio 2

1.1.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản 3

1.2. Tổng quan về Bacillus 9

1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus 9

1.2.2. Bacillus – nhóm vi khuẩn đối kháng Vibrio 10

1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus kháng Vibrio trên tôm nuôi 13

1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài 13

1.3.2. Những nghiên cứu ở trong nước 14

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1. Vật liệu 16

2.1.1. Mẫu tôm sú 16

2.1.2. Môi trường 16

2.1.3. Thiết bị chuyên dụng: 17

2.2. Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1. Phân lập Bacillus 17

2.2.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Bacillus 17

2.2.3. Phân lập Vibrio 18

2.2.4. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Vibrio 18

2.2.5. Tuyển chọn các chủng Bacillus kháng Vibrio 18

2.2.6. Nhuộm Gram 19

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
iii

2.2.7. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi 19

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1. Phân lập Bacillus từ mẫu tôm sú 20

3.2. Phân lập Vibrio từ mẫu tôm sú 21

3.3. Tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính kháng Vibrio 22

3.3.1. Tuyển chọn vòng 1 - khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio 22

3.3.2. Tuyển chọn vòng 2 – khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio 24

3.3.3. Khả năng kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus theo thời gian nuôi cấy 25

3.4. Đặc điểm sinh học của 4 chủng Bacillus được tuyển chọn 28

3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy 28

3.3.2. Đặc điểm hình thái 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC













Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
iv

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu Chữ viết tắt
1 APW

Nước peptone kiềm

2 BOD Biochemical oxygen demand
3 CFU
Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

4 LB Luria Bertani
5 OD Optical Density (Mật độ quang)
6 TCBS Thiosulphate Citrate Bile Sucrose





Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Số lượng các chủng Bacillus trên tôm sú 20
Bảng 2. Số lượng các chủng Vibrio trên tôm sú 21
Bảng 3. Hoạt tính kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng Bacillus
trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37
o
C 23
Bảng 4. Hoạt tính kháng 6 chủng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường
LB, ở nhiệt độ 37
o
C 25
Bảng 5. Hoạt tính kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB sau
24h nuôi cấy, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37
o
C 26
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7, B 3.10)
sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37

o
C 31
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng
Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn
(D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37
o
C 23

Hình 2. Khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio (V 1.1, V 1.3, V 2.1, V 2.4, V 3.1 và
V 3.3) của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính
vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37
o
C 25

Hình 3. Hoạt tính kháng Vibrio V 1.3 của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7
và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37
o
C 27

Hình 4. Vòng kháng Vibrio V 1.1 của 4 chủng Bacillus lựa chọn sau 24h nuôi
cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30
o
C 27

Hình 5. Vòng kháng Vibrio V 1.1 của chủng Bacillus B 1.1 sau 24h nuôi cấy
trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30
o
C 28

Hình 6. Khả năng sinh trưởng của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B
3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ
28 – 30
o
C 29

Hình 7. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 2.2 sau 24h nuôi cấy trên môi trường
LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37
o
C 30

Hình 8. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 1.1 sau 24h nuôi cấy trên môi trường
LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37
o
C 30

Hình 9. Khuẩn lạc chủng B 3.7 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ
37
o
C 31

Hình 10. Khuẩn lạc chủng B 3.10 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt
độ 37
o
C 31

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

1
MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản được phát triển rất mạnh ở các nước châu Á, Mỹ La tinh và
Đông Nam Á. Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu
tiên, trong đó ngành nuôi tôm là ngành mũi nhọn, nhằm mục đích: tăng kim ngạch xuất
khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao hiệu quả sử dụng
đất và tạo công ăn việc làm cho người lao động. Năm 2002, Việt Nam đã xuất khẩu trên 2
tỷ USD từ sản phẩm thủy sản, trong đó tôm chiếm 50%, đứng hàng thứ 5 trên thế giới, và
đang phấn đấu đạt 4,5 – 5 tỷ USD vào năm 2010. Năm 2004 sản lượng nuôi trồng thủy sản
đạt mức 1,4 triệu tấn/năm, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản. Diện tích nuôi trồng thủy
sản mỗi năm một tăng, tính đến năm 2005 đạt 750 nghìn ha (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên
Thành, 2007).
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác được nuôi
để lấy thực phẩm. P. monodon là loài tôm được nuôi rộng rãi nhất trên thế giới. Hàng năm
hơn 900.000 tấn tôm sú được tiêu thụ, hai phần ba số đó đến từ các trại tôm ở Đông Nam
Á.
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), năm 2009 tôm
là mặt hàng thủy sản xuất khẩu duy nhất tăng cả về lượng và giá trị so với năm 2008 và
đưa ra dự báo: năm 2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực, kim ngạch dự kiến sẽ
đạt 1,4 tỉ USD.
Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở
nhiều cơ sở nuôi trồng. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch
bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Vấn đề ô nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn
thừa tôm không sử dụng được lớn, tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật

thủy sinh phù du trong môi trường nhiều. Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những
nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi
bị bệnh. Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường
nước và phòng bệnh là cấp thiết.
Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra,
nhất là ở tôm sú. Các bệnh vi khuẩn đó là bệnh đầu vàng, thân đỏ, đốm trắng và phát sáng.
Các bệnh này càng trở nên nghiêm trọng do ảnh hưởng của hiện tượng El Nino làm tăng
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

2
nhiệt độ môi trường, trong đó bệnh phát sáng hiện đang gây hậu quả rất nặng nề. Bệnh này
do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm sú và một số loài tôm khác. Bệnh xuất hiện từ giai
đoạn ấu trùng, tôm bột đến tôm trưởng thành ở trong cả bể ương và ao nuôi.
Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao
nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi
trường và con người. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư
lượng kháng sinh trong vật nuôi, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Do đó, cần
chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Phương pháp sử
dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: phân hủy các
chất hữu cơ thừa, đối kháng với vi khuẩn gây bệnh…đã được áp dụng. Một trong những
nhóm vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn Bacillus.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus
kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon)”.
Mục tiêu chung của đề tài là: lựa chọn được những chủng Bacillus kháng Vibrio
gây bệnh trên tôm sú để đưa vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm nâng
cao năng suất và phát triển bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản nói chung, nghề nuôi
tôm sú nói riêng.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
 Phân lập các chủng Bacillus và Vibrio trong ruột tôm sú

 Tuyển chọn các chủng Bacillus đối kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú
 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Bacillus lựa chọn



Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Vibrio
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Vibrio
Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạng hình que hay hình dấu
phẩy, kích thước tế bào 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Vibrio không hình thành bào tử và có khả
năng chuyển động nhờ một tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

3
Là các vi khuẩn bắt màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase
dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H
2
S (Trần Linh Thước,
2008). Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp
ở 20 – 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa
cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biển và trên biển. Môi
trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp
Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio được chia làm 2 nhóm:
nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; nhóm không có khả
năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng
cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 – 30
o
C (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).

Các loài Vibrio có mật độ cao trong môi trường nước, bao gồm cả cửa sông, vùng
nước ven biển và trầm tích biển và khắp nơi trong nuôi trồng thủy sản. Một số nghiên cứu
cho thấy Vibrio xuất hiện với mật độ dày đặc trong sinh vật biển, như san hô, cá, động vật
thân mềm, tôm, cỏ biển, bọt biển và động vật nổi (Thompson và cs, 2004). Kết quả nghiên
cứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ
Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió
mùa hay áp thấp nhiệt đới (Đỗ Thị Hòa, 1997).

.
1.1.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản
Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi
khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp
hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường
như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosis ở
động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Vibrio là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với động vật nuôi thủy sản. V.
anguillarum, V. salmonicida, và V. vulnificus là ba trong số những tác nhân gây bệnh chính
cho vài loài cá, và V. harveyi là tác nhân gây bệnh chủ yếu cho tôm thẻ chân trắng
Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon. Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên
cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột
ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson và cs, 2004).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

4
Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát
triển, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi
thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
a) Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại Việt Nam
Trong hơn một thập niên qua, sản lượng thủy sản từ khai thác và nuôi trồng tăng

đáng kể đạt 120,7 triệu tấn năm 1995. Nếu tính từ năm 1989 sản lượng gia tăng hàng năm
khoảng 15,6 triệu tấn. Hầu hết sản lượng gia tăng đến từ nuôi trồng thủy sản (FAO, 1997).
Riêng đối với nghề nuôi tôm, từ năm 1984 đến năm 1995 sản lượng tăng hàng năm
khoảng 16,8%, trong đó chủ yếu là nghề nuôi tôm sú (sản lượng tôm sú nuôi trong năm
1995 chiếm khoảng 96,3% tổng sản lượng tôm nuôi).
Tuy nhiên từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các
nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do
dịch bệnh (FAO, 1997). Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới
giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996
và đến năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn (World Shrimp Farming, 1997). Tại Việt Nam trong
hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh
ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994).
Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng Sông Cửu Long cho thấy
các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn vibrios và các virus quan trọng như
MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo
và cs, 1997). Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính
nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Vấn đề này dường như khá phổ biến ở
các nước châu Á, nơi mà việc nuôi tôm được xem là hoạt động chính yếu. Dựa vào khoảng
49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh
là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi.
Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi
khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa
sông và vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996). Điều này được chứng minh từ kết quả phân
lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao
nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Sae-Oui và cs, 1987; Songsrem và cs,
1990; Ruangpan và cs, 1997). Chất thải từ hệ thống tiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

5

ngờ là nguồn chứa vi khuẩn phát sáng (Shariff và Subasinghe, 1992). Hơn nữa vùng gần
bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla - Pitogo và cs, 1990).
Trước đây, nhóm vibrios được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội, nghĩa là chỉ gây bệnh
trong điều kiện môi trường xác định (Lightner, 1988). Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch
xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra cho thấy loài này dường như được xem
là vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải là vi khuẩn cơ hội (Lightner và cs,
1992). Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng
thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100% (Lightner, 1983).
Các kỹ thuật chẩn đoán trước đây chủ yếu dựa vào phương pháp phân lập vi khuẩn
kết hợp với các triệu chứng bệnh tích cũng như mô bệnh học. Hiện nay có thể dùng kỹ
thuật khuếch đại ADN để chẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio trong vài giờ mà không phải
mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn (Dalsgaard và cs, 1996).
b) Một số bệnh điển hình ở cá, tôm nuôi
Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi
động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế
giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ. Ở Việt Nam ngay từ những năm 1989 – 1990,
các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng: bệnh vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất
phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm ở Việt
Nam, có thể gặp ở bất kì ở một cơ sở sản xuất nào (Đỗ Thị Hòa, 1995, 1997). Hầu
như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác
hại của bệnh vibriosis, như: các loài tôm he và tôm thẻ (Lightner, 1996; Liopo và
cs, 2001). Các loài tôm hùm châu Mỹ và tôm hùm châu Á đều có thể nhiễm bệnh do
Vibrio (Fisher, 1997; Roald, 1981; Bowser, 1981; Đỗ Thị Hòa, 2001). Các loài cua
biển cũng thường xuyên chịu ảnh hưởng của bệnh này: cua xanh đã bị chết với tỷ lệ
> 50% do Vibrio (Tukiash, 1970); loài cua đá đã bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở
nhiệt độ 20
o
C sau 24h (Newman và Feng, 1982). Các loài cá biển nuôi có giá trị
kinh tế ở khu vực châu Á như cá mú, cá chẽm, cá hồng… đều chịu tác hại của bệnh
này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cs, 2001). Một số bệnh ở

động vật thủy sản do Vibrio gây ra như sau:
 Bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

6
Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều
quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường
bị bệnh này. Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ
nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu.
Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ
của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở
các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã
phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus,
và V. anguillarum (Phan Thị Vân và cs, 2000). Ngoài ra có những thông báo khác
về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm
khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa
và cs, 2004).
 Bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác
Bệnh này còn có thể có các tên gọi khác: bệnh vỏ, bệnh đốm nâu, đốm đen,
bệnh hoại tử phụ bộ. Ở cua biển khi bị bệnh này gọi là bệnh rỉ sắt, bệnh hoa mai.
Giáp xác khi bị bệnh này thường có một số dấu hiệu sau: xuất hiện các vùng mềm
trên vỏ kitin, sau đó tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng, tại đó vỏ kitin bị ăn mòn,
các phần phụ (chân bò, chân bơi, râu…) và đuôi tôm có thể phồng lên rồi mòn cụt
dần. Sắc tố Melanin bị khuếch đại, sự mờ đục của đốt bụng thứ 6 và xuất hiện sắc tố
đen nâu trên mô gan tụy. Bệnh này có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau: tôm
mẹ, tôm thịt, ấu trùng và hậu ấu trùng trong các trại giống. Cũng có trường hợp
bệnh xảy ra kèm theo một số dấu hiệu khác trong các ao nuôi tôm như: tôm bị bệnh
thường bẩn mình, bẩn mang, có màu hồng đỏ trên cơ thể, yếu, bỏ ăn rồi chết. Có
nhiều loại Vibrio được phân lập từ bệnh này: Vibrio alginoliticus. V.

parahaemolyticus, V. ordali,…(Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
 Bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm
Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra,
nhất là ở tôm sú. Trong thời gian gần đây nhiều bà con nuôi tôm sú bị thiệt hại nặng khi
mua phải tôm sú giống nhiễm bệnh phát sáng.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

7
Khi tôm bị bệnh phát sáng thường yếu, lờ đờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong
bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục. Khi bệnh xảy ra trong các trại giống, tác hại
thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng như zoea, mysis. Khi bệnh xảy ra ở dạng
cấp tính có thể làm tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong bể ấp
do sự nhiễm khuẩn toàn thân. Bệnh phát sáng thường gây tác hại lớn ở giai đoạn ấu trùng
và hậu ấu trùng. Giai đoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng, nhưng tác
hại thấp hơn. Từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng người ta đã phân lập được Vibrio harveyi, V.
vulificus và V. parahaemolyticus.
 Một số bệnh khác
Vi khuẩn Vibrio có thể tham gia vào một số bệnh khác như: gây chết ở ấu trùng
động vật thân mềm, gây bệnh đường ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác…(Đỗ Thị Hòa và
cs, 2004).
c) Phương pháp phòng trị bệnh
Phương pháp phòng bệnh
Để phòng bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây ra người ta thường áp dụng
nhiều biện pháp khác nhau, như: làm tốt công tác vệ sinh trước và sau mỗi vụ nuôi, điều
chỉnh độ mặn và nhiệt độ cho ao nuôi, xử lý môi trường trong các giai đoạn nuôi, tăng
cường hệ miễn dịch cho động vật nuôi,…
Việc đầu tiên phải làm trước mỗi vụ nuôi là làm tốt công việc sát trùng bể, ao, dụng
cụ và nguồn nước trước mỗi đợt sản xuất. Đối với ao nuôi phải cải tạo ao thật kỹ, vét sạch
bùn đáy, bón vôi, phơi ao, khoáng hóa nền đáy tiêu diệt mầm bệnh. Nguồn nước phải được

sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa
học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương
pháp sinh học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của
Vibrio…(Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh. Vì vậy
cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển của
Vibrio (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004). Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng
tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m.
Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do đông vật
thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh. Cần xifon đáy và lọc
nước để loại bỏ các chất hữu cơ lắng đáy và lơ lửng trong bể ấp và thay nước đáy trong ao
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

8
thâm canh. Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác,
tránh dư thừa. Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn
(formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn. Có thể dùng chế
phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm lượng chất thải
hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh. Không dùng kháng sinh
(antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, BKC…) để diệt khuẩn
ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ
dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng. Khi bệnh đã xảy ra, trước khi
xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn (Đỗ
Thị Hòa và cs, 2004).
Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi
trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo
kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản. Một biện pháp hữu hiệu
nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi
sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku

và Biodream trộn vào thức ăn sẽ giúp cho động vật thủy sản tiêu hoá tốt. Các vi sinh vật
này sẽ cạnh tranh thức ăn với các vi khuẩn Vibrio gây bệnh và chiếm địa bàn ở đường ruột
của vật nuôi, loại bỏ vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong ruột vật nuôi.
Với hình thức nuôi các lồng bè, cần lựa chọn nơi đặt lồng có lưu tốc dòng chảy
thích hợp để tăng trao đổi nước và loại bỏ các chất thải. Thường xuyên làm vệ sinh thành
lồng để giảm mật độ vi khuẩn trong lồng. Tránh các xây xát do tác động cơ học và kí sinh
trùng. Có thể treo túi sát trùng ở góc lồng để diệt khuẩn trong nước (Đỗ Thị Hòa và cs,
2004).
Như vậy để phòng trị bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây bệnh gây ra cần
thực hiện tốt các biện pháp từ khâu chọn giống ban đầu, cải tạo ao loại bỏ hết các chất hữu
cơ vào đầu vụ và cuối vụ, thực hiện nuôi tôm trong độ mặn thấp, giữ nước có màu xanh vỏ
đậu, hạn chế khả năng tăng cao nhiệt độ, không cho ăn dư, tăng cường sức khỏe tôm nuôi
bằng thức ăn giàu dinh dưỡng, vitamine và bổ sung chế phẩm probiotic, xử lý môi trường
nuôi và có mật độ nuôi phù hợp với trình độ quản lí …
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

9
Phương pháp trị bệnh
Khi bệnh vibriosis đã xuất hiện, có thể dùng kháng sinh để trị bệnh. Tuy vậy cần
dùng thuốc theo hai hướng (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004):
 Diệt vi khuẩn cảm nhiễm bên trong cơ thể bằng cách trộn kháng sinh vào thức ăn
như một số kháng sinh thuộc nhóm sulpamid: sulfamethoxine, bactrim, cotrim: 15 – 20g/
kg thức ăn, cho tôm ăn liên tục trong 5 – 7 ngày; oxonilic acid 25%: 2 – 5g/ kg thức ăn,
cho ăn trong 5 – 7 ngày.
 Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường bằng một số
biện pháp kĩ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn như:
benzalkonoum chloride (BKC), iodine… sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại màu
nước.
Tuy vậy ở giai đoạn tiền ấu trùng và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi

với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy
dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả.
Với trình độ kĩ thuật như ngày nay, chưa có phương pháp điều trị nào có thể dập tắt
được các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra cho động vật thủy sản nhưng có thể lựa chọn các
biện pháp khác nhau để khống chế và ngăn ngừa bệnh.
1.2. Tổng quan về Bacillus
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, tế bào hình que và thẳng, kích thước 0,5 –
2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao, bắt màu Gram dương. Các loài thuộc chi
Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào
tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Mỗi tế bào sinh dưỡng thường
chỉ hình thành một nội bào tử. Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi
nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi. Bào tử có màng nhiều lớp, chứa ít nước
tự do và do đó có thể chịu đựng tốt với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào
dinh dưỡng (Lương Đức phẩm, 1998; Gordon, 1973). Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa
dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh
hơn. Các tế bào thường có hoạt tính catalase dương tính. Nhiều loài Bacillus có khả năng
kháng nhiệt, các pH cực trị, điều kiện khô hạn, tính mặn, chất khử và các phân tử có hại
khác (Gordon, 1973).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
10
Chi Bacillus rất đa dạng về sinh lý và sinh thái. Một số chủng là hiếu khí bắt buộc
nhưng một số khác lại là kị khí tùy tiện. Các chủng của một số loài sinh trưởng tốt trong
môi trường chứa glucose, amonium sulphate và một vài muối khoáng nhưng các chủng
khác lại cần nhân tố sinh trưởng. Về điều kiện pH, đa số các chủng sinh trưởng tốt ở pH 7
nhưng B. alealophilus thì ở pH 9 – 10 và B. acidocaldarius thì ở pH 2 – 6. Về nhiệt độ, các
vi khuẩn ưa nóng sinh trưởng thích hợp ở 45 – 75
o
C hoặc cao hơn, còn các vi khuẩn ưa

lạnh sinh trưởng tốt từ - 5 đến 25
o
C (Gordon, 1973).
Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong đất, nước, không khí do có khả năng hình
thành nội bào tử và đời sống hiếu khí, một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong
đường ruột của người và động vật (Lương Đức phẩm, 1998).
Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ, như
protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra
amylase làm loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân tiếp theo thành
các dextrin và các loại đường hợp thành. Một số chủng thuộc loài Bacillus subtilis, B.
mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym xenlulase và hemixenlulase phân hủy
xenlulose, hemixenlulose (Lương Đức Phẩm, 1998).
Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra bacterioxin – chất có
hoạt tính kháng sinh, như insulin, subtilin từ Bacillus subtilis, bacterioxin từ B.
licheniformis…Các chất có hoạt tính này thường không dùng trong y tế nên không xảy ra
hiện tượng nhờn thuốc đối với các vi sinh vật gây bệnh. Riêng bacitraxin là chất kháng
sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột và kích
thích tiêu hóa cũng như tăng trọng của vật nuôi (Lương Đức Phẩm, 1998).
Khả năng gây bệnh của chi Bacillus đối với các sinh vật khác là không phổ biến.
Có 4 loài B. theringiensis, B. larvae, B. popilliae, B. lentimorbus và một số chủng của B.
sphaericus gây độc với côn trùng. B. anthracis được coi là loài duy nhất độc cho người và
động vật (Gordon, 1973) (nếu không kể tới B. cereus gây viêm đường tiêu hóa qua thức
ăn).
1.2.2. Bacillus – nhóm vi khuẩn đối kháng Vibrio
Phần lớn các loại bệnh trên thủy sản có nguyên nhân từ thức ăn và sự ô nhiễm môi
trường sống của thủy sản. Việc xử lý ao, hồ bằng hóa chất và lạm dụng thuốc kháng sinh
đã dẫn đến tình trạng các chất này tồn đọng trong môi trường cũng như tích tụ trong cơ thể
thủy sản làm ảnh hưởng đến sức sống thủy sản nuôi dẫn đến việc giảm sản lượng nuôi
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

11
trồng (Nguyễn Văn Hảo và cs, 2004; Arulampalam và cs, 1998; Walter và Stephenb,
1998). Mặt khác, nhiều loại vi sinh vật trở nên kháng thuốc và trở thành những mầm bệnh
nguy hiểm đối với vật nuôi. Một trong những hậu quả cực kỳ nghiêm trọng của hoạt động
trên là vấn đề dư lượng kháng sinh trong thủy sản đang được nhiều nước như EU, Mỹ,
Canada… sử dụng như một rào cản kỹ thuật để hạn chế sản phẩm thủy sản nhập từ Việt
Nam và nhiều nước khác. Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các
plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh sẽ truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản
sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người. Vì lẽ đó ngày nay nhiều loại kháng
sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản. Bắt đầu từ năm 2006, cộng đồng châu Âu đã
cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Phương pháp sử dụng các vi khuẩn có lợi, tức là các vi khuẩn probiotic, để loại trừ
các vi khuẩn có hại bằng quá trình cạnh tranh ngày càng được sử dụng nhiều hơn để thay
thế phương pháp sử dụng kháng sinh.
Kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản
Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất
sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm 1989,
Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có
khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật
trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ. Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa
hay dự phòng sinh học (Lương Đức Phẩm, 1998).
Cơ sở của việc ứng dụng các loại vi khuẩn probiotic này là khả năng sinh chất ức
chế vi khuẩn gây bệnh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và năng lượng, cạnh tranh vị trí bám
dính với vi khuẩn có hại trên cơ thể động vật nuôi, cải thiện chất lượng nước, là nguồn
dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch của động vật nuôi
(Verschuere và cs, 2000).
Các chất ức chế do vi khuẩn probiotic sinh ra bao gồm: các chất kháng sinh,
bacteriocin, siderophores, lysozym, protease, hydroperoxit và các acid hữu cơ (làm biến
đổi giá trị pH). Sự có mặt của các chất ức chế này trong ruột của vật chủ, trên bề mặt hoặc

trong môi trường nuôi đã tạo ra một hàng rào ngăn chặn sự sinh sôi của tác nhân gây bệnh.
Các nhà vi sinh học đã đưa ra các bằng chứng sau: Lactobacillus sp. có thể sản sinh
bacterocin gây ức chế sinh trưởng đối với các vi khuẩn khác. Các vi khuẩn biển có thể sản
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
12
sinh enzyme phân giải chống lại Vibrio parahaemolyticus. Alteromonas sp. dòng B-10-31,
phân lập từ nước biển gần bờ biển của Nhật Bản sản sinh monastatin có tác dụng ức chế
hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V. alguillarum (Phạm Văn Ty và Vũ
Nguyên Thành, 2007).
Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể được sử dụng như probiotic để cạnh
tranh sắt với các vi khuẩn gây hại. Bản thân vi khuẩn có hại bị loại bỏ thì cũng có nghĩa là
loại bỏ được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn
probiotic và cho vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách
cạnh tranh dành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác. Vi khuẩn bám dính
trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào chất bám dính (adhesin) của vi khuẩn và
các phần tử thụ thể của thượng bì ruột) và cơ chế không đặc trưng (yếu tố hóa lý học)
(Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể
chống lại tác nhân gây bệnh. Chất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả của
kháng thể của vật chủ. Trong thực nghiệm người ta thấy động vật thí nghiệm được bổ sung
vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột khá rõ rệt. Tôm
không có khả năng tạo kháng thể vì không có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Probiotic có tác
dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất
hữu cơ trong nước ao nuôi, giảm hàm lượng BOD và giảm độc do amoni, nitrite và H
2
S,
khống chế được vi khuẩn gây bệnh. Ngoài các kiểu tác động trên, vi khuẩn probiotic còn

góp thêm enzyme cho vật chủ cũng như cung cấp các nguyên tố đa vi lượng cho vật chủ,
giúp chúng sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và tăng trưởng tốt hơn (Phạm Văn Ty và Vũ
Nguyên Thành, 2007).
Riêng đối với nhóm vi khuẩn Bacillus, chúng có khả năng sinh các chất lipopeptide
và các chất kháng sinh (Stein, 2005; Verschuere và cs, 2000). Chất lipopeptide hoạt động
như chất hoạt hóa bề mặt do vậy tạo điều kiện để cho các tế bào vi khuẩn probiotic tiếp xúc
với tế bào vi khuẩn gây bệnh, do vậy các chất kháng sinh có thể xâm nhập vào tế bào
(Verschuere và cs, 2000). Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu
cơ chứa nitơ, như protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào (Lương Đức Phẩm,
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
13
1998), do đó nó có tác dụng lớn trong việc xử lý môi trường cải thiện chất lượng nước ao
nuôi.
Một số vi khuẩn probiotic chính hay được sử dụng trong nuôi tôm thuộc các chi:
Lactobacillus, Pseudomonas, Nitrobacter và Bacillus (Lai Thuy Hien và cs, 2005; Lê Thị
Bích Phượng và cs, 2003; Moriarty, 1999; Smith và Davey, 1993; Verschuere và cs, 2000).
Một nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn Bacillus đông lạnh cũng đem lại lợi ích. Các lợi ích
đã được chứng minh bao gồm khống chế bệnh dịch bằng vi khuẩn truyền bệnh V. harveyi,
thúc đẩy quá trình thực bào, tăng hoạt động của melanin và kháng khuẩn.
Các dòng Bacillus spp chọn lọc đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm chế sự
lây nhiễm của các loài Vibrio (Moriarty, 1998; Rengpipat và cs, 1998). Cả Moriarty (1998)
và Rengpipat và cs (1998) đều chỉ ra rằng chế phẩm sinh học có thể có hiệu quả ngăn chặn
các loài vi khuẩn phát sáng Vibrio. Cơ chế can thiệp có thể là sự kết hợp của sự canh tranh
giữa các vi khuẩn và các hợp chất kháng sinh khác nhau do Bacillus spp tạo ra. Khi sử
dụng vi khuẩn Bacillus spp, mức phát sáng do vi khuẩn V. harveyi thấp hay gần như triệt
tiêu và cho kết quả nuôi rất tốt. Việc bổ sung thêm Bacillus spp. đã đem lại lợi ích cho tôm
trong việc chống bệnh phát sáng và khỏe mạnh hơn và dẫn tới việc tăng sản lượng nuôi.
Rất nhiều chế phẩm sinh học đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi tôm, đặc biệt tại
khu vực Châu Á. Các chế phẩm sinh học hoạt động như một phần trong tổng thể quản lý

hoạt động nuôi tôm bền vững nhằm chống lại nguồn gây bệnh trong qui trình nuôi. Các chế
phẩm sinh học trong nuôi tôm có một vai trò quan trọng trong phân hủy các chất hữu cơ và
tác động làm giảm đáng kể lớp bùn và nhớt trong ao. Kết quả là cải thiện chất lượng nước,
giảm lớp bùn đáy, giảm tỷ lệ mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi hôi và
sau cùng tăng sản lượng nuôi. Qua việc gia tăng sự phân hủy các chất hữu cơ, amino acid
và glucose được giải phóng sẽ cung cấp nguồn thức ăn cho các vi sinh vật có ích. Thành
phần vô cơ của nitrogen như ammonia, nitrite và nitrate sẽ giảm thiểu Khi chất lượng
nước và hệ số chuyển đổi thức ăn được cải thiện, sức khỏe và hệ miễn dịch của tôm sẽ tăng
lên về tổng thể có tác dụng ngăn ngừa nguồn gây bệnh hơn là điều trị bệnh.
1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus kháng Vibrio trên tôm nuôi
1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài
Trong một nghiên cứu của Ravi và cs (2007) đã phân lập được 109 chủng vi khuẩn
từ môi trường nước biển, trầm tích biển và từ ruột cá, trong đó tìm ra được ba chủng (Q,
Q1 và M) có khả năng đối kháng chống lại các chủng Vibrio. Dựa vào trình tự 16S rDNA
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
14
đã định danh được chủng Q là Paenibacillus spp, chủng Q1 là Bacillus cereus và chủng M
là Paenibacillus polymyxa. Hai chủng Paenibacillus spp và B. cereus đã được thử nghiệm
trên ấu trùng tôm sú và cho kết quả là có hoạt động probiotic kháng lại các loài Vibrio gây
bệnh (Vibrio harveyi và Vibrio spp).
Balcázar và Rojas-Luna (2007) đã nghiên cứu hoạt động kìm hãm của chủng
probiotic Bacillus subtilis UTM 126 chống lại các loài Vibrio gây bệnh trên tôm thẻ chân
trắng. Kết quả cho thấy B. subtilis UTM 126 có hoạt động kìm hãm chống lại ba chủng
Vibrio gây bệnh được phân lập từ tôm bệnh, đó là V. harveyi, V. alginoliticus và V.
parahaemolyticus. Các vòng kháng khuẩn trên đĩa thử nghiệm đo được với đường kính vào
khoảng 10 – 15 mm.
Thử nghiệm in vitro nhằm kiểm soát vi khuẩn V. harveyi đã được thực hiện bởi
Phianphak và cs (1997) bằng cách sử dụng chế phẩm Bacillus S11 trộn vào thức ăn của
tôm. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của V. harveyi còn 74%.

1.3.2. Những nghiên cứu ở trong nước
Vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn có đặc tính probiotic được sử
dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học cho người và động vật. Từ các mẫu đất ao nuôi tôm,
phân giun làm thức ăn nuôi tôm, từ đường tiêu hóa của tôm, nhóm các nhà nghiên cứu Khuất
Hữu Thanh và cs (2009) đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn lactic và Bacillus. Trong đó
18/32 chủng vi khuẩn lactic và 12/28 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính đối kháng vi
khuẩn Vibrio và vi khuẩn kiểm định. Trong nghiên cứu này đã xác định trình tự 16S rRNA
của các chủng LPG 5, LRT8, BaD và BaRT. Chủng LPG 5 tương đồng 100% với chủng
Lactobacillus acidophilus LH5, chủng LRT8 tương đồng 98% với chủng Lactobacillus
helveticus IMAU40107, chủng BaD tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis EBS05,
chủng BaRT tương đồng 97% với chủng Bacillus sp. RSP-GLU. Chế phẩm probiotic tạo
được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống
tăng khoảng 15%, trọng lượng tôm 120 ngày tuổi tăng khoảng 13% so với đối chứng.
Với mục tiêu chọn ra các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng kháng vi khuẩn gây
bệnh cho tôm để tạo chế phẩm sinh học trong nước nhằm xử lý nước nuôi tôm công
nghiệp, Đặng Phương Nga và cs (2006) đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn
Bacillus sp. HY1 có khả năng kháng Vibrio tốt từ môi trường phân lập là nước nuôi tôm.
Tiếp sau nghiên cứu trên, Đặng Phương Nga và cs (2007) đã tiến hành nghiên cứu khả
năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio của Bacillus subtilis HY1.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
15
Ở Việt Nam những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh để cải thiện
môi trường nuôi tôm hoặc có tác dụng probiotics còn tương đối ít. Trong những năm gần
đây Bộ thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh, nhiều nơi đã làm
quen với với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt, tuy nhiên cần có
một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng.
Việc phân lập các chủng vi khuẩn probiotic là việc làm mang nhiều tính chất kinh
nghiệm, ít cơ sở khoa học, vì vậy có vô số các nghiên cứu về probiotic bị thất bại, điều đó
có thể là do việc lựa chọn các chủng vi sinh không thích hợp. Các bước lựa chọn được xác

định, nhưng cần phải thích ứng với từng sinh vật chủ và từng môi trường. Cần phải hiểu cơ
chế hoạt động của probiotic để vạch rõ tiêu chuẩn chọn lọc các probiotic hữu hiệu.




Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
16
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu tôm sú
Các mẫu tôm sú được thu mua từ chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa trong
tháng 3 năm 2010.
2.1.2. Môi trường
+ Alkaline Peptone Water (APW):
Peptone
NaCl
Nước cất
10g
10g
1 lít
Điều chỉnh pH môi trường đạt 8,5 ± 0,2. Hấp ở 121
o
C trong 10 phút (Trần Linh
Thước, 2008).
+ Lauria Broth (LB):
Triptone

NaCl
Cao nấm men
Agar
Nước cất
10g
10g
5g
15g
1 lít
Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở 121
o
C
trong 15 phút.
+ Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS):
Cao nấm men
Peptone
Sucrose
Sodium thiosulfate.75H
2
O
Sodium citrate.72H
2
O
Sodium cholate
Oxgall
NaCl
Ferric citrate
Bromothymol blue
5g
10g

20g
10g
10g
3g
5g
10g
1g
0,04g
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
17
Thymol blue
Agar
Nước cất
0,04g
15g
1 lít
Cho các chất vào nước cất đã làm ấm và đun nóng để hòa tan. Chỉ để vừa sôi rồi
nhấc ra ngay. Không hấp khử trùng. Để nguội đến 50
o
C rồi đổ đĩa (Trần Linh Thước,
2008).
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng
Một số thiết bị chuyên dụng được sử dụng trong đề tài bao gồm: tủ cấy vô trùng
(Ohaus, Tây Ban Nha); tủ sấy (Binder, Germany); nồi hấp thanh trùng (Sturdy, Đài Loan);
máy đồng nhất mẫu, lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc); máy định lượng protein bằng
quang phổ hấp thụ phân tử (Varian, Úc), kính hiển vi ba mắt ngắm có camera và máy tính
(MOTIC BA300, Trung Quốc); tủ ấm (Memmert, Đức);…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập Bacillus

Cân 5g mẫu (ruột và cơ quan nội tạng của tôm sú) cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml
canh thang tăng sinh để có độ pha loãng 10
-1
, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher
trong 1 phút (Trần Linh Thước, 2008). Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt
độ phòng. Mẫu sau khi đã ủ tăng sinh thì đem gia nhiệt ở 80 - 85
o
C trong 15 phút để tiêu
diệt các tế bào sinh dưỡng, chỉ còn lại bào tử Bacillus chịu nhiệt (Lương Đức Phẩm, 1998).
Các bình tam giác sau khi gia nhiệt được đậy kín và cho vào tủ ấm 30
o
C trong 2
ngày (Lương Đức Phẩm, 1998) để bào tử được hoạt hóa và mọc trở lại. Sau 24h đem pha
loãng thành các nồng độ 10
-2
đến 10
-7
. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2008) từ ba
nồng độ 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
cho vào môi trường thạch dinh dưỡng đã chuẩn bị trong các đĩa
petri vô trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ
đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu
vào tủ ấm 37
o
C trong 1 – 2 ngày. Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ

các loài thuộc chi Bacillus. Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các dòng thuần
chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống
(Lương Đức Phẩm, 1998).
2.2.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Bacillus
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
18
Trong sản suất, nghiên cứu, việc hoạt hoá giống và thường xuyên kiểm tra chất
lượng của giống là hết sức cần thiết. Giống đã và đang bảo quản cần được hoạt hóa trước
khi sử dụng cho nghiên cứu hoặc sản xuất tiếp theo. Để hoạt hóa giống người ta thường sử
dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng như: cao nấm men, nước
chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, axit béo,…Giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể
duy trì được những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá giống và không làm mất
hoạt tính.
Chúng tôi đã nuôi cấy chủng Bacillus trên môi trường lỏng LB ở nhiệt độ 28 -
30
o
C, lắc 200 vòng/phút.
Đề tài này được thực hiện trong thời gian ngắn nên chúng tôi đã bảo quản giống
Bacillus trên môi trường thạch nghiêng (LB). Các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 – 6
o
C.
Định kỳ cấy truyền giống, 2 – 3 tháng cấy truyền lại một lần.
2.2.3. Phân lập Vibrio
Cân 5g mẫu (ruột và cơ quan nội tạng của tôm sú) cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml
canh thang tăng sinh alkaline peptone water (APW) để được nồng độ pha loãng 10
-1
. Đồng
nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Ủ ở 37
o

C trong 6 – 8 giờ (Trần Linh Thước, 2008). Mẫu sau
khi đã ủ tăng sinh thì đem pha loãng thành các nồng độ 10
-2
đến 10
-5
. Hút 0,1 ml mẫu từ ba
nồng độ 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
cho vào môi trường thạch TCBS đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô
trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch
và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm
37
o
C trong 18 – 22 giờ (Trần Linh Thước, 2008). Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để
lựa chọn sơ bộ các loài thuộc chi Vibrio. Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các
dòng thuần chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng (TCBS) trong ống
nghiệm để giữ giống.
2.2.4. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Vibrio
Tương tự như Bacillus, Vibrio cũng cần được nuôi cấy trước khi dùng cho các
nghiên cứu, thử nghiệm. Vibrio được chúng tôi nuôi trong môi trường APW, ở nhiệt độ 28
- 30
o
C, lắc 150 vòng/phút.
Các chủng Vibrio được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng (TCBS) trong ống
nghiệm, bảo quản ở 4 – 6
o

C. Định kỳ cấy truyền giống, 2 – 3 tháng cấy truyền lại một lần.
2.2.5. Tuyển chọn các chủng Bacillus kháng Vibrio
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.
19
Từ môi trường giữ giống, các chủng Bacillus và Vibrio được đưa vào môi trường
lỏng tương ứng (Bacillus nuôi trên môi trường LB, Vibrio nuôi trên môi trường APW) và
nuôi hoạt hóa qua đêm ở 37
o
C. Khi mật độ tế bào của Vibrio đạt khoảng 10
4
CFU ml
-1
và
mật độ tế bào Bacillus đạt khoảng 10
5
CFU ml
-1
thì Vibrio được trang đều trên bề mặt đĩa
thạch chứa môi trường LB đã chuẩn bị sẵn (Ravi và cs, 2007). Sau đó đục các lỗ thạch
đường kính khoảng 5 mm, hút 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Bacillus cho vào các lỗ khoan
(Sarker và cs, 2008). Đem các đĩa đã cấy vào tủ ấm 37
o
C, sau 1 – 2 ngày quan sát các vòng
kháng khuẩn và xác định đường kính của nó.
2.2.6. Nhuộm Gram
Nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus lựa chọn được tiến hành qua các bước như sau:
 Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và
để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên
vết mẫu).

 Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng
1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
 Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1
phút, sau đó rửa bằng nước cất.
 Bước 4: Dùng cồn 95
o
tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu
(khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
 Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó
rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính
dầu.
2.2.7. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi
 Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn
Các chủng Bacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường LB, lắc với tốc độ 200
vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30
o
C. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu
bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
 Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm
trong cồn 95
o
. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.