Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỪ PHẠM TP. Hồ CHÍ MINH
Nguyễn Thị Trần
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI
KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT
VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM
Chuyên ngành: Vỉ sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH
NGƯỜI HƯỚNG DÃN KHOA HỌC :
PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM
Thành phố Hồ Chí Minh -
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành bởi sự nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lương Đức Phẩm, người đã tận
tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô
Trần Thanh Thủy đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo, cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh,
trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức và thực hiện thành công
khóa đào tạo thạc sĩ chuyên ngành Vi Sinh Vật (2006 - 2009) , tạo cơ hội học tập nâng
cao trình độ về lĩnh vực mà tôi tâm huyết.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường trung học phổ thông Ngô
Quyền, phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn Phòng khoa học công nghệ - sau đại học, trường Đại học sư
phạm thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành
đúng tiến độ.
MỞ ĐÀU
Ngày nay với các hiểu biết của mình về vi sinh vật con người đã sử dụng chúng

vào trong các lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học
để phục vụ cho đời sống của con người. Ta biết rằng trong quá trình sống của thế
giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản
ứng này luôn gắn chặt với sự có mặt của enzim với hiệu suất xúc tác cực ki lớn so
với các chất vô cơ và hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao. Do đó các chế phẩm
enzim thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công nghiệp, sản xuất thực
phẩm và trong chăn nuôi Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều
nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Song trong cơ thể động
vật và thực vật quá trình tổng hợp enzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ
thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó. Nguyên liệu động
vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết
và bảo quản ở -20°c, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và
thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu
ngày càng cao về enzim. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa
rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao. Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất
và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta
có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu
protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn
hẳn. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu,
phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzỉm protease từ đất vườn”.
Với các nội dung sau:
■ Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacỉllus từ đất vườn.
■ Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản.
■ Nghiên cứu nuôi cấy trên môi truờng tiêu chuẩn và môi truờng thay thế để
thu đuợc sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao.
■ Nghiên cứu phuơng pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt
lực cao.
> Ý nghĩa của đề tài

♦♦♦ Ý nghĩa khoa học
Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc
của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi
truờng và ảnh huởng của môi truờng nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu
enzym protease của vi khuẩn.
♦♦♦ Ý nghĩa thực tiễn
Dựa trên những gì thu đuợc trong quá trình nghiên cứu góp phần giúp xác
định đuợc một số môi truờng dinh duỡng phù họp có thể ứng dụng vào qui
mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm enzym protease có
hoạt tính cao.
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vỉ khuẩn Baciỉỉus
1.1.1. Đặc điểm chung
Baciỉỉus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng
có khả năng bình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc
các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều a- amylase và protease kiềm,
có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase.
♦ Bacỉllus là vi khuẩn Gram dương
♦ Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(l,2-10)pm.
♦ Bacỉllus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.
♦ Dinh dưỡng : Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ
oxi hóa các họp chất hữu cơ
♦ Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.
♦ Bacỉllus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế
bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh
dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành
tể bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ.
Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì
chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi
khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức

thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi.
♦ Đa số Bacỉllus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 1 0
như Bacỉllus alcalophillus, hay có loại phù họp với pH = 2-6 như Bacỉllus
acidocaldrius. [7]
♦ về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45°c - 75°C), hay ưa lạnh (5°c -
25°C), nhưng thường gặp Bacỉllus sống ở nhiệt độ 34°c - 37°c.
Hầu hết Bacỉllus không gây độc cho người và động vật. Một số loại gây độc cho
côn trùng . Chùng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong
công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp
Sau đây là một số loài Bacỉllus thường gặp trong tự nhiên:
l.l.l.l. Bacillus subtilis [4], [14], [17], [18]
Bacỉllus subtỉlỉs được nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là
Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872
Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ khô nên còn được
gọi là trực khuẩn cỏ khô.
Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 X (3-5) pm.
Bacillus subtiỉis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo
thành chuồi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ.
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn,
lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào
môi trường thạch.
Bacỉllus subtỉlỉs có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo chủ yếu từ
polypeptit chủ yểu là axit polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn
có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ
thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể
quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy màng nhày
của vi khuẩn Bacillus subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt
màu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.
Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Bacỉllus subtỉlỉs là 36°c -
50°c, tối đa khoảng 60°c, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng

chịu được nhiệt khá cao.
Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6pm - 0,9pm. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát
tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời ki sinh sản của vi khuẩn. Do mỗi tế bào chỉ
tạo ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là một hình
thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi. Bào tử có thể
sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống
trong 200-300 năm của bào tử Bacillus subtilis [6]. Khi gặp điều kiện thuận lợi
những bào tử này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình.
Các vi khuẩn Bacỉllus subtỉlỉs có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit
ở mô thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bi u. Chúng sinh trưởng
trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích
thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chứng góp phần làm hỏng các
nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm
có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hỏng bánh mì và nhiều
thực phẩm khác [16].
Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là a amylase và
protease kiềm có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra
riboílavin ( tiền vitamin B
2
)[3]. Vì vậy chúng được ứng dụng nhiều trong công
nghiệp cũng như một số ngành khác.
1.1.1.2. Bacỉllus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần tế
bào của Bacỉllus subtỉlỉs, chiều ngang (1,2-1,5)pm có thể đến 2pm, dài từ 3pm
-12pm, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, hòn hơn đôi khi hình thoi với đầu
hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen)
[4].
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 X (0,7 - l)pm, bào tử lớn
nhất có đường kính từ 1,2 - 1,5 |im. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang

hoặc xiên của tế bào.[4]
Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn
sóng, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng
sữa hay đục.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kì
một yểu tố sinh trưởng nào.
Bacỉllus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacỉllus
subtilis nên cũng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp.
1.1.1.3. Bacỉllus mensentericus
Bacỉllus mensentericus rất giống Bacillus subtiỉis. Thường có trong đất, hạt
mì và ngũ cốc và đặc biệt là trên khoai tây và cỏ khô.
Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3-10)x(0,5- 0,6)pm.
Đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuồi dài.
Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô
không mọc lan ra môi trường thường có màu màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng
kem, vàng nâu, hồng hoặc đen. [4]
Nhiệt độ thích họp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacỉllus
mensentericus là 36 - 45°c tối đa là 50 - 55°c, ở pH từ 4,5 - 5 thì nó ngừng phát
triển.
Bào tử của Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài khoảng
0,5 - 0,9 pm, nắm ở vị trí bất kì trong tế bào, tế bào thường không phình to khi
mang bào tử.
Bacỉllus mensenterỉcus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn
hẳn Bacillus subtilis nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này
rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, nhất là
các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường, đây cũng là loại được
ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzim protease và amylase Ngoài ra nó
còn sinh ra một hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn( như Vibrio) gọi là
Bacterioxin.
1.1.1.4. Bacỉllus cereus

Te bào của Bacỉllus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) X (3 -5)pm, có khi dày
hơn, chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuổi. Bào tử có hình bầu dục kích
thước 0,9 X ( 1,2 - 1,5 )pm nắm lệch tâm, tế bào chất của nó có chứa các hạt và
không bào.[4]
Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phang, khá khuyếch tán, hơi
lõm, trắng đục, mép lồi lõm [4].
Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong đất, không khí Thường sinh sôi và
nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Nó còn
được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh. [16]
1.1.1.5. Bacỉllus pumỉlus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Baccỉllus pumỉlus có mặt trong
đất nhiều hơn Bacillus subtìỉis.ựỉ]
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó
gần giống với tế bào của Bacillus subtiỉis.ựỉ]
1.1.1.6. Baciỉỉus polymyxa
Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 - 1 ) X (2 -7)pm, đứng
riêng rẽ hay xếp thành đôi hoặc chuồi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ
phồng lên hình quả chanh. [4]
Khuẩn lạc của Bacỉllus polymyxa không màu, phang hoặc lồi, trơn, nhày,
lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.[18]
Bào tử bình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như bình sao. Chúng
phát tán rộng, kích thước dài khoảng ( 1,7 - 2,6) pm, nằm giữa tế bào.
Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có
khả năng cố định đạm.
Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy,
người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi
trường có tính axit yểu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất
thuốc kháng sinh polimixin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ
yểu là cho công nghiệp dược.
1.1.1.7. Bacỉllus brevis

Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Bacỉllus
brevis là trực khuẩn kích thước ( 0,7 -1) X (3 -5 )pm. Chúng thường đứng riêng rẽ.
Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 - l)pm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào
hơi bị phồng to lên. [4]
Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh,
mép răng cưa giống dạng mỡ đặc.
về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn họp axit amin cho sinh
trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin.
1.1.1.8. Baciỉỉus sỉmpỉex
Te bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé , có kích thước ( 2-5)x 0,6pm,
thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi.
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của Bacỉllus cereus, phang khá khuyếch tán, với
bề mặt hơi xù xì. hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacỉllus
simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường. [4]
Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 - 0,9 Ịim, nằm lệch tâm.
1.1.1.9. Bacillus linchennỉformừ
Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất. Chúng sinh trưởng và phát
triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin,
một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong
công nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dùng trong chăn nuôi làm chất kích thích
sinh trưởng.
1.1.2. Một sổ nghiên cứu và ứng dụng của giống Bacillus ở VN và trên thế giới
Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng vào rất nhiều các lĩnh vực sản
xuất khác nhau để phục vụ cho đời sống của con người như :
1.1.2.1. Sinh tồng họp enzim
Ở Việt Nam công nghệ enzym gần như chưa phát triển nhiều. Tuy đã có rất
nhiều các nghiên cứu đề cập đến việc sản xuất các enzym của động vật, thực vật và
vi sinh vật nhưng hầu như chưa có enzym nào được sản xuất với qui mô công
nghiệp. Việt Nam vẫn hoàn toàn lệ thuộc vào nguồn enzym của nước ngoài. [9]
Hiện nay chủng Bacỉllus đang được ứng dụng để sản xuất một số enzym

sau:
Các enzym này có vai trò trong nhiều ngành sản xuất khác nhau.
1.1.2.2. Công nghệ thực phẩm [16]
Việc ứng dụng vi sinh vật vào việc chế biến thực phẩm là những công trình
đầu tiên của con người trong lĩnh vực này. Ngày nay người ta ứng dụng vi khuẩn
Bacỉllus để sản xuất ra các enzym có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm
như amylase dùng để đường hóa tinh bột v.v
1.1.2.3. Dược phẩm và y tế [16]
Trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi, công nghệ vi sinh
vật cũng tạo ra được nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu, nhất là những bệnh nhiểm
khuẩn như : kháng sinh như penixilinase sản xuất từ Bacỉllus subtilis.
1.1.2.4. Nông nghiệp và đời sống [35]
Trong trồng trọt các chất hoạt động do vi sinh vật sinh ra có thể dùng làm
Tên Enzym
Mã số EC
Nguồn
Nội bào(I) /
Ngoại bào (E)
Sản
lượng
Ngành ứng dụng
a-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch
P-Amylase 3.2.1.2 Bacỉllus E + Starch
Glucose isomerase
h
5.3.1.5 Bacỉllus I ++ Fructose syrup
Penicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I
-
Pharmaceutical
Protease 3.4.21.14 Bacỉllus E +++ Detergent

■>
(N guôn http ://www. lsbu. ac .uk/biology/enztech/sources .html)
thuốc trừ sâu và bảo vệ thực vật như Bacỉllus thuringiensỉs gây bệnh cho côn trùng
và các chất trao đổi có tính độc của nó được dùng như những chất diệt côn trùng
đặc hiệu.
1.1.2.5. Bảo vệ môi trường [23]
Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vi chúng
tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất. Nhờ có
các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được thải ra do
hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy.
1.1.3. Hệ enzỉm của vỉ khuẩn Bacilỉus
Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzim có hoạt tính cao như protease,
amylase, xenlulase.
1.1.3.1. Protease
Protease là enzim xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid[-CO-NH-] giữa
các loại axit amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptid) thành axit
amin.
Protease là một nhóm enzim phân giải protein (gồm proteinaza, peptidaza,
desaminaza ) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế
bào.
Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong
việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống.
1.1.3.2. Amylase
Amylase là các enzim xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các
polyoza tưomg tự như dextrin, glucogen. Có hai loại amylase là: a-amylase, P-
amylase và glucoamylase tuy nhiên các chủng Bacỉllus thuờng chỉ có khả năng
tổng hợp a-amylase còn không tổng họp đuợc P- amylase và glucoamylase [9] a-
amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết a-1,4 glucozit nội mạch ở bất kì vị
trí nào trong phân tử tinh bột với cơ chất là amyloza. a- amylase cho sản phẩm thủy
phân chủ yếu là maltoza (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) với cơ chất là

amylopectin, a-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 không thủy phân liên kết 1,6.
Trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao
nhưng lại sinh ra a-amylase chịu nhiệt cao.
1.1.3.3. Xenlulase
Xenlulase là một phức hệ enzim phức tạp xúc tác cho sự thủy phân
xenlulose thành xenlobiose và cuối cùng thành glucose.
Một phức hệ enzim xenlulase gồm 3 enzim chủ yếu đó là:
• Endogluconaza hay CMC-ase: là enzim tấn công chuồi xenlulose một cách
tùy tiện và phân hủy liên kết P-1,4 glucozit.
• Enxogluconase hay xenlobiohydrolase: giải phòng xenlobiose hoặc glucose
từ đầu không khử của xenlulose, tác dụng yểu lên CMC, nhưng tác dụng
mạnh lên xenlulose vô định hình hoặc xenlulose đã được phân hủy một
phần.
• P- glucozidase hay xenlobiose : thủy phân xenlobiose và các xenlodextrin
khác hòa tan trong nước.
1.2. Enzim protease
1.2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35]
Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim
trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu tuy nhiên, việc ứng dụng
enzim trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy.
Từ thế kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men.
Vanhelmont, người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất khí
khác với không khí trong quá trình lên men.
Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình sống đều là
những quá trình hóa học.
Năm 1787, Pabroni cho rằng bản chất quá trình lên men và sự phân giải một
chất này bởi một chất khác là “ferment”.
Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là
enzim.
Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được nghiên

cứu sớm hơn tất cả. Các protease ở động vật được nghiên cứu sớm nhất.
• Từ thể kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát
hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.
• Năm 1836, Schvvann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzim này.
• Năm 1857, Corvisar đã tách được tripsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên
nhận được dưới dạng chế phẩm, những chế phẩm này vẫn còn lẩn nhiều
enzim và protein khác.
• Năm 1861, Brucke đã tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối
tinh khiết.
• Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colodion đã tách
được tripsin với amylase tụy tạng.
• Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin).
Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu về protease trong máu. Schmidt (1869-
1872) đã nêu giả thuyết rằng trong máu có enzim íibrin tham gia vào quá trình làm
đông máu. Tác giả cũng đã tách enzim này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm thu được
có tác dụng làm íibrinogen đông lại nhanh chóng.
Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn
• Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ hạt của một
số loại hạt đậu đều có hoạt tính phân giải protein.
• Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease ở thực vật.
Ồng thấy rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng cồn
kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (lOOg/cây) gọi là papain.
• Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptid hydrolase khác
như:
■ Bromelin protease có trong các phần khác nhau của cây dứa
(Willstatter, Grassmanm, Ambros 1926).
■ Fixin protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938)
Trong khi đó các protease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ năm
1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải

protein của xạ khuẩn. Trong vài chục năm sau đó, số công trình nghiên cứu protease
của vi sinh vật đã phát hiển nhanh chóng. Một số công trình thu protease từ vi sinh
vật như:
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease với số lượng lớn. Các
enzim này có thể ở trong tế bào (nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy
(ngoại bào).
Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease tương đối ly tưởng vì nó có khá nhiều ưu
Enzim, nguồn nguyên liệu Tác giả Năm
Subtilizin A (Bacỉllus subtìlìs) Guntelberg và Ottensen 1950
Peptidase A (Streptococus) Elliot 1950
Protease kiềm (Aspergiỉỉus oryzae) Crewther và Lennox 1950
Aspergilopeptidase A ( Aspergillus satoi) Yoshida 1956
Protease kiềm (Pseudomonas aeruginosa) Morihara 1957
Subtilopeptidase c ( Bacỉllus amyỉoỉique/aciens ) Hagihara và cộng sự 1958
Keratinase (Streptomyces fradỉaè) Nickerson, Durand 1963
Elastase (Pseudomonas aeruginosa) Morihara Tsuzuki 1965
Protease (Arthrobacter) Hofsten và cộng sự 1965
Protease trung tính II (Bacỉllus amyỉosacchariticus) Tsuru và cộng sự 1966
Protease kiềm ( Apergillus sydowi) Danno, Yoshimura 1967
điểm so với các nguồn khác như động vật và thực vật.
1.2.2. Phân loại và các đặc điểm của protease [9], [12], [17]
Protease là enzim thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH của
phân tử protein và peptid thành các axitamin tự do và một ít peptid khối lượng phân tử
nhỏ.
Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các
protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Hiện nay có nhiều
cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì.
I.2.2.I. Theo phân loại quốc tế các enzỉm thuộc nhóm này được chia thành
4 phân nhóm phụ
■ Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ

của mạch polypeptid.
■ Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu
cacbon của mạch polypeptid.
■ Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid.
■ Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
1.2.2.2. Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzỉm (Barrett-1984)
Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này
gồm tên của các axit amin quan trọng nhấtcó vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt
động của enzim.
■ Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của
serine trong trung tâm hoạt động. Các protein serine này thường hoạt
động ở vùng pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
■ Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của
axit amin cystein ở trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc
biệt trong trung tâm hoạt động của enzim, vì nó có khả năng tham gia
phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học
■ Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (- COOH)
trong trung tâm hoạt động. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng
pH là axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME)
và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng thơm hoặc axit amin
kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân.
■ Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm
hoạt động của chúng có những ion kim loại. Nhóm này thường hoạt
động mạnh ở vùng pH trung tính.
1.2.2.3. Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease
Dựa vào pH hoạt động của các protease người ta chia nó ra thành 3 loại:
■ Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8.
■ Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9.
■ Protease trung tính.
Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ

chất vi cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein,
hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.
1.2.3. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vỉ sinh vật [1], [9], [14], [15]
Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những
enzim ngoại bào. Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm
nhiều enzim rất giống nhau về hình dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nên rất khó
tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzim khác nhau
nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt
để và đa dạng. Protease do vi khuẩn tổng họp có khả năng chịu được nhiệt độ cao hơn
các nguồn khác.
Protease là loại enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công
nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp V.V Ở nước ta các nghiên cứu về protease được
bắt đầu từ những năm 60.
I.2.3.I. Trong công nghiệp thực phẩm
Protease của vi khuẩn được sử dụng trong quá trình chế biến cá. Ở mang cá,
đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất phong phú. Khi làm nước mắm, muối cá,
sản xuất bột cá protease có trong ruột cá thủy phân một phần protein của
cá Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ làm tăng hương vị của sản phẩm.
Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt
sau khi chế biến. Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm
tăng hương vị thịt.
Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong
nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm
phụ khác.
Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các
phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da và để sản xuất thức ăn kiêng.
Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat. Protease
làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat
khác nhau. Protease của vi khuẩn có thể thay thể một phần renin. Vì thể, ta có thể
giảm giá thành trong sản xuất phomat. Protease này có thể thu từ Bacillus

mesentericus.
Dùng protease của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành
khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu Nó cũng được sử dụng trong sản xuất
chao và các dịch thủy phân.
1.2.3.2. Trong công nghiệp nước giải khát
Protease được sử dụng để làm trong bia và nước quả. Được sử dụng trong
quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase do
đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột.
1.2.3.3. Trong công nghiệp thuộc da
Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả naăng tách lông
ra khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm và
sạch lông hơn.
1.2.3.4. Trong mỹ phẩm
Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm,
kem bôi mặt Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn. các
loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như:
vết máu. .khá tốt.
1.2.3.5. Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho
vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến
hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng
protease để xử lý sơ bộ thức ăn.
1.2.3.6. Trong nghiên cứu khoa học
Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein
1.2.3.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học
Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng. Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị
tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzim.
Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để chữa
bệnh nghẽn tỉnh mạch. Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết thương, các

0 viêm, làm thông đường hô hấp
1.2.3.8. Trong xử lý rác
Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượng
chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rất
nhanh. Theo tính toán của công ty công trình đô thị I, moi ngày người Hà Nội thải
ra khoảng 1500m
3
rác. Mỗi năm, một người dân ở thành phố Hồ Chí Minh trung
bình thải ra 160 kg rác. Như vậy, khối lượng rác mà thành phố thãi ra mỗi năm là
360000 tấn.
Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổ vào
các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc chất
gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoa màu.
Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó thương hàn tồn
tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày. Rác không được
dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường phố, tạo môi trường tốt
cho ruồi muổi và các loài trung gian truyền bệnh khác phát triển.
Hiện nay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt cho
nhà mát phát điện hoặc nhà mày hơi công nghiệp. Khi đốt như thế các chất thải là
các chất tổng hợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như S0
2
, S0
3
, P20
5
, NO, N0
2
, CO
gây hại cho sức khỏe.
Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý rác

bằng con đường sinh học. Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật.
Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên
Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn protein động vật
và thực vật có trong rác hữu cơ. Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống, đồng
thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành. Một
trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá thể
trồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu tố
dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây trồng,
trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có thể ủ
thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật.
Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50 °c. Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra nhanh hơn
người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces, Azotobacter, một số
nấm mốc như Rhizobium.
Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu cơ
cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hóc môn) công suất 5 tấn/ ngày. Tại đây ủ
phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật. Các điều kiện
bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác.
Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt động
của vi sinh vật làm cho rác hoại kĩ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng.
1.2.3.9. Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan
khác nhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp. Nó sẽ phân giải và hòa
tan lớp nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử
dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quí.
1.3. Thu nhận enzỉm từ vỉ sinh vật
1.3.1. Ưu điểm của việc sản xuất enzỉm từ vỉ sinh vật [9], [16]
Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzim có những ưu điểm sau:
- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzim từ vi sinh vật vì quá trình sinh
trưởng, phát triển và tổng họp enzim của vi sinh vật hoàn toàn không phụ
thuộc vào điều kiện bên ngoài.

- Chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó việc sản xuất
enzim từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 - 60 giờ.
- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzim từ vi sinh vật theo hướng
sản xuất chọn lọc enzim với số lượng lớn.
- Giá thành của enzim sản xuất từ vi sinh vật thấp. Môi trường nuôi cấy vi
sinh vật thường đơn giản và rẻ tiền.
- Các enzim thu được từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao.
- Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzim khác nhau
1.3.2. Lý thuyết về sinh tồng họp enzỉm cảm ứng
Hiện nay người ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng họp enzim trong khi
sản xuất. Các enzim tham gia thủy phân được vi sinh vật tổng họp là những enzim
cảm ứng. Hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzim được Monod-Jacob tìm ra vào
năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rất rõ ở vi sinh vật. Tác động của các yếu tố
bên ngoài lên tế bào vi sinh vật thường là tác động trực tiếp, tế bào vi sinh vật phản
ứng lại các tác động này thường cũng rất nhanh. Chính vì thế ta có thể sử dụng các
yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH và đặc biệt là cơ chất để điều khiển quá trình
sinh tổng họp enzim của vi sinh vật.
Các enzim thủy phân một chất nào đó và khi có mặt chất đó trong môi trường
nuôi cấy thì lượng enzim này được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với bình thường khi
không có cơ chất, được gọi là enzim cảm ứng. Các chất được đưa vào môi trường nuôi
cấy để kích thích tổng hợp ra enzim cảm ứng được gọi là cơ chất cảm ứng. Cơ chất cảm
ứng thường được coi là yểu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng họp
enzim.
Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng họp enzim cảm ứng
của vi sinh vật cũng sẽ tăng dần. Nhưng nếu ta vẫn cứ tiếp tực tăng nồng độ cơ chất lên
đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chựng lại hoặc giảm do hiện tượng tăng áp
suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên.
Như vậy, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim bằng cơ chất cảm ứng cần
chú ý:
- Có gen tương ứng trong nhiểm sắc thể của tế bào.

- Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phần tử enzim đó
- Năng lượng cần thiết dùng cho tổng họp enzim.
- Muốn thu nhận enzim cảm ứng nào thì phài cho cơ chất cảm ứng của enzim đó
vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
- Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng nhất định. Nếu vượt
quá liều lượng này sẽ làm cho quá trình tổng họp enzim giảm. Do đó, không
phải cho càng nhiều cơ chất thỉ khả năng sinh tổng hợp enzim sẽ càng cao.
Bình thường khi không có cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm có trong tể bào sẽ
tương tác với gen điều khiển làm cho quá trình tổng họp enzim bị ức chế. Khi ta cho cơ
chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm và các
gen tương ứng. Enzim được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất. Khi đó chất kìm hãm sẽ
không bi phong tỏa nên tương tác với gen điều khiển ức chế quá trình tổng hợp. Như
vậy, muốn enzim được tổng họp ta phải luôn cho cơ chất cảm ứng vào môi trường.
Trong công nghiệp sản xuất enzim cần phải lựa chọn những cơ chất cảm ứng thích họp
và xác định nồng độ tối ưu của nó trong mội trường để có hiệu quả sinh tổng hợp cao
nhất.
1.3.3. Chọn giống vỉ sinh vật có khả năng sinh enzim cao
Không phải tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sinh enzim như nhau và
ngay cả những chủng của cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng họp
enzim. Vì vậy người ta cần phải lựa chọn trong số rất nhiều loại vi sinh vật để có được
những chủng có hoạt lực cao trong việc tạo ra các enzim thuần khiết. Trong số đó
Bacillus subtilis đã trở thành nguồn chủ yếu trong việc sản xuất ra nhiều loại enzim
khác nhau được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kĩ thuật.
Ngoài ra để nâng cao hoạt tính của enzim người ta còn tiến hành các biện pháp
gây đột biến để tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền của
vi sinh vật tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao hơn hẳn chủng ban
đầu
1.3.4. Ảnh hưởng của yếu tổ môi trường lên khả năng sinh enzỉm
Quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác
nhau. Đe thu nhận được với hiệu suất cao nhất khi phân giải protein bởi sinh khối của

vi sinh vật, ta cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Muốn vậy ta phải nghiên cứu kĩ
các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của vi sinh vật.
1.3.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát hiển của vi sinh vật, khả năng sinh tổng
họp enzim của vi sinh vật, tính chất của enzim được tổng họp. Tùy từng loài vi
sinh vật nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Các loại mốc phát triển thích họp ở
22°c - 32 °c còn các loại vi khuẩn phát triển thích hợp ở 35 °c - 55 °c. Nói
chung, đa số vi sinh vật tổng họp protease không bền nhiệt và bị kìm hãm nhanh
chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích họp.
1.3.4.2. ĐộpH
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến
quá trình tổng họp enzim ở vi sinh vật và hầu như không thay đổi trong quá trình
phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm mốc pH
op
từ 6-6,5 và đối với vi khuẩn pH
op
trung tính từ 6,6-7,4. Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng
rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự phát triển và sự tích lũy protease
của môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện khá rõ ở các loài thuộc giống
Bacỉllus, pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá
trình phát triển của vi sinh vật, pH ban đầu thích hợp cho sự phát triển của vi sinh
vật là đối với nấm mốc pH từ 3,8-5,6, đối với vi khuẩn là 6,2-7,4. Trong quá trình
nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi
chất ở vi sinh vật, pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm. Đối
với các loài thuộc giống Bacillus, pH thường chuyển về phía kiềm. Nhiều khi có
thể căn cứ vào pH của môi trường sau khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease
được tích lũy trong môi trường. Theo tác giả Lê Ngọc Tú- La văn Trứ pH môi
trường ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Do đó, nếu giữ cho
pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo thành
mạnh mẽ một dạng protease xác định, chiếm ưu thế trong môi trường.

1.3.4.3. Ảnh hưởng của độ thông khí
Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng họp
protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật.
Trong một số trường hợp thiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật
nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease.Sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự tổng
hợp protease. Lượng oxi thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật có
khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng
khác nhau đến quá trình tổng họp các protease khác nhau.
1.3.4.4. Độ ẩm
Độ ẩm của môi trường lên men cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh
trưởng của vi khuẩn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt. Thông thường thì các
loại vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hon nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60-
70%.
1.3.4.5. Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh tổng hợp enzim cực đại là
trong khoảng 36-48 giờ. Tuy nhiên để phân giải protein đạt hiệu suất cao nhất, đòi
hỏi thời gian lâu hơn, để enzim phân giải đối với cơ chất tự nhiên.
1.3.5. Ảnh hưởng của thành phần môi trường
Ngoài các yếu tố của môi trường thì thành phần và tỷ lệ của các chất dinh dưỡng
có mặt trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp
protease của vi khuẩn. Để tăng lượng protease cho môi trường cần lựa chọn nguồn c, N,
muối khoáng thích họp và đặc biệt cần sử dụng chất cảm ứng.
1.3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn c thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các gluxit như: mono,di,
polysaccarit (tinh bột), Đặc tính và tác dụng của nguồn Cacbon phụ thuộc vào bản
chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn Cacbon tự nhiên
thường được dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và
nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích họp cho quá trình sinh tổng họp
protease cũng thay đổi tùy loài vi sinh vật.
1.3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn Nỉttf

Các chất có thể dùng làm nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật có thể là các
chất hữu cơ hoặc các muối hữu cơ (amon, nitrat). Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng