Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu đặc tính Enzyme Chitinase từ nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014
i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dƣơng Văn Hợp
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2014
ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Dƣơng Văn Hợp và
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà đã tận tình giúp đỡ, dìu dắt và hƣớng dẫn tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thị Hoàng Yến, Ths. Nguyễn Anh
Tuấn cùng toàn thể cán bộ trong Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật
học, Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo cho tôi suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, bạn bè và ngƣời
thân đã giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều.
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp
đỡ quý báo nói trên.

Hà Nội, tháng 06 năm 2014
Học viên
Nguyễn Thị Hồng Nhung

iii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN ...................................... 3
1.1.1. Chitin ........................................................................................................... 3
1.1.2. Chitosan ....................................................................................................... 4

1.2. SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGO CHITOSAN .......................... 4
1.2.1. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con đƣờng hoá học ......... 4
1.2.2. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con đƣờng sinh học ........ 6
1.3. VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOSACCARIT .................................... 6
1.3.1. Đối với nông nghiệp .................................................................................... 6
1.3.2. Đối với môi trƣờng ...................................................................................... 7
1.3.3. Ứng dụng trong y học .................................................................................. 7
1.3.4. Trong công nghiệp ....................................................................................... 8
1.3.5. Trong thực phẩm .......................................................................................... 8
1.4. KHÁI QUÁT VỀ CHITINASE.......................................................................... 9
1.4.1. Định nghĩa chitinase .................................................................................... 9
1.4.2. Những nguồn chính sản sinh chitinase ........................................................ 9
1.4.3. Phân loại chitinase ..................................................................................... 11
1.4.4. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase ......................................... 13
1.4.5. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase ................................................ 14
1.5. VAI TRÕ CỦA CHITINASE .......................................................................... 17
1.5.1. Trong nông nghiệp ..................................................................................... 17
iv


1.5.2. Trong Y học ............................................................................................... 18
1.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI .......... 18
1.6.1. Trên thế giới ............................................................................................... 18
1.6.2. Trong nƣớc ................................................................................................. 20
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 22
2.1. ĐỐI TƢỢNG .................................................................................................... 22
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ........................ 22
2.3. MÔI TRƢỜNG................................................................................................. 22
2.3.1. Môi trƣờng PDA (Potato Dextro Agar) nuôi cấy và giữ giống (g/l) ......... 22
2.3.2. Môi trƣờng LCA (Low Carbon Agar) để phân loại hình thái học (g/l) ..... 23

2.3.3. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani)-agar (g/l) ................................................. 23
2.3.4. Môi trƣờng lên men dịch thể (g/l) nghiên cứu chitinase ........................... 23
2.3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme chitinase trên đĩa thạch ........................ 23
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 23
2.4.1. Phƣơng pháp sàng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase của các chủng nấm sợi .. 23
2.4.2. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm sợi sinh tổng hợp chitinase ........................... 24
2.4.3. Phƣơng pháp định tính enzyme chitinase .................................................. 24
2.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng chitinase [58 ..................................................... 25
2.4.5. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC- Thin layer chromatography)......... 28
2.4.6. Phƣơng pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật ................................... 29
2.4.7. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng
hợp chitinase của nấm sợi ....................................................................................... 29
2.4.8. Tinh sạch sơ bộ enzyme chitinase ............................................................. 31
2.4.9. Điện di SDS-PAGE ................................................................................... 32
v


2.4.10.

Xác định hoạt tính chitinase trên Semi-Native PAGE ........................... 33

2.4.11.

Xác định một số đặc tính của enzyme chitinase tinh sạch ..................... 34

2.4.12.

Phân loại chủng nấm sợi nghiên cứu ...................................................... 35

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 40

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CHITIN CAO ............................................................................................................. 40
3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA 44 CHỦNG NẤM
SỢI ĐÃ TUYỂN CHỌN ............................................................................................ 41
3.3. ĐỊNH LƢỢNG CHITINASE 10 CHỦNG NẤM SỢI TUYỂN CHỌN .......... 42
3.4. NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHỦNG VN10-1103 ....................................... 43
3.4.1. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 43
3.4.2. Phân loại dựa trên phƣơng pháp sinh học phân tử..................................... 44
3.5. LỰA CHỌN MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP
CHITINASE CỦA CHỦNG VN10-1103 .................................................................. 45
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy................................................................... 45
3.5.2. Lựa chọn pH môi trƣờng ........................................................................... 46
3.5.3. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy........................................................................ 47
3.5.4. Lựa chọn nguồn carbon ............................................................................. 49
3.5.5. Nồng độ nguồn carbon phù hợp ................................................................ 50
3.5.6. Lựa chọn nguồn nitơ .................................................................................. 51
3.5.7. Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ ..................................................................... 52
3.5.8. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ............................................................. 53
3.6. TINH SẠCH SƠ BỘ CHITINASE .................................................................. 54
3.7. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TINH SẠCH ....... 56
vi


3.7.1. pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme ........................................................ 56
3.7.2. Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng enzyme ....................................................... 57
3.7.3. Độ bền nhiệt của enzyme ........................................................................... 58
3.7.4. Độ bền pH của enzyme .............................................................................. 59
3.7.5. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ................................................................ 60
3.7.6. Khả năng phân giải cơ chất của enzyme.................................................... 62
3.7.7. Khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm ................................................ 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 65
Tài liệu Tiếng Việt...................................................................................................... 65
Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................................... 65
PHỤ LỤC .................................................................................................................... - 1 -

vii


DANH MỤC VIẾT TẮT

T n ầy

Viết tắt

Axit deoxyribonucleic riboxom

ADNr

Cacboxymethyl cellulose

CMC

Đối chứng

ĐC

Môi trƣờng 1

MT1

Internal Transcripbed Spacer

ITS

Môi trƣờng 2

MT2

Môi trƣờng 3

MT3

Môi trƣờng 4

MT4

Môi trƣờng 5

MT5

Môi trƣờng 6

MT6

N–acetyl- D- glucosamine

GlcNAc

Optical Density

OD

Polymerase Chain Reaction

PCR

(Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Sodium dodecyl sulfat

viii

SDS


DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA

Hình 1. Cấu trúc phân tử chitin ...................................................................................... 3
Hình 2. Cấu trúc phân tử chitosan ................................................................................. 4
Hình 3. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma ............................. 14
Hình 4. Đồ thị chuẩn biểu diễn độ hấp thụ của N-acetyl glucosamin ở bước sóng
500nm ............................................................................................................................. 27
Hình 5. Quy trình tinh sạch enzyme chitinase sinh tổng hợp bởi chủng nấm sợi lựa
chọn ................................................................................................................................ 32
Hình 6. hả n ng phân giải cơ chất chitin của c c chủng nấm sợi .............................. 42
Hình 7. Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) chủng VN10-1103 ............................... 44
Hình 8. Sản phẩmPCR ITS –D1D2 ADNr của chủng VN10-1103 trên gel agarose)... 44
Hình 9. Cây phát sinh chủng loại của chủng VN10-1103 và c c loài có mối quan hệ
họ hàng gần, cây được xây dựa vào phân tích trình tự gen ADNr dựa vào trình tự
đoạn ITS và D1D2 .......................................................................................................... 45

Hình 10. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy trên c c pH môi
trường kh c nhau ........................................................................................................... 47
Hình 11. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy ở c c nhiệt độ kh c
nhau ................................................................................................................................ 48
Hình 12.

hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 trên c c nguồn carbon

khác nhau ....................................................................................................................... 49
Hình 13.

hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy ở c c nồng

độ colloidal chitin khác nhau ......................................................................................... 51
Hình 14. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trên
c c nồng độ cao nấm men kh c nhau ............................................................................ 53
Hình 15. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tại c c thời gian
nuôi cấy .......................................................................................................................... 53
Hình 16. Biểu đồ biểu thị c c phân đoạn trong tinh sạch chitinase VN10-1103 .......... 55
ix


Hình 17. Sản phẩm điện di SDS-PAGE (A) và Semi-native PAGE (B) của chitinase
VN10-1103 ..................................................................................................................... 56
Hình 18. Ảnh hưởngcủa pH lên hoạt tính chitinase của B.bassiana VN10-1103 ........ 57
Hình 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt động của chitinase từ B.bassiana VN101103 ................................................................................................................................ 58
Hình 20. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của enzyme chitinase từ B.bassiana
VN10-1103 ..................................................................................................................... 59
Hình 21. Ảnh hưởng của pH lên độ bền chitinase của B. bassiana VN10-1103 ........... 60
Hình 22. Ảnh hưởng của c c ion kim loại lên hoạt tính chitinase của chủng VN101103 ................................................................................................................................ 61

Hình 23. hả n ng phân cắt c c cơ chất kh c nhau của chitinase sinh tổng hợp bởi
chủng VN10-1103........................................................................................................... 62
Hình 24. hả n ng kh ng Fusarium oxysporum (A) và Shigella flexneri (B) của chế
phẩm của chủng VN10-1103 .......................................................................................... 63

x


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. C c loại m y móc dùng trong nghiên cứu ........................................................ 22
Bảng 2. Nồng độ pha loãng N-acetyl glucosamin (mg/ml) ............................................ 26
Bảng 3. ết quả đo độ hấp thụ của đường N-acetyl glucosamin ở bước sóng 500nm.. 26
Bảng 4. Thành phần bản gel SDS-PAGE (12,5% polyacrylamid) ................................ 32
Bảng 5. Thành phần bản gel semi- native PAGE (12,5% polyacrylamide) ................. 33
Bảng 6. Hoạt tính enzyme chitinase của 438 chủng nấm sợi nghiên cứu..................... 40
Bảng 7. ết quả hoạt tính enzyme của 44 chủng nấm sợi nghiên cứu trên MT1 .......... 41
Bảng 8. Hoạt tính chitinase của 10 chủng nấm sợi ...................................................... 43
Bảng 9. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 trên c c môi trường nuôi cấy ...... 46
Bảng 10.

hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trên c c

nguồn nitơ kh c nhau ..................................................................................................... 51
Bảng 11.

ết quả tinh sạch chitinase từ B.bassiana VN10-1103 ................................. 54

Bảng 12. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase của 438 chủng nấm sợi ....................... - 2 -

xi


MỞ ĐẦU
Chitin, chitosan và oligochitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực nhƣ: thực phẩm, nông nghiệp, y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử
lý môi trƣờng…[26]. Chitin là một polysaccharide có nhiều trong cua, tôm, giáp
xác, côn trùng và thành tế bào nấm, thực vật [28]. Việt Nam là nƣớc có nguồn thuỷ
sản rất dồi dào, công nghiệp chế biến thuỷ sản cũng rất phát triển tạo ra một lƣợng
lớn phụ phẩm nhƣ đầu tôm, vỏ cua, mai mực, đó chính là nguồn nguyên liệu phong
phú cho công nghiệp sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó.
Hiện nay, phƣơng pháp hóa học thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất chitin,
protein trong đầu và vỏ tôm đƣợc loại bỏ bằng cách xử lý với NaOH, sau đó đƣợc
xử lý với axit HCl loãng nhằm loại muối. Sản xuất chitosan và oligo chitosan đƣợc
bắt đầu bằng quá trình loại nhóm axetyl từ chitin đƣợc thực hiện nhờ xử lý trong
kiềm ở nhiệt độ cao, sau đó chitosan đƣợc xử lý với axit HCl để thu đƣợc sản phẩm
là chitosan oligome. Quá trình sản xuất này cần một lƣợng hoá chất rất lớn, sự tích
lũy các hóa chất này gây hại cho môi trƣờng, hơn nữa con đƣờng xử lý hoá học làm
giảm chất lƣợng cũng nhƣ mức độ an toàn của sản phẩm chitosan.
Để giải quyết vấn đề trên, quy trình sản xuất theo con đƣờng sinh học bằng
cách sử dụng enzyme chitinase và chitin deaxetylase để sản xuất ra sản phẩm chitin,
chitin oligosaccarit, chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng
đang đƣợc quan tâm. Enzyme chitinase thƣờng gặp trên nhiều loài vi sinh vật, kể cả
những loài không chứa chitin, nhƣ vi khuẩn, xạ khuẩn, virut, nấm, côn trùng. Trong
đó, nấm là nhóm vi sinh vật có tiềm năng rất lớn trong việc sinh tổng hợp nhiều hợp
chất có hoạt tính sinh học, phân giải nhiều hợp chất phức tạp, có vai trò quan trọng
trong các chu trình vật chất ngoài tự nhiên. Đặc biệt, nấm có khả năng sinh tổng
hợp nhiều loại enzyme thủy phân có hoạt tính cao. Nguồn chitinase từ nấm cho hoạt
tính cao, sản lƣợng lớn và ổn định.
Với mong muốn tiếp tục nghiên cứu này, đề tài: Nghi n cứu các ặc tính

enzyme chitinase từ nấm sợi” đƣợc thực hiện nhằm: a) Tuyển chọn chủng nấm sợi

1


sinh tổng hợp chitinase cao; b) Nắm đƣợc đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi.

2


Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN

1.1.1. Chitin
Trong lịch sử, chitin đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong cặn lắng dịch chiết
của nấm. Chấtnày đƣợcđặt tên"Fungine" đểghi nhớnguồn gốccủa nó[14]. Năm
1823, Odiertách chiếtmột chấttừbọ cánh cứng, màônggọi làchitinhoặc"chiton"
(tiếng Hy Lạp có nghĩalàáo giáp). Tuy nhiên, ông đã không phát hiệnsự có
mặtcủanitơtrongchấtnày.

Odiercuối

cùngkết

luậnchitincócông

thứcgiống

nhƣcellulose[47].

Hình1. Cấu trúc phân tử chitin[23]
Chitinlàpolymer đứng thứ hai sau sinh khối thực vật trên trái đất vớiƣớc tính
sản lƣợng sản xuấthàng nămtừ1010 đến 1011tấn. Chitin là polysaccarit mạch thẳng,
công thức chung là (C8H13O5N)ncó thể xem nhƣ là dẫn xuất của cellulose, trong đó
nhóm hyđroxyl (-OH) ở nguyên tử C(2) đƣợc thay thế bằng nhóm axetyl amino
(NHCOCH3) (cấu trúc I). Nhƣ vậy chitin là poly (N-axetyl-2-amino-2-deoxi-β-Dglucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-1,4- glycoside. Trong đó các mắt
xích của chitin cũng đƣợc đánh số giống nhƣ ở glucose[23]. Chitinrất phổ biếnvà có
thểđƣợctìm thấyở mộtloạt cácloàinhƣtrongvỏcủađộng vật giáp xác, tronglớp biểu
bìcủacôn trùngvà trongcácvách tế bàocủanấmvàmột sốtảo. Làmộtchất rắnvô định
hình, chitinmang tính chất đặc trƣng của các nhóm nàylàphần lớnkhông hòa

3


tantrongnƣớc, tan tốt trong axit loãngvàkiềm[34].
Mặc dùchitinđƣợcbiết đến với rất nhiềuứng dụng, nhƣng giá trị lớn nhất của
chitin lại là chitosan – một dẫn xuất của chitin nhờ quá trình deacetyl hóa [34].
1.1.2. Chitosan
Chitosan là một dạng chitin đã bị deacetyl hóa, nhờ enzyme chitin
deacetylase xúc tác cho việc loại gốc acetyl trong các đơn vị N-acetyl
glucosaminetrong phân tử chitin, chitooligosaccharit để tạo thành chitosan, oligo
chitosan và glucosamine[34]. Đây là những hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực: xử lí nƣớc thải, dƣợc học, y học, nông nghiệp và công nghiệp...[34].

Hình 2. Cấu trúc phân tử chitosan[23]
Chitosan có một số đặc tính nhƣ sau[34]:
- Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị
- Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác

nhau.
- Không tan trong nƣớc, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhƣng tan trong
axit loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng
chảy 309 – 3110C.
1.2.

SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGO CHITOSAN

1.2.1. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng hoá

4


học
+ Sản xuất chitin: Nguồn chitin thô (vỏ tôm, cua, mai mực…) đầu tiên đƣợc
khử khoáng bằng cách xử lý với axit HCl loãng (0,5N-1N) nhiệt độ phòng, thời gian
24h, rửa trung tính. Sau đó mẫu đƣợc xử lý với NaOH (0,5N-1N) để loại protein
trong nhiệt độ phòng, thời gian 24h, rửa trung tính, sấy thu đƣợc chitin. Tuỳ thuộc
vào loại mẫu mà quá trình xử lý cần lặp lại ở khâu axít hay bazơ để thu đƣợc mẫu
chitin tinh khiết. Sản phẩm chitin thu đƣợc dạng bột không màu và tỷ lệ Nacetylglucosamine chiếm 90-95%. Đây là nguyên liệu dùng cho sản xuất chitosan,
oligo chitosan [34].
+ Sản xuất chitosan: Chitin đƣợc deacetyl hóa bằng cách loại nhóm acetyl
bằng NaOH đặc (40-50%) thời gian 12h, nhiệt độ cao (trên 80oC). Sản phẩm
chitosan sẽ đƣợc kiểm tra bằng các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ: màu sắc, độ ẩm (%),
hàm lƣợng tro (%), hàm lƣợng protetin (%), độ nhớt (cps), độ deacetyl hóa (%), độ
tan (%), độ đục (NTU) [34].
+ Sản xuất oligo chitosan: Chitosan sau khi thu đƣợc lại đƣợc xử lý với axit
HCl để thu đƣợc sản phẩm là oligo chitosan (hay chitosan oligosaccharit) hoặc
glucosamine GLcN (dạng monome)[34].
Các quy trình sản xuất chitin đang sử dụng hiện nay là các quy trình hóa học

có sử dụng HCl và NaOH ở nồng độ cao, thời gian dài để khử khoáng và protetin
nên chất lƣợng chitin, chitosan không cao, đặc biệt là sản phẩm có độ nhớt thấp, độ
đục cao. Mặc dù một số nghiên cứu gần đây cho thấy chất lƣợng chitin, chitosan có
thể nâng lên khi kết hợp công đoạn tiền xử lý bằng một số axit hữu cơ nhƣ axit
acetic và axit benzoic [34]. Tuy nhiên các quy trình hóa học vẫn bộc lộ nhiều nhƣợc
điểm nhƣ sử dụng số lƣợng lớn hoá chất (axit, bazơ, chất tẩy rửa ôxy hoá) gây ô
nhiễm môi trƣờng, và không đảm bảo an toàn của sản phẩm cho ngƣời tiêu dùng
[34].

5


1.2.2. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng sinh
học
Để giải quyết những nhƣợc điểm trên, quy trình sản xuất chitin, chitosan
theo con đƣờng sinh học để sản xuất ra sản phẩm chitin, chitin oligosaccarit,
chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng đang đƣợc quan tâm.
Trong quá trình sản xuất chitin/chitosan theo con đƣờng sinh học, các loại
enzyme thƣờng đƣợc sử dụng để thay thế các loại axit và kiềm trong phƣơng pháp
hóa học. Legarreta và cộng sự đã sử dụng enzyme protease để tách protein khỏi vỏ
tôm thay thế phƣơng pháp hóa học [37]. Hall và Da Silva đã đề xuất phƣơng pháp
khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic [37]. Ngoài ra, chitin còn
đƣợc tách chiết từ vỏ tôm bằng cách sử dụng enzyme bromelain trong dịch ép vỏ
dứa [5]. Quy trình tách chiết chitin nhờ sử dụng bromelain đƣợc tiến hành theo sơ
đồ sau: 100g nguyên liệu đƣợc rửa bỏ để loại bớt thịt sau đó hòa cặn vào 300 ml
dịch chiết enzyme bromelain (dịch ép bã dứa), 1 ngày thay dịch enzyme 2 lần (sang
và chiều); xử lý nhƣ vậy trong thời gian 6-7 ngày, tiến hành rửa sạch thu cặn, xử lý
2 lần với NaOH 1% ở 900C trong 45 phút. Quy trình này hoàn toàn không cần sử
dụng HCl để loại khoáng và cần đến một lƣợng kiềm rất ít trong quá trình xử lý [5].
Vỏ tôm sau khi đƣợc khử khoáng và protein thu đƣợc chế phẩm chitin có hàm

lƣợng khoáng và protein rất thấp, màu sắc đẹp [5].
Chế phẩm này tiếp tục đƣợc phân đoạn thành các chitin oligosaccarit nhờ
enzym chitinase và đƣợc chuyển hóa thành chitosan nhờ enzym chitin deacetylase
[9].
1.3.

VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOSACCARIT

1.3.1. Đối với nông nghiệp
Theo các nhà khoa học, chitin là một chất rất hữu ích giúp thực vật phát
triển. Nó tham gia vào cơ chế bảo vệ trong thực vật. Sản lƣợng lƣơng thực tăng
lên đáng kể khi sử dụng chitin làm phân bón. Ở Mỹ, chitin cũng đƣợc sử dụng
trong nông nghiệp do cơ quan bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ quy định. Bên cạnh đó,

6


trong nông nghiệp và ngành sản xuất rau quả, chitosan đƣợc sử dụng nhƣ thuốc
trừ sâu sinh học [34].
Chitin oligosaccarit cũng đƣợc biết đến nhƣ một chất giúp mở nhanh cơ
chế kháng của thực vật chống lại sự xâm nhập của một số nấm, do đó, giúp tăng
cƣờng khả năng kháng bệnh của cây trồng. Trong một số cây cộng sinh nhƣ đậu
và cỏ ba lá, các vi khuẩn cộng sinh sống xung quanh rễ cây có thể giải phóng
chitin oligosaccarit tạo ra tín hiệu hình thành các nốt sần ở rễ, là vị trí cho sự cố
định nitơ [55].
Sử dụng màng từ chitin và chitosan tạo ra độ thoáng khí cho sản phẩm, duy
trì điều kiện tối ƣu trong bảo quản. Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có
độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói [51]. Trong
thực tế ngƣời ta đã dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả nhƣ
đào, dƣa chuột, đậu, bƣởi v.v...

1.3.2. Đối với môi trƣờng
Các hợp chất hóa học có mặt trong nƣớc xuất phát từ nhiều nguồn chất thải
độc hại chẳng hạn nhƣ các kim loại, thuốc nhuộm, các phân tử chất thơm…gây ô
nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [66].
Bằng cách sử dụng kết hợp một polymer tự nhiên nhƣ chitin và chitosan
vào hệ thống xử lý nƣớc ngƣời ta có thểtăng hiệu quả xử lý nƣớc; loại bỏ các hợp
chất hóa học tổng hợp độc hại chẳng hạn nhƣ sulfat nhôm và polymer tổng hợp
[66].
1.3.3. Ứng dụng trong y học
Nhờ đặc tính làm liền sẹo, oligo chitin đƣợc bổ sung vào thành phần trong
các loại băng (nhƣ da nhân tạo, băng giác mạc...), làm chỉ khâu phẫu thuật, cấy
ghép nha khoa, tái tạo lại xƣơng và nƣớu răng. Một kỹ thuật đặc biệt hiện nay
đang phát triển đó là sử dụng chitin thay thế cho da ngƣời hay da động vật (da
nhân tạo) và sản xuất chỉ khâu phẫu thuật có thể hấp thu sau ca mổ và kính sát
tròng [34].

7


Chitin là polymer của N-acetyl glucosamin, trong khi đó N-acetyl
glucosamin sau khi deacetyl hóa tạo glucosamin là một đƣờng hiếm cần cho công
nghiệp dƣợc và nghiên cứu hóa sinh. Nó làm tăng khả năng hấp thu kháng sinh
vào máu cũng nhƣ góp phần điều trị bệnh viêm khớp và các khối u. Ngoài ra,
glucosamin còn là vật liệu ban đầu để điều chế các chất trung gian D-arabrinose
và D-arabonic acid cần thiết để sản suất riboflavin và vitamine B6 [34].
1.3.4. Trong công nghiệp
Chitin và oligo chitin là một chất có giá trị lớn đối với các ngành công
nghiệp. Chitin tham gia vào nhiều quá trình xử lý trong công nghiệp, chẳng hạn
nhƣ đƣợc sử dụng làm một chất phụ gia và chất ổn định trong thực phẩm [25].
Bên cạnh đó, chitin đóng vai trò nhƣ một chất kết dính trong thuốc nhuộm, vải và

các chất kết dính khác. Từ chitin có thể sản xuất đƣợc màng tách công nghiệp và
nhựa trao đổi ion. Trong công nghiệp sản xuất giấy, chitin đƣợc sử dụng nhƣ một
chất giúp cải thiện kích thƣớc và độ dai của giấy [25].
Trong lĩnh vực phẫu thuật, chitin đƣợc sử dụng để sản xuất chỉ khâu vết
thƣơng, với đặc tính đẩy nhanh quá trình lành vết thƣơng ở ngƣời, mở ra một tiềm
năng mới về sản xuất sợi nhân tạo [34].
1.3.5. Trong thực phẩm
Tại châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản
xuất, bảo quản thực phẩm và trong phác đồ chế độ ăn kiêng [56]. Vì có đặc tính
bẫy lipit” nên chitin đƣợc coi là một chất đột phá có vai trò quan trọng trong ăn
kiêng. Với chitosan, khi uống vào đến ruột đƣợc dịch tiêu hoá hoà tan tạo thành
dạng gel, sẽ bẫy chất béo (chứa triglycerid và cholesterol) có trong thức ăn thức
uống không cho hấp thu vào ruột [56]. Theo nghiên cứu cho thấy rằng 20-30%
cholesterol có thể liên kết với chitosan, do đó, làm giảm hàm lƣợng cholesterol
trong máu [56].

8


1.4.

KHÁI QUÁT VỀ CHITINASE

1.4.1. Định nghĩa chitinase
Trong công nghệ sinh học, chitooligomer đƣợc tạo ra nhờ tác dụng của
chitinase[23]. Chitinase là một thành viên của họ enzyme glucoside hydrolyse, đặc
trƣng bởi khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết β-1,4 glycoside giữa C1
và C4 của hai monomer N-acetyl glucosamine trong mạch chitin[22]. Dƣới tác động
của các enzyme chitinase, chitin đƣợc chuyển hóa thành các dẫn xuất có trọng
lƣợng phân tử thấp hơn: chitooligosacharit, diacetylchitobiose và sản phẩm cuối

cùng là N-acetylglucosamine[7,22].
1.4.2. Những nguồn chính sản sinh chitinase
Chitinase đã đƣợc phát hiện trong nhiều loài sinh vật, chẳng hạn nhƣ vi
khuẩn, nấm, virut, thực vật và côn trùng, đóng một vai trò rất quan trọng trong quá
trình trao đổi chất của chúng[44].
1.4.2.1. Chitinase vi khuẩn
Enzyme

chitinase

đƣợc

tìm

thấy

ở

các

vi

khuẩn:

Chromobacterium,Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là
nhóm Streptomycetes.Hoạt tính exo và endo của chitinase đã đƣợc xác định ở
Streptomyces plicatus, Streptomyces erythraeus, có khối lƣợng phân tử là 30.000
Da, pI 3,7 và pH tối ƣu nhất cho hoạt động của enzyme là 5,0. Chitinase của
Streptomyces erythraeus gồm 290 axit amin, và có hai cầu disulfite ở Cys 45-Cys
49 và Cys 265-Cys 272[31].

Trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta thƣờng cho thêm chitincơ chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase đồng thời ổn
định hoạt tính enzyme sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase
nhằm phân giải chitin trong môi trƣờng tạo nguồn carbon cho vi khuẩn sinh
trƣởng[44].
1.4.2.2. Chitinase c a nấm

9


Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho
enzyme chitinase cao nhƣ: Trichoderma, Beauveria, Gliocladium, Calvatia…và đặc
biệt là ở các loài nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus…Các nấm phân hủy chitin
cũng đƣợc tìm thấy trong các thủy vực nhƣ loài Karlinggiomyces asterocystic thuộc
lớp Phycomycetes[44].
Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, enzyme chitinase cũng đóng vai trò quan trọng về
mặt dinh dƣỡng ở nấm, đặc biệt hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình
phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính
của vách tế bào nấm. Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm
nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật[44].
Các loại nấm mốc thuộc chi Beauveriasp. chẳng hạn nhƣ Beauveria
bassiana[19],Beauveria felina[49]; Beauveriabrongniartii [39] và các chi
Metarhiziumsp.; Trichodermahay Mucorsp.đều có khả năng sinh enzyme
chitinase[43]. Bên cạnh đó, chitinase cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều loài nấm khác
nhƣ: Penicillium, Lecanicillium,

Neurospora,

Lycoperdon,

Aspergillus,

Myrothecium, Conidiobolus, Stachybotrys và Agaricus[44].
1.4.2.3. Chitinase từ thực vật
Chitinase tham gia vào cơ chế của thực vật chống lại các loại côn trùng và
nấm ký sinh gây bệnh. Ngƣời ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ cây cần tây
có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằng chitinase
còn có vai trò khác nhƣ tham gia vào quá trình hình thành phôi. Các thực vật bậc
cao có khả năng tạo enzyme cao nhƣ: cao su (Hevea bralisiensis), thuốc lá
(Nicotiana sp.), lúa mạch (Horderum vulgare), cà rốt, hạt đậu nành và đặc biệt một
số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp chitinase[31].
1.4.2.4. Chitinase từ ộng vật
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu
hóa của nhiều loại động vật không xƣơng: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân
đốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa) ta có thể thu nhận đƣợc enzyme

10


chitinase. Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và
dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của
những loài chim, thú dữ ăn sâu bọ[31].
Ngoài ra, enzyme chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn
trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời
điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng phân hủy lớp màng ngoài (cuticun)
trong quá trình biến thái hay lột xác[31].
1.4.3. Phân loại chitinase
1.4.3.1. Dựa vào cấu trúc phân tử[44]
Chitinase đƣợc sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thuỷ phân đƣờng):
- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu
trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, đƣợc tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật nhƣ

vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, và virus. Trong họ này, chitinase từ các sinh vật
nhân sơ chỉ có hai motif trình tự ngắn đƣợc bảo tồn cao giống với enzyme của các
sinh vật nhân chuẩn. Tuy nhiên, cả 2 loại chitinase đều có cùng domain xúc tác
barrel (βα)8. Khác với các glucohydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng
bất thƣờng bao gồm việc tác động lên nhóm N- acetyl của cơ chất trên nguyên tử C
anomer.
- Họ glycohydrolase 19: thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua, cải,
đậu Hà Lan, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces gricues, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme của
động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế nghịch
chuyển.
1.4.3.2. Dựa vào trình tự amino acid[44]
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng nhiệt,
peptid nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành 5
nhóm:
- Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu

11


cysteine chứa khoảng 40acid amin nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu
glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptid nhậnbiết).
- Nhóm II.: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác
có trình tự amino acidtƣơng tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N
và peptid nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm IIcó ở thực vật, nấm và vi khuẩn.
Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhómII
thuộc loại protein kháng bệnh và đƣợc tế bào tiết ra dƣới nhiều điều kiện stress khác
nhau.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II,
nhƣng rất giống về trìnhtự với lysozyme ởHevea brasiliensis, vì thế chúng mang

hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhómIII là các protein kháng bệnh và
đƣợc tiết ra ngoại bào.
- Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm,
41-47% trình tự amino acidở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I
và khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tửcũng có đoạn giàu cysteine
nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàucysteine) có thểgiảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hoá ở thực
vật bậc cao.
1.4.3.3. Dựa vào phản ứng phân cắt[44]
Enzyme phân giải chitin đƣợc phân thành hai nhóm chính: endochitinase và
exochitinase (chitin-1,4-β-chitobiosidase và N-acetyl-β-D-glucosaminidase).
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo
các đoạn oligosaccharide, đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm
mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1= 36 kDa, pI1= 5,3±0,2 và
M2= 40 kDa, pI2= 3,9), Gliocladium virens (M= 41kDa, pI= 7,8).
Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin từ đầu không khử tạo

12


thành các sản phẩm chính là các diacetylchitobiose và không tạo ra
monosaccharide, cụ thể enzyme này đƣợc thu từTrichoderma harzianum (M=
36kDa, pI= 4,4±0,2).
β-N-acetylhexosaminidaselà enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho
sảnphẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamin.
Ngoài ra, đối với chitosan – dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase
(EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tƣơng ứng.
1.4.4. Cơ chế tác ộng c a các loại enzyme chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và

chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lƣợng phân
tử khác nhau: chitotetraose, chitotriose; diacetylchitobiose nhƣng chiếm đa số là các
diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm
đƣợc nữa. Hầu hết chitinase thuộc loại này[31,44].
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp
lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3 từ đầu không khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc)2[31].
β-N-acetyl hexosaminidase(bao gồm N-acetyl-β-D-glucosaminidase và
Chitobiase) phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không
khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetylglucosamin[31].
Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, ngƣời ta sử dụng N-acetyl
chitooligosaccarit làm cơ chất. Các oligosaccarit thƣờng đƣợc thủy phân bên trong
trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enzyme chitinase có
khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không. Cũng có 2 dạng chitinase
thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharide và
trisaccharide,

một

phân

cắt

bên

ngoài

tetrasaccharide[31,44].

13

tạo

các

monosaccharide

và


Hình 3. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma[57]
1.4.5. Các ặc tính cơ bản c a enzyme chitinase
1.4.5.1.

Trọng lƣợng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lƣợng
phân tử khoảng 25-40 kDa[54]. Một số chitinase có trọng lƣợng phân tử khoảng 4090 kDa[22]. Enzyme chitinase của các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xƣơng
(cá, lƣỡng cƣ, thú) có trọng lƣợng phân tử cao hơn, khoảng 120 kDa[22]. Trọng
lƣợng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến
đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa[11,22]. Một số enzyme chitinase có trọng lƣợng phân
tử thấp có thể đƣợc tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cách một phần
protein[11].
1.4.5.2.

Tính bền c a enzyme

Để có thể sử dụng hiệu quả trong công nghiệp enzyme cần phải có độ bền
cao. Độ bền chính là một tham số có lợi cho việc xúc tác sinh học (chẳng hạn

14