Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP
LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM
VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT
DI TRUYỀN NGƯỢC

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Luận án “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống
cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” là công trình nghiên cứu của tôi và
một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung
thực, một phần đã đƣợc tác giả công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với
sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;
Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hằng

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn
Trung Nam và PGS.TS. Chu Hoàng Hà - những ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn,
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, các cán bộ Phòng Quản lý tổng

hợp, bộ phận Quản lý đào tạo Sau đại học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi.
Với lòng tri ân và biết ơn, tôi xin cảm ơn Dr. Robert G. Webster, Dr.
Richard J. Webby (St. Jude Children's Research Hospital) đã cung cấp bộ plasmid
pHW2000. Luận án đƣợc thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên
cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” 2016 - 2018 (Mã số
SPQG.05b.03).
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của
ThS. Lê Hùng Chí, TS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ của Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật và PTN trọng điểm Công
nghệ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện CNSH Lâm
nghiệp, các đồng nghiệp đang công tác tại Trƣờng Đại học Lâm nghiệp vì đã tạo
điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia
đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó
khăn của những ngƣời thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực
cao trong quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thu Hằng

ii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... xi
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ..................................................................... xiii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5
1.1.

Tổng quan về virus cúm A/H5N ................................................................. 5

1.1.1.

Vị trí phân loại ............................................................................................... 5

1.1.2.

Danh pháp ...................................................................................................... 6

1.1.3.

Hình thái và cấu trúc ...................................................................................... 6

1.1.4.

Chu trình nhân lên ........................................................................................ 13

1.1.5.

Tiến hóa của virus ........................................................................................ 15

1.1.6.

Độc lực của virus ......................................................................................... 18

1.2.

Tình hình dịch bệnh và di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 .... 19

1.2.1.

Tình hình dịch cúm A/H5N1 độc lực cao .................................................... 19

1.2.2.

Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ................................................ 20

1.3.

Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 .......................................................... 23

1.3.1.

Phân loại vaccine cúm A/H5N1 ................................................................... 23

1.3.2.

Nguyên tắc phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ............ 25

1.3.3.

Thành tựu trong nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 ....................... 26

iii


1.4.

Áp dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong nghiên cứu tạo chủng
virus ứng viên vaccine cúm A .................................................................. 30

1.4.1.

Nguyên lý của kỹ thuật ................................................................................ 30

1.4.2.

Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 31

1.4.3.

Các bƣớc của quá trình phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A
bằng di truyền ngƣợc ................................................................................... 34

1.4.4.

Ƣu điểm của việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong phát triển
chủng virus vacine cúm A ............................................................................ 35

1.5.

Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A ..................................................... 36

1.5.1.

Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm vô hoạt............................................... 37

1.5.2.

Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm sống giảm độc lực ............................. 38

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 39
2.1.

Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 39

2.1.1.

Chủng virus, vi sinh vật, plasmid, tế bào và một số vật liệu khác ............... 39

2.1.2.

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu........................................................ 40

2.1.3.

Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 42

2.1.4.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 43

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 44

2.2.1.

Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 ............. 44

2.2.2.

Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade
1.1 và 2.3.2.1c… .......................................................................................... 47

2.2.3.

Khuếch đại và chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen đích..... 49

2.2.4.

Ghép nối các phân đoạn gen virus cúm vào plasmid pHW2000 tạo hệ
thống plasmid đơn gen ................................................................................. 51

2.2.5.

Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào 293T và MDCK .............................................. 52
iv


2.2.6.

Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ........................... 54

2.2.7.

Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
trong trứng gà sạch có phôi .......................................................................... 56

2.2.8.

Phân lập và bảo quản chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c ................................................................................................ 59

2.2.9.

Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác
định tính ổn định di truyền của virus ........................................................... 60

2.2.10. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c .................................................................................. 61
2.2.11. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên
gà của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.................... 62
2.3.

Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 63

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 64
3.1.

Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào
plasmid pHW2000........................................................................................ 64

3.1.1.

Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn
gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 .................................................... 64

3.1.2.

Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung ..... 64

3.1.3.

Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 ....................... 72

3.2.

Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 ....................................................... 79

3.2.1.

Thiết kế gen kháng nguyên HA ................................................................... 79

3.2.2.

Khuếch đại gen HA ...................................................................................... 82

3.2.3.

Tạo dòng plasmid pHW2000 mang gen HA …........................................... 83
v


3.3.

Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 … .................................................. 84

3.3.1.

Thiết kế gen kháng nguyên NA ................................................................... 84

3.3.2.

Khuếch đại gen NA ...................................................................................... 87

3.3.3. Dòng hóa gen NA vào plasmid pHW2000 .................................................... 88
3.4.

Tạo chủng virus tái tổ hợp bằng di truyền ngƣợc ............................. 89

3.4.1.

Tách chiết DNA plasmid và nuôi cấy tế bào 293T ...................................... 89

3.4.2.

Tối ƣu điều kiện chuyển nhiễm cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T........................................... 92

3.4.3.

Kết quả tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1clade
2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc ...................................................................... 95

3.5.

Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi ........................................ 98

3.6.

Phân lập và kiểm tra tính ổn định di truyền của chủng
virus…………. .......................................................................................... 104

3.7.

Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí
nghiệm và xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch
của vaccine ................................................................................................ 108

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ................................................................ 114
4.1.

Ƣu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong di truyền ngƣợc

tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A ............................................... 114

4.2.

Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus
A/PR/8/34 trong việc nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng
virus ứng viên vaccine cúm A ................................................................. 117

4.3.

Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không
chứa các amino acid kiềm độc ................................................................ 120
vi


4.4.

Ảnh hƣởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm A tái
tổ hợp ......................................................................................................... 123

4.5.

Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi và tính ổn
định di truyền gen kháng nguyên của virus .......................................... 125

4.6.

Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1
clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm .................................. 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 128
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI .......................................................................................................... 129
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 130
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 135
PHỤ LỤC

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết

Chữ viết đầy đủ (tiếng Anh)

Nghĩa tiếng Việt

ATCC

American Type Culture Collection

Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ

CPE

Cytopathic Effect

cRNA

Complementary Ribonucleic Acid

Axit ribonucleic bổ sung

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Deoxyribonucleic Acid

EID50

50% Eggs Infectious Dose

FAO

Food and Agriculture Organization

FBS

Fetal Bovine Serum

FDA

Food and Drug Administration

Gal

Galactose

Galactose

GMT

Geometric Mean Titer

Giá trị HI trung bình hình học

HA

Hemagglutinin

Hemagglutinin

HAU

Hemagglutinin unit

Đơn vị Hemagglutinin

HI

Hemagglutination Inhibition

Ức chế ngƣng kết hồng cầu

HPAI

High Pathogenic Avian Influenza

Virus cúm độc lực cao

IIV

Inactivated Influenza Vaccine

Vaccine cúm bất hoạt

tắt

Hiệu ứng cytopathic (hiệu ứng
hủy hoại tế bào)

Liều lƣợng virus lây nhiễm 50%
trứng
Tổ chức Nông lƣơng Liên Hiệp
Quốc
Huyết thanh bào thai bê
Cơ quan Quản lý Thực phẩm
và Thuốc Hoa Kỳ

viii


LAIV

Live Attenuated Influenza Vaccine

Vaccine cúm sống nhƣợc độc

LPAI

Low Pathogenic Avian Influenza

Virus cúm độc lực thấp

M

Matrix/Marker

Protein M/Marker

MDCK

Madin-Darby Canine Kidney

Tế bào thận chó thƣờng trực

ml

Milliliter

Milliliter

mRNA

Messenger Ribonucleic Acid

RNA thông tin

NA

Neuraminidase

Neuraminidase

NCR

Non Coding Region

Vùng không mã hóa

NEP

Nuclear Export Protein

Protein ngoài nhân

NK

Natural Killer

Tế bào miễn dịch NK

nm

Nanometer

Nanometer

NP

Nucleoprotein

Protein NP

NS

Non-Structural protein

Protein không cấu trúc

PA

Polymerase Acidic

Protein PA

PB1

Polymerase Basic 1

Protein PB1

PB2

Polymerase Basic 2

Protein PB2

PBS

Phosphate Buffered Saline

Đệm PBS

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuếch đại gen

PFU

Plaque Forming Units

Đơn vị tạo thành plaque

PolI

RNA polymerase I

Enzyme RNA polymerase I

ix


PolII

RNA polymerase II

Enzyme RNA polymerase II

PR

Puerto Rico

Puerto Rico

RdRp

RNA dependent RNA polymerase

Enzyme RdRp

RG

Reverse Genetics

Di truyền ngƣợc

RT-PCR

Reverse Transcriptase PCR

PCR phiên mã ngƣợc

RNA

Ribonucleic Acid

Ribonucleic Acid

RNP

Ribonucleoprotein

Ribonucleoprotein

SA

Sialic Acid

Sialic Acid

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPF

Specific Pathogen Free

Không nhiễm mầm bệnh

ssRNA

Single stranded RNA

RNA sợi đơn

Th

T helper

Tế bào T hỗ trợ

vRNA

Viral Ribonucleic Acid

RNA của virus

vRNP

Viral Ribonucleoprotein

RNP của virus

WHO

World Health Organisation

Tổ chức Y tế Thế giới

x

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.

Các phân đoạn vRNA mã hóa 11 protein của virus cúm A .................. 8

Bảng 1.2.

Thụ thể liên kết đặc hiệu với HA ở các vật chủ của virus cúm A ....... 13

Bảng 1.3.

Các clade cúm A/H5N1 lƣu hành ở Việt Nam .................................... 22

Bảng 1.4.

Thành tựu nghiên cứu và danh sách các chủng virus ứng viên sản
xuất vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc theo WHO ............ 27

Bảng 2.1.

Các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản và xác định trình tự
nucleotide của các phân đoạn gen virus cúm A .................................. 41

Bảng 2.2.

Các cặp mồi sử dụng cho xác định trình tự gen ................................. 41

Bảng 2.3.

Các hóa chất, enzyme và kit sử dụng trong nghiên cứu ..................... 42

Bảng 2.4.

Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy tế bào ...................................... 43

Bảng 2.5.

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại
cDNA của sáu phân đoạn gen khung ................................................. 46

Bảng 2.6.

Thành phần phản ứng RT-PCR một bƣớc........................................... 56

Bảng 2.7.

Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR một bƣớc ............................... 56

Bảng 3.1.

So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen
khung đã phân lập với các gen tƣơng ứng của chủng PR8 ................ 71

Bảng 3.2.

Ảnh hƣởng của loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ......................... 92

Bảng 3.3.

Ảnh hƣởng của thời gian chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .................. 93

Bảng 3.4.

Ảnh hƣởng của hàm lƣợng plasmid chuyển nhiễm đến hiệu quả
tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .............. 94

Bảng 3.5.

Kiểm tra sự có mặt và đặc điểm di truyền gen HA của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 ............... 96
xi


Bảng 3.6.

Kết quả xác định hiệu giá HA và hiệu giá virus của các mẫu virus
rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 ........... 100

Bảng 3.7.

Kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, tế bào MDCK
và tính ổn định di truyền của các chủng virus ................................... 105

Bảng 3.8.

Kiểm tra một số chỉ tiêu của kháng nguyên virus trong vaccine,
tính vô hoạt và vô trùng của chế phẩm vaccine ................................ 109

Bảng 3.9.

Ảnh hƣởng của chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c đến sức sống và khả năng kích thích sinh
kháng thể đặc hiệu của gà 3 ngày tuổi .............................................. 110

xii


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.

Phân loại virus cúm A dựa sự khác biệt về trình tự amino acid
của protein HA ...................................................................................... 5

Hình 1.2.

Hình thái và cấu trúc của virus cúm A .................................................. 7

Hình 1.3.

Cấu trúc và chức năng của phức hệ vRNP .......................................... 12

Hình 1.4.

Chu trình tái bản của virus cúm A....................................................... 14

Hình 1.5.

Vật chủ tự nhiên của các subtype virus cúm A ................................... 17

Hình 1.6.

Sự khác biệt về trình tự amino acid ở vị trí cắt của protease nội
bào giữa các chủng virus LPAI và HPAI ............................................ 19

Hình 1.7.

Hệ thống 8 plasmid PolI-PolII cho tái tạo virus cúm A bằng kỹ
thuật di truyền ngƣợc .......................................................................... 33

Hình 2.1.

Sơ đồ plasmid pHW2000 .................................................................... 40

Hình 2.2.

Sơ đồ thí nghiệm tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1
bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc ............................................................. 45

Hình 2.3.

Sơ đồ cấu trúc gen HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1
và clade 2.3.2.1c .................................................................................. 47

Hình 2.4.

Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c trƣớc và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc ........... 48

Hình 3.1.

Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng
dụng kỹ thuật RT-PCR hai bƣớc với mồi Uni12 ................................ 65

Hình 3.2.

Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân bản 6 phân đoạn gen
mã hóa các protein khung của virus NIBRG-14 ................................. 66

Hình 3.3.

Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR chọn dòng khuẩn lạc
mang sáu phân đoạn gen khung, sử dụng cặp mồi đặc hiệu của
từng phân đoạn gen và cặp mồi bắt cặp trên plasmid ........................ 69
xiii


Hình 3.4.

Dòng hóa các phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus PR8 vào
plasmid pHW2000............................................................................... 72

Hình 3.5.

Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen
khung bằng enzyme giới hạn............................................................... 73

Hình 3.6.

Chọn dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pHW2000 tái tổ hợp
bằng phƣơng pháp conoly-PCR .......................................................... 75

Hình 3.7.

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung
với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 ................. 77

Hình 3.8.

Điện di kiểm tra sản phẩm cắt sáu plasmid pHW2000 tái tổ hợp
mang sáu phân đoạn gen khung bằng cặp enzyme NheI và SmaI....... 78

Hình 3.9.

Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c không chứa vùng độc............................................................. 80

Hình 3.10.

Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E. coli DH5α
dƣơng tính với gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c ..................... 82

Hình 3.11.

Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c trong
plasmid pHW2000............................................................................... 83

Hình 3.12.

Trình tự nucleotide và amino acid của gen NA clade 1.1 và clade
2.3.2.1c ................................................................................................ 86

Hình 3.13.

Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E.coli DH5α
dƣơng tính với gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c ..................... 87

Hình 3.14.

Kiểm tra kết quả tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000 ............. 88

Hình 3.15.

Sơ đồ tái tạo chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc theo nguyên
tắc 6 + 2 plasmid ................................................................................. 90

Hình 3.16.

Kiểm tra chất lƣợng DNA plasmid và tế bào 293T ............................ 91

xiv


Hình 3.17.

Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân gen HA của
các mẫu virus tái tổ hợp thế hệ P0 thu nhận sau thí nghiệm

chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T .................................... 97

Hình 3.18.

Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 không chứa vùng độc ................ 98

Hình 3.19

Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h nhân giống
trong trứng gà sạch có phôi ............................................................... 102

Hình 3.20.

Kết quả xác định hiệu giá virus gián tiếp thông qua số lƣợng
plaque tạo thành khi nuôi cấy virus trên tế bào MDCK .................... 103

Hình 3.21.

Hiệu giá HA của các chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P5 ......................................................... 106

Hình 3.22.

Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân bản 8 phân
đoạn vRNA của virus rg-A/H5N1 ..................................................... 107

Hình 3.23.

Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rgA/H5N1 vào tế bào MDCK ............................................................... 108

Hình 3.24.

Hiệu giá HI trong huyết thanh sau 2 và 4 tuần tiêm phòng
vaccine chứa kháng nguyên virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c của các lô gà thí nghiệm .............................. 111

Hình 4.1.

Các hệ thống plasmid sử dụng trong di truyền ngƣợc tái tạo
chủng virus ứng viên vaccine cúm A ................................................ 115

xv


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở ngƣời và gia cầm, do
virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A
đƣợc phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên protein kháng nguyên
Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11
subtype NA (N1 - N11). Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao
(HPAI H5N1) thƣờng gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang ngƣời nên
luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng.
Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả nhất là tiêm
phòng vaccine. Trong quá trình sản xuất vaccine phòng chống virus A/H5N1 (thuộc
nhóm virus có hệ gen dễ biến đổi do đột biến và tái tổ hợp gen), yếu tố chủng virus
gốc bảo đảm tính an toàn và có khả năng bảo hộ cao với chủng lƣu hành là rất cần
thiết. Để tái tạo đƣợc chủng virus đáp ứng tiêu chí của chủng ứng viên vaccine cúm

A, kỹ thuật di truyền ngƣợc (reverse genetics) thƣờng đƣợc các nhà khoa học trên
thế giới ứng dụng với ƣu điểm: Cho phép thao tác với genome virus, tạo một hoặc
một số biến đổi trong gen để loại bỏ các yếu tố tạo nên độc lực của chủng virus,
giúp tạo chủng virus tái tổ hợp an toàn (có độc lực thấp) và mang các đặc tính mong
muốn trong thời gian ngắn.
Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm
2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử
dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngƣợc có nguồn gốc từ nƣớc
ngoài. Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine
cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn, đặc biệt khi
các chủng cúm lƣu hành trong nƣớc có thể mang tính kháng nguyên chuyên biệt, hệ
gen luôn biến đổi dẫn đến vaccine tạo ra trƣớc đó có thể không đạt hiệu quả bảo hộ
cao với biến chủng virus mới xuất hiện. Do vậy, để chủ động đối phó với những
diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần


2

xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc (Reverse Genetics
- RG) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những
chủng virus đang lƣu hành.
Hƣớng dẫn của WHO cho phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm
A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc là tạo chủng virus tái tổ hợp có sự sắp xếp nguồn gen
theo công thức 6 + 2 gồm: 6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ chủng A/Puerto
Rico/8/1934 H1N1 (PR8); 2 phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên H5 và N1 của
chủng virus hoang dại đang lƣu hành (chủng dự tuyển vaccine).
Hiện nay, ở Việt Nam, trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang
lƣu hành, clade 1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tƣơng đồng kháng nguyên và đặc tính
di truyền với nhiều clade khác nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine
phòng chống cúm A/H5N1. Do vậy, việc nghiên cứu tạo chủng virus A/H5N1 clade

1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1 đáp ứng yêu cầu làm chủng ứng viên cho sản xuất
vaccine phòng chống bệnh cúm HPAI H5N1 ở gia cầm là cần thiết. Đặc biệt, việc
nghiên cứu để ứng dụng thành công và làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc trong
chủ động tạo ra chủng virus vaccine là rất có ý nghĩa. Xuất phát từ cơ sở khoa học
và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm
vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo đƣợc chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine
phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1
clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa
các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen
vào plasmid pHW2000.
2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã đƣợc loại bỏ các amino acid kiềm ở
vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng
A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT-


3

02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000.
3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn
gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1
và clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng
thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính
ổn định di truyền.
5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu

của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Kế t quả đa ̣t đƣơ ̣c của luâ ̣n án có ý nghĩa về lý luận và thƣ̣c tiễn vì đã làm chủ
đƣợc công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên cho
sản xuất vaccine đáp ứng nhanh, đặc hiệu với chủng virus đang lƣu hành.
4.1. Ý nghĩa lý luận
Kế t quả nghiên cƣ́u của luận án cung cấp cơ sở khoa học cho nghiên cứu và
ứng dụng công nghệ di truyền ngƣợc để lắp ráp nhân tạo chủng giống gốc cho sản
xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
1. Tạo đƣ ợc bộ plasmid đơn gen mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các
protein khung của virus cúm A/PR/8/34 (H1N1) - nguồn cung cấp gen khung đƣợc
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo nên sử dụng trong nghiên cứu tái tạo
chủng cúm tái tổ hợp ứng viên cho sản xuất vaccine cúm vô hoạt. Bộ plasmid mang
các gen phân đoạn gen khung là nguồn vật liệu đƣợc chuẩn bị sẵn sàng cho sự kết
hợp với các plasmid mang 2 phân đoạn gen kháng nguyên - HA và NA - của các
chủng cúm A đang lƣu hành hay trong tƣơng lai sẽ xuất hiện để kịp thời lắp ráp
nhân tạo chủng virus cúm tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine.


4

2. Thiết kế đƣợc sơ đồ cấu trúc gen kháng nguyên HA và NA thích hợp làm
ứng viên gen kháng nguyên cho tạo chủng virus vaccine. Trên cơ sở các cấu trúc
gen đã thiết kế, trong tƣơng lai khi có các chủng cúm HPAI HxNy mới xuất hiện,
dựa trên trình tự nucleotide đã đƣợc xác định của các gen kháng nguyên của virus
mới, có thể nhanh chóng sinh tổng hợp nhân tạo các gen HA và NA làm ứng viên
gen kháng nguyên cho lặp ráp chủng virus ứng viên vaccine phòng chống virus
HPAI HxNy bằng công nghệ di truyền ngƣợc.

3. Tái tạo và chọn lọc đƣợc hai chủng virus vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-clade 2.3.2.1c phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus HPAI H5N1 clade 1.1 và
clade 2.3.2.1c gây nên. Hai chủng virus tái tổ hợp có khả năng thích ứng nhân giống
trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024), có tính ổn định di truyền về
gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (HI
≥ 4 log2) ở gà sạch 3 ngày tuổi.
5. Đóng góp mới của luận án
1. Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công
nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A.
2. Đã tối ƣu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống
6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ
hợp: Công thức chuyển nhiễm thích hợp là sử dụng hóa chất chuyển nhiễm
Lipofectamine-2000 trong thời gian 30 phút, nồng độ plasmid thích hợp cho chuyển
nhiễm là 1,0 µg/ 1 plasmid.
3. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c) có bộ genome gồm 6 phân đoạn gen của virus A/PR/8/34
và 2 phân đoạn gen kháng nguyên HA (đã đƣợc loại bỏ vùng độc, tránh lại độc) và
NA của virus HPAI H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c. Các chủng virus ứng viên có
khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở
thế hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp
ứng miễn dịch tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên
virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng).


5

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÖM A/H5N1
1.1.1. Vị trí phân loại
Virus cúm A/H5N1 là một subtype (phân type) của chi Influenza A (virus

cúm A), thuộc họ Orthomyxoviridae. Họ Orthomyxoviridae gồm 5 chi:
Influenzavirus A (virus cúm A), Influenzavirus B (virus cúm B), Influenzavirus C
(virus cúm C), Isavirus và Thogotovirus. Trong số các chi thuộc họ
Orthomyxoviridae, virus cúm A là nguy hiểm nhất với mức độ lây lan nhanh, có thể
gây bệnh nặng và bùng phát thành dịch ở ngƣời và động vật.
Dựa trên sự khác biệt về trình tự amino acid (ít nhất 30%) của hai loại
protein kháng nguyên vỏ HA và NA, virus cúm A đƣợc phân thành các subtype với
18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype NA (N1 - N11) (Chen et al., 2012). Các
subtype HA đƣợc phân thành hai nhóm dựa vào đặc điểm cấu trúc và đặc tính
kháng nguyên của glycoprotein HA: Nhóm 1 gồm 12 subtype là H1, H2, H5, H6,
H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 và H18; nhóm 2 có 6 subtype H3, H4, H7, H10,
H14 và H15 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Phân loại virus cúm A dựa vào sự khác biệt về trình tự
amino acid của protein HA
(Nguồn: />

6

Căn cứ vào khả năng gây bệnh, virus cúm A đƣợc phân thành 2 nhóm là
nhóm có độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI) và nhóm có độc
lực thấp (Lowpathogenic avian influenza - LPAI). Nhóm LPAI thƣờng chỉ gây bệnh
nhẹ ở đƣờng hô hấp, làm giảm sức đẻ và/hoặc làm giảm trọng lƣợng ở gia cầm,
nhóm HPAI có khả năng lây lan nhanh, gây chết gia cầm với tỷ lệ cao (ít nhất 75%
gia cầm nhiễm bị chết). Theo thống kê của Pantin-Jackwood và đtg (2016), hầu hết
các chủng HPAI đã xuất hiện đều thuộc subtype H5 hoặc H7.
H5N1 là subtype có nhiều chủng thuộc nhóm HPAI với khả năng lây nhiễm
nhanh trên nhiều loại gia cầm, động vật có vú và ngƣời, có khả năng đột biến cao và
tái tổ hợp di truyền lớn, có nguy cơ bùng phát dịch rất cao. Do vật chủ của virus
cúm A/H5N1 chủ yếu là gia cầm nên virus còn đƣợc biết đến với tên virus cúm gia

cầm (avian influenza) hay cúm chim (bird flu).
1.1.2. Danh pháp
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp virus cúm
theo thứ tự kí hiệu:
Tên type/vật chủ/vùng địa lí phân lập/số hiệu đăng kí chủng/năm phân
lập(phân type HA(H) và NA(N)).
Ví dụ:

A/Turkey/Ontario/6613/1966(H5N1)
A/Chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1)

Ngoài ra, nếu con ngƣời đóng vai trò vật chủ thì không ghi tên vật chủ trong
danh pháp của virus, ví dụ: A/Puerto Rico/8/34(H1N1).
1.1.3. Hình thái và cấu trúc
Hạt virus có hình cầu hoặc hình oval, đƣờng kính 80 - 120 nm, khối lƣợng
phân tử khoảng 250 triệu Dalton (Zhu et al., 2008) (Hình 1.2A).
Cấu trúc virus gồm 3 thành phần: Genome có bản chất nucleic acid (RNA)
nằm trong cùng (lõi), vỏ capsid đƣợc hợp thành từ protein bao quanh genome, ngoài
cùng là vỏ envelope (nguồn gốc từ màng lipid kép của tế bào chủ) bao bọc xung
quanh khối nucleocapsid (nucleic acid + vỏ capsid) (Hình 1.2B).
Genome thực hiện chức năng mang thông tin di truyền của virus, vỏ capsid


7

thực hiện chức năng bao bọc, bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, màng lipid
kép gắn xen các protein đặc hiệu đƣợc mã hóa bởi genome virus và giúp virus lây
nhiễm vào tế bào chủ.

A

B

C

Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm A
(Nguồn: Nogales et al., 2016;
/>A. Hình thái virus cúm A khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
B. Cấu trúc và sự phân bố của các protein trong hạt virus
C. Cấu trúc 8 phân đoạn genome mã hóa các protein của virus
Segment: Phân đoạn gen

1.1.3.1. Genome của virus
Genome của virus cúm A nói chung và của virus cúm A/H5N1 nói riêng
gồm 8 phân đoạn RNA sợi đơn, âm [(-) ssRNA], kích thƣớc hơn 13000 nucleotide,
mã hóa 11 protein (Hình 1.2C). Tám phân đoạn gen đƣợc ký hiệu theo tên của
protein do gen mã hóa - PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS - và mỗi phân đoạn
mã hóa 1 hoặc 2 protein với thông tin về số lƣợng amino acid và chức năng của các
protein đƣợc tóm lƣợc trong Bảng 1.1 (Gomez-Purtas et al., 2000; Bouvier &
Palese, 2008; Shimizu et al., 2011, Paterson & Fodor, 2012).
Tám phân đoạn RNA virus (vRNA) đều chứa 2 vùng không mã hóa (noncoding region) với 1 vùng 13 nucleotide ở đầu 5’ và 1 vùng 12 nucleotide ở đầu 3’.
Bên cạnh đó, tám phân đoạn vRNA định vị bên trong hạt virus trong mối liên kết
chặt chẽ với nucleoprotein (NP) (Hình 1.3). Sự kết hợp của vRNA với 4 loại protein
- NP, PB2, PB1, PA - sẽ tạo phức hợp vRNP (Eisfeld et al., 2015). Trong phức
vRNP, các phân đoạn vRNA đƣợc dùng làm khuôn cho phiên mã thành mRNA (có


8

mũ ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’), sinh tổng hợp các bản sao cRNA là các RNA

sợi dƣơng ((+) strand RNA) có trình tự bổ sung, chiều dài đủ, không có mũ và đuôi
polyA để làm khuôn cho tổng hợp vRNA (Jagger et al., 2012, Lee et al., 2012).
Bảng 1.1. Các phân đoạn vRNA mã hóa 11 protein của virus cúm A
Phân
đoạn

Ký
hiệu
gen

Chiều
dài gen
(nt)

Mã hóa
protein

Chiều
dài
protein
(aa)

1

PB2

2341

PB2

759

PB1

757

PB1-F2

87

2

PB1

2341

3

PA

2233

PA

716

4

HA

1778

HA

550

5

NP

1565

NP

498

6

NA

1413

NA

454

M1

252

M2

97

NS1

230

NEP/NS2

121

7

M
1027

8

NS

890

Chức năng của protein
Là tiểu đơn vị của polymerase, nhận
biết mũ ở đầu 5’ của mRNA
Là tiểu đơn vị của polymerase, có hoạt
tính endonuclease
Thay thế khung đọc mở gần đầu 5' của
gen PB1

Là tiểu đơn vị của polymerase, có hoạt
tính protease
Kháng nguyên bề mặt, liên kết với thụ
thể của tế bào chủ, dung hợp màng
Protein liên kết với vRNA, đƣa vRNA
vào nhân tế bào
Kháng nguyên bề mặt, có hoạt tính
sialidase, giải phóng hạt virus khỏi tế
bào chủ
Là protein nền, tƣơng tác với vRNP,
đƣa vRNA vào nhân, giúp virus nảy
chồi khỏi bề mặt tế bào chủ
Là kênh ion, tham gia giai đoạn giải
phóng vRNP khỏi vỏ capsid và giai
đoạn lắp ráp
Kháng interferon
Đƣa phức hợp vRNP từ nhân ra tế bào
chất

Trong số 8 phân đoạn vRNA, 2 phân đoạn HA và NA mã hóa 2 protein
kháng nguyên bề mặt, và 6 phân đoạn mã hóa các protein còn lại tạo bộ khung
virus. Trong quá trình sản xuất vaccine cúm A, chủng virus vaccine phải chứa 2
phân đoạn gen kháng nguyên (HA, NA) đƣợc làm mới hàng năm để có tính kháng
nguyên đại diện cho các chủng đang lƣu hành, còn 6 phân đoạn gen khung có nguồn