Một phương pháp xác định hàm lượng vết Protein trong vật liệu Chitin/Chitosan

MỘT PHƯƠNG PHÁP XÁC ÐỊNH HÀM LƯỢNG VẾT
PROTEIN TRONG VẬT LIỆU CHITIN/CHITOSAN
Nguyễn Thị Ngọc Tú
Viện Hoá học
Trung tâm Khoa học Tự nhiên và CNQG
I - ĐẶT VẤN ĐỀ
Chitin/chitosan là polysacarit có nhiều ứng dụng trong y học, dùng làm vật liệu y sinh bởi
độc tính thẩp, hoà hợp sinh học và tự phân huỷ sinh học [1], [2], có khả năng kháng
khuẩn, kháng nấm và tăng sinh tế bào [3] ... Chitin/chitosan được sản xuất từ vỏ các loài
thủy hải sản (vỏ tôm, vỏ cua, mai mực, mai sam...). Trong qúa trình sản xuất
chitin/chitosan cần phải loại bỏ protein, các muối vô cơ, chất mầu và các tạp chất khác.
Ðộ tinh khiết của chitin/chitosan phụ thuộc nhiều vào hàm lượng protein còn sót và các
nguyên tố vi lượng trong sản phẩm [4].
Những tạp chất này, đặc biệt là protein và muối vô cơ nằm đan xen nhau trong mạch cao
phân tử chitin/chitosan, nên khi áp dụng các phương pháp xác định vết protein thông
thường cho hợp chất thấp phân tử sẽ có độ chính xác không cao. Mặt khác, trong cấu tạo
hoá học của đại phân tử chitin/chitosan đã có chứa nitơ ở các nhóm chức (NHCOCH3,
NH2), vì vậy không thể dùng phản ứng Kjeldahl đơn thuần để xác định vết protein được.
Do đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng vết
protein trong chitin/chitosan để góp phần xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho vật liệu này.
II - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu
- Chitin, chitosan kỹ thuật, chitosan tinh chế: do phòng Nghiên cứu Polyme Dược phẩm Viện Hoá học sản xuất.
- Dung dịch NaOH 10% và 1,25%
- Dung dịch HCl 10N
- Dung dịch CuSO4 6%
2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp đề xuất: Cân chính xác khoảng 4g chitin/chitosan (A) đã sấy khô đến khối
lượng không đổi. Thêm vào A một lượng 196 ml dung dịch NaOH 10% (B). Tách chiết
protein TRONG A bằng cách hồi lưu B trong 5 giờ ở nhiệt độ 1000C. Việc tách chiết vết
protein này được lặp lại 2 lần, tổng cộng dùng 392 ml NaOH 10%. Sau đó lọc loại bỏ

chitin/chitosan, gộp dịch lọc, thu được dung dịch C. Dịch lọc C được trung hoà bằng HCl
10N đến pH = 7 (D), cất loại bỏ nước ỏ 600C trong điều kiện chân không, thu được bột
màu vàng mà trong đó có thể chứa vết protein còn sót lại trong A (E).
Chất E được làm khô bằng Silicagen trong bình hút ẩm chân không đến khối lượng
không đổi (F). Xác định vết protein trong F bằng cách phân tích hàm lượng Nitơ toàn
phần theo phương pháp Kjeldahl [5]. Lặp lại các thí nghiệm trên 3 lần để lấy giá trị trung
bình của các kết quả nghiên cứu
Phương pháp đối chứng: Chọn phương pháp xác định polypeptid và acid amin trong
chitin/chitosan thông thường [6] là phương pháp đối chứng: cân chính xác 10g
chitin/chitosan (A) đã được nghiền mịn. Cho A vào một cốc thuỷ tinh với 50 ml nước cất
(B). Ðun sôi B trong 10 phút, lọc loại bỏ A, giữ lại dịch lọc trong (C). Cho vào dịch lọc C
một lượng 25 ml dung dịch CuSO4 6% (D). Thêm từ từ 25 ml NaOH 1,25% vào D,
khuấy đều.


Vết protein sẽ kết tủa. Loại bỏ nước ở 600C trong điều kiện chân không, thu được chất
bột màu xanh (E). Xác định vết protein trong E theo phương pháp Kjeldahl [5]. Lặp lại
các thí nghiệm trên 3 lần để lấy giá trị trung bình của các kết quả nghiên cứu.
III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả xác định hàm lượng vết protein trong vật liệu chitin/chitosan theo hai phương
pháp trên với các mẫu khác nhau được thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Hàm lượng vết protein trong vật liệu chitin/chitosan (phương pháp 1: đề xuất ;
phương pháp 2 : chứng).
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy.
Phương pháp
Số mẫu
Tên mẫu
Phương pháp 1
2
1

Chitin KT 1
0,51
0,32
2
Chitin KT 2
0,56
0,34
3
CHITIN KT 3
0,55
0,36
4
Chitosan KT 1
0,30
0,25
5
Chitosan KT 2
0,28
0,25
6
Chitosan KT 3
0,28
0,26
Chitosan tinh chế
7
0,05
Không có vết
1
Chitosan tinh chế Không phát hiện
8

Không có vết
2
thấy
Chitosan tinh chế Không phát hiện
9
Không có vết
3
thấy
- Với cùng một mẫu, hàm lượng vết protein trong các mẫu chitin/chitosan được xác định
theo phương pháp đề xuất cao hơn so với phương pháp đối chứng.
- Mẫu chitosan tinh chế có hàm lượng vết protein thấp hơn (không phát hiện thấy vết
protein trong phép thử) so với mẫu chitosan kỹ thuật và mẫu chitin.
Do protein nằm đan xen giữa mạch đại phân tử chitin/chitosan nên rất khó loại ra và khó
xác định theo các phương pháp thông thường. Ở phương pháp đề xuất này đã phải dùng
NaOH 10% Ở nhiệt độ 1000C trong 5 giờ để tách chiết nhiều lần vết protein còn lại trong
mạch chitin/chitosan.
Ở phương pháp đối chứng, chỉ sử dụng nước cất đun sôi, nên khả năng tách chiết vết
protein trong chitin/chitosan không cao, không triệt để, do đó kết quả hàm lượng vết
protein thu được có phần thấp hơn.
IV - KẾT LUẬN
Sử dụng phương pháp đề xuất trên để xác định vết protin trong chitin/chitosan cho kết
quả sát thực hơn vì các mẫu chitin/chitosan trên thế giới mà chúng tôi thu thập được, đều
có hàm lượng vết protein 0,5 - 0,8%. Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp này là phương
pháp xác định vết protein trong chitin/chitosan cho việc xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật của
vật liệu này.
SUMMARY
Protein trace present in chitin/chitosan product has been determined by our proposed
method in which protein trace included in chitin/chitosan was extracted by refraction in
10% NaOH solution at 1000C for 5 hours. Chitin/chitosan precipitate was discarded.
Protein trace in the solution was restored by neutralizing with HCl 10N to get the yellow

powder. This powder was then analyzed for total nitrogen content by Kjeldahl method.


The control method was conducted at the same procedure excepted from the presence of
10% NaOH. The results of different chitin/chitosan samples obtained from these two
methods showed that amount of protein trace obtained from above proposed method was
somewhat higher than that of the control one. Besides, the purified chitosan sample gave
the lower protein trace content than that of the technical chitosan sample as well as
chitin one. Protein trace bound between macromolecules of chitin/chitosan was
separated in the proposed method by boiling water under alkaline condition whereas it
was not completely separated in the control/ method because sodium hydroxide was
absent. Therefore, the proposed method has given more exact result".
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 . K. Rai, T. Kinuman and T. Fujita. On the toxicity of chitosan Bull. Tokai Regional
Fisheries Res. Lab.. 1968, 56-89
2. Sang-Mun Han. Jong-Beom Son, Seung Jin Lee, Yong-Beom Kim, Byung-Kook
Kwak. Hyung-Jim Shim. Application of chitin and chitosan to embolization of vascular
systems. International conference 8th ICCC - 4th APCCS. September 21 - 23. 2000.
Yamaguchi Japan, p. 160
3. Nguyễn Thị Ngọc Tú và cộng sự Tuyển tập các báo cáo khoa học, Viện Hoá học,
1995, tr. 259
4. Tài liệu khoa học về chitin/chitosan của phòng Polyme Dược phẩm - Viên Hoá học
(1993 - 2002)
5. Dược điển Viêt nam, xuất bản lần thứ II, tập 3, 1994, Nhà xuất bản y học
Tạp chí dược học : Số 11 Năm 2002, trang 23 - 24