NGHIÊN cứu xác ĐỊNH hba1c máu THEO BA PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU ở BỆNH NHÂN có bất THƯỜNG về HEMOGLOBIN SO với NGƯỜI BÌNH THƯỜNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
……..***…….

NGUYỄN DUY NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HbA1c MÁU THEO BA PHƯƠNG PHÁP
KHÁC NHAU Ở BỆNH NHÂN CÓ BẤT THƯỜNG VỀ HEMOGLOBIN
SO VỚI NGƯỜI BÌNH THƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2011-2015

Hà Nội – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
……..***…….

NGUYỄN DUY NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HbA1c MÁU THEO BA PHƯƠNG PHÁP
KHÁC NHAU Ở BỆNH NHÂN CÓ BẤT THƯỜNG VỀ HEMOGLOBIN
SO VỚI NGƯỜI BÌNH THƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khóa 2011-2015

Người hướng dẫn khoa học:
TS. BS. Đào Huyền Quyên
PGS. TS. Phạm Thiện Ngọc

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Quản lý
đào tạo Đại học - Trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Hóa Sinh trường Đại
học Y Hà Nội đã tạo điều kiện để em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. BS. Đào
Huyền Quyên, PGS. TS Phạm Thiện Ngọc, những người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho em những ý kiến quý báu trong quá trình
thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong khoa Hóa Sinh Bệnh viện Bạch Mai, phòng xét nghiệm khoa Khám chữa bệnh theo yêu cầu
Bệnh viện Bạch Mai, khoa Huyết học Bệnh viện Bạch Mai và Trung tâm
Thalassemia Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã luôn tạo điều kiện
thuận lợi, tận tình giúp đỡ cho em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, cùng với những người
thân trong gia đình, bè bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ em trong suốt thời
gian học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Duy Ngọc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã tham gia nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này
một cách nghiêm túc.
Các số liệu của khóa luận được lấy trung thực, chính xác và kết quả
chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào. Các bài trích dẫn đều được lấy từ
các tài liệu đã được công nhận. Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Duy Ngọc


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Hb

: Hemoglobin

GHb

: Glycated Hemoglobin

THb

: Total Hemoglobin

HbA1c

: Hemoglobin A1c

HPLC

: High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp)

ĐTĐ

: Đái tháo đường

ADA

: American Diabetes Association

DCCT

: Diabetes Control and Complications Trial

CAP

: College of American Pathologists

IFCC

: International Federation of Clinical Chemistry

NGSP

: National Glycohemoglobin Standardization Program

EDTA

: Ethylen diamin tetraacetat

SD

: Standard Deviation

CV

: Coefficients of Variation

QC

: Quality Control


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................3
1.1. Tổng quan về HbA1c...............................................................................3
1.1.1. Sự glycosyl hóa.................................................................................3
1.1.2. Sự glycosyl hóa Hemoglobin.............................................................4
1.1.3. Ý nghĩa lâm sàng của chỉ số HbA1c....................................................5
1.2. Xét nghiệm HbA1c..................................................................................8
1.2.1. Kỹ thuật định lượng HbA1c dựa trên sự khác nhau về điện tích...........8
1.2.2. Kỹ thuật định lượng HbA1c dựa trên sự khác nhau về cấu trúc..........10
1.2.3. Các kỹ thuật định lượng HbA1c được sử dụng trong nước..................11
1.3. Những biến thể Hemoglobin thường gặp ảnh hưởng đến kết quả xét

nghiệm HbA1c..............................................................................................16
1.4. Cơ sở đánh giá phương pháp................................................................18
1.4.1. Độ chính xác ( Độ lặp lại)................................................................18
1.4.2. Độ xác thực.....................................................................................19
1.4.3. Định lượng HbA1c bằng 3 phương pháp ở bệnh nhân Thalassemia....20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............21
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................21
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân........................................................21
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................21
2.1.3. Máy móc và trang thiết bị................................................................21
2.1.4. Thuốc thử, hóa chất.........................................................................22
2.1.5. Nguyên lý của ba phương pháp định lượng HbA1c............................22
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................25


2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................25
2.3.1. So sánh độ chính xác.......................................................................25
2.3.2. So sánh độ xác thực.........................................................................26
2.3.3. Định lượng HbA1c máu ở nhóm bệnh nhân Thalassemia bằng ba
phương pháp.............................................................................................27
2.3.4. Xử lý số liệu....................................................................................27
2.3.5. Đạo đức nghiên cứu.........................................................................28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................29
3.1. So Sánh độ chính xác...........................................................................29
3.1.1. Độ chính xác ( Độ lặp lại) ngắn hạn trong kết quả định lượng HbA1c ở
mẫu máu của nhóm người bình thường......................................................29
3.1.2. Độ chính xác ngắn hạn trong kết quả định lượng HbA1c ở mẫu máu
của nhóm ĐTĐ.........................................................................................30
3.1.3. Độ chính xác dài hạn trong kết quả định lượng HbA1c ở mẫu huyết
thanh kiểm tra...........................................................................................30

3.2. Độ xác thực của 3 phương pháp...........................................................31
3.3. Định lượng HbA1c máu của nhóm bệnh nhân Thalassemia bằng 3
phương pháp................................................................................................32
3.3.1. So sánh kết quả định lượng HbA1c ở các nhóm nghiên cứu trên 3 máy..32
3.3.2. Định lượng HbA1c máu của nhóm bệnh nhân Thalassemia bằng ba
phương pháp.............................................................................................34
3.3.3. Tương quan kết quả HbA1c giữa 3 phương pháp tích hợp trên 3 máy ở
nhóm bệnh nhân Thalassemia....................................................................36
3.3.4. Tương quan kết quả HbA1c giữa 3 phương pháp tích hợp trên 3 máy ở
nhóm người bình thường...........................................................................40
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...............................................................................45
4.1. Bàn luận về độ chính xác......................................................................45


4.2. Bàn luận về độ xác thực.......................................................................46
4.3. Bàn luận về định lượng HbA1c máu của bệnh nhân Thalassemia bằng 3
phương pháp................................................................................................47
KẾT LUẬN.....................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các dạng HbA.....................................................................................5
Bảng 1.2. Tổng hợp các dạng HbA1......................................................................5
Bảng 1.3. Ba phương pháp phổ biến định lượng HbA1c........................................11
Bảng 3.1. Độ lặp lại kết quả định lượng HbA1c ở mẫu máu của nhóm người bình
thường..............................................................................................29
Bảng 3.2. Độ lặp lại kết quả định lượng HbA1c ở mẫu máu của nhóm ĐTĐ..........30
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác dài hạn của trong định lượng HbA1c ở mẫu
kiểm tra của 3 máy............................................................................31

Bảng 3.4: Độ xác thực tương đối D% qua các lần phân tích của mẫu kiểm tra......32
Bảng 3.5. So sánh kết quả định lượng HbA1c ở các nhóm nghiên cứu trên 3 máy..33
Bảng 3.6. Tỷ lệ các mẫu có HbA1c nhỏ hơn 4.8% ở nhóm bệnh nhân Thalassemia
được định lượng ở cả 3 máy...............................................................34
Bảng 3.7. Kết quả định lượng HbA1c lặp lại ở nhóm bệnh nhân Thalassemia trên 3
máy..................................................................................................35


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở bệnh nhân Thalassemia trên hai
máy ultra2A1c và máy c311.................................................................36
Biểu đồ 3.2. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở bệnh nhân Thalassemia trên hai
máy ultra2A1c và máy Tosoh...............................................................37
Biểu đồ 3.3. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở bệnh nhân Thalassemia trên hai
máy máy Tosoh và máy c311.............................................................38
Biểu đồ 3.4. Đồ thị biểu diễn độ chênh lệch kết quả HbA1c giữa 3 máy trên nhóm
bệnh nhân Thalassemia......................................................................39
Biểu đồ 3.5. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở người bình thường trên hai máy
ultra2A1c và máy c311........................................................................41
Biểu đồ 3.6. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở người bình thường trên hai máy
ultra2A1c và máy Tosoh......................................................................42
Biểu đồ 3.7. Đồ thị biểu diễn kết quả HbA1c máu ở người bình thường trên hai máy
máy Tosoh và máy c311.....................................................................43
Biểu đồ 3.8. Đồ thị biểu diễn độ chênh lệch kết quả HbA1c giữa 3 máy trên nhóm
người bình thường.............................................................................44


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sự glycosyl hóa protein tạo ra các sản phẩm AGE..................................3
Hình 1.2. Mối liên kết giữa Protein gắn đường và Boronate.................................12

Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế hoạt động.......................................................................13
Hình 1.4. Sơ đồ cơ chế của phản ứng..................................................................15


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh lý mạn tính ngày càng trở nên quen
thuộc trong cộng đồng. Bệnh được đặc trưng bởi tình trạng tăng Glucose máu
cùng với các rối loạn về chuyển hóa Glucid, Protid, Lipid và chất khoáng.
Trong những năm gần đây, ĐTĐ đang ngày càng là vấn đề lớn đối với giới y
khoa cũng như đối với cộng đồng. ĐTĐ và các biến chứng của nó là mối đe
dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe, tính mạng con người và trở thành gánh
nặng đối với sực phát triển kinh tế xã hội. Do v ậy, việc chẩn đoán sớm và
kiểm soát nồng độ Glucose máu tốt sẽ giúp can thiệp bệnh kịp thời, tăng hiệu
quả điều trị. Để đánh giá Glucose máu có được kiểm soát tốt hay không ngoài
định lượng Glucose máu còn có một xét nghiệm thường quy khác quan trọng
không kém là định lượng HbA1c.
Chính vì vậy năm 2010, cùng với đề nghị của Ủy ban Chuyên gia quốc
tế, Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kì (ADA) đã khuyến cáo đưa thêm xét nghiệm HbA 1c
để sử dụng chẩn đoán ĐTĐ [1].
Trong việc quản lý bệnh nhân tiểu đường, kiến thức về sự ảnh hưởng của
Hemoglobin đến phương pháp xác định HbA 1c là cần thiết bởi vì các biến thể
Hemoglobin có thể gây ra thiếu sót trong quản lý bệnh tiểu đường do kết quả
HbA1c sai.
Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 30 phương pháp xét nghiệm
HbA1c, dựa vào hai nguyên lý chính là: Sự khác biệt về điện tích (Charge
differences) và sự khác biệt về cấu trúc ( Structural differences). Trong đó
hiện có 4 phương pháp chính thường được sử dụng tại phòng xét nghiệm là
Sắc ký lỏng cao áp - trao đổi ion ( ion - exchange high - performance liquid

chromatography), Miễn dịch ( Immunoassay), Enzym ( Enzymatic), Sắc ký
lỏng cao áp - ái lực Boronate ( Boronate affinity - HPLC). Tại các bệnh viện


2
lớn ở Việt Nam, ba phương pháp được sử dụng nhiều hơn cả là sắc ký lỏng
cao áp - ái lực Boronate, sắc ký lỏng cao áp - trao đổi ion và Miễn dịch. Ba
phương pháp này có những ưu nhược điểm nhất định và được tích hợp trên ba
máy xét nghiệm là ultra2A1c ( sắc ký lỏng cao áp - ái lực Boronate), c311
( miễn dịch đo độ đục - ức chế ngưng kết vi hạt) và máy Tosoh G8 ( sắc ký
lỏng cao áp - trao đổi ion) thì những ưu nhược điểm đó càng được thể hiện
một cách rõ nét. Ngoài việc phân tích những ưu nhược điểm và so sánh ba
phương pháp trên lý thuyết, việc tiến hành so sánh trên thực tế là cần thiết để
có thể có lựa chọn máy phân tích phù hợp cho từng labo. Cho đến nay vẫn
chưa có một nghiên cứu nào chi tiết về độ chính xác và xác thực của 3 hệ
thống máy này trong việc xác định HbA1c máu ở bệnh nhân có bất thường về
Hemoglobin tại Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Nghiên cứu
xác định HbA1c máu theo ba phương pháp khác nhau ở bệnh nhân có bất
thường về Hemoglobin so với người bình thường” với 2 mục tiêu:
1.

So sánh độ chính xác và xác thực của ba phương pháp định lượng
HbA1c trên ba máy ultra2A1c, c311 và Tosoh G8.

2.

Đánh giá tính tương quan trong kết quả định lượng HbA 1c máu của
các bệnh nhân Thalassemia ở ba phương pháp trên ba máy ultra 2A1c,
c311 và Tosoh G8.

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
CHƯƠNG 1 Tổng quan về HbA1c
1.1.1. Sự glycosyl hóa
Carbohydrat là các dẫn xuất của aldehyde hoặc ceton của các polyancol,
bao gồm ba nhóm chính: monosaccarid, oligosaccarid và polysaccarid.
Carbohydrat và các sản phẩm dị hóa của chúng đặc biệt có glucose là
nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người, là nguồn cung
cấp năng lượng chính cho não, hồng cầu và tế bào.
Trong cơ thể người, hiện tượng gắn kết của một phân tử glucose hoặc
các dẫn xuất phosphoryl của glucose với protein, enzym trong máu hoặc trong
mô mà không cần enzym được gọi là sự glycosyl hóa. Lysine và Valine là 2 vị
trí acid amin đầu tiên mà glucose gắn kết. Khi glucose kết hợp với protein sẽ
làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein. Đường huyết càng cao và sự
tiếp xúc giữa đường với protein càng lâu thì quá trình này càng lan rộng.
Quá trình glycosyl hóa theo thời gian sản sinh ra các sản phẩm được
trình bày ở Hình 1.1, sản phẩm cuối cùng gọi chung là AGE ( Advanced
Glycosylation End products ).

Hình 1.1. Sự glycosyl hóa protein tạo ra các sản phẩm AGE


4
1.1.2. Sự glycosyl hóa Hemoglobin
Hemoglobin (Hb) là thành phần chính của hồng cầu, gồm hai thành phần
là nhân hem và globin. Trong hồng cầu người trưởng thành bình thường có ba
loại hemoglobin (Hb): HbA (chiếm 95 – 97%), HbA 2 (<3%) và HbF. HbA

(Hb chủ yếu) được tạo nên bới 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi α và 2 chuỗi β.
Một vài sự biến đổi chuyển dạng của HbA được chú ý, bao gồm sự gắn thêm
carbamyl, acetyl, sulfat và glucose (chính là hiện tượng glycosyl hóa) [2].
Năm 1955, những bằng chứng đầu tiên về việc Hb bị glycosyl hóa là khi
người ta phát hiện ra một lượng nhỏ Hb có thể tách ra từ HbA bởi sự dịch
chuyển khác biệt về điện tích trong tấm hồ tinh bột [3]. Tiếp sau đó, bằng sắc
ký lỏng cao áp, người ta đã tách chiết được ba loại protein nhân hem là
HbA1a, HbA1b, HbA1c, [4]. Sau hơn 10 năm, phát hiện này mới được để ý tới
khi Rahbar tìm ra một loại protein bất thường khi điện di máu của những bệnh
nhân ĐTĐ vào năm 1968 [5]. Hb này được xác định là HbA1c, được nhận thấy
là tăng gấp đôi ở bệnh nhân tiểu đường so với người khỏe mạnh bình thường
[6]. Cũng tại thời điểm, việc phân tích HbA1c tiết lộ rằng có một phân tử
hexose gắn đồng hóa trị với valin ở đầu amin của chuỗi β của HbA1c . Vài năm
sau, HbA1c được định nghĩa là một sản phẩm có gắn hexose ổn định trên acid
amin valin ở đầu amin của chuỗi β của HbA, định nghĩa bởi IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry) [7]. Xét nghiệm HbA1c
được đề xuất sử dụng như một xét nghiệm thường quy bởi Anthony Cerami,
Ronald Koenig và các cộng sự vào năm 1976 [8].
Phải chú ý rằng, sự glycosyl hóa Hb có thể diễn ra ở những chuỗi khác
ngoài đầu tận amin của chuỗi β, như là ở acid amin valin ở đầu tận amin trên
chuỗi α và cả acid amin lysine trên chuỗi α hoặc β [9]. Những Hb bị glycosyl
hóa này được gọi là “Glycated HbA 0” hay “Total glycated Hb (GHb)”. Sản
phẩm glycosyl hóa Hb có ý nghĩa hơn cả là HbA1c.


5
HbA1c chỉ là một dạng nằm trong GHb, trong khi GHb là nói chung cho tất
cả các loại Hb bị glycosyl hóa. Vì vậy, cần phân biệt rõ ràng giữa HbA1c và GHb.
Bảng 1.1. Các dạng HbA [2]
HbA

HbA0
HbA1
Total

Chứa 2 chuỗi α và 2 chuỗi β, 95~97% là HbA.
Hb không bị glycosyl hóa, 90%.
Hb bị glycosyl hóa, (5~7%) bao gồm HbA1a, HbA1b và HbA1c (4 - 6%).
Gồm HbA1 và những sản phẩm gắn carbonhydrat của Hb nói chung.

GHb

Các dạng khác nhau của HbA bị glycosyl hóa (HbA1) cũng đã được xác
định như ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tổng hợp các dạng HbA1 [2]
HbA1a1
HbA1a2
HbA1b
HbA1c

Có frutose-1,6-diphosphat gắn với đầu amin tận của chuỗi β.
Có Glucose-6-phosphat gắn với đầu amin tận của chuỗi β.
Có acid pyruvic gắn với đầu amin tận của chuỗi β.
Có Glucose gắn với đầu amin tận của chuỗi β.

1.1.3. Ý nghĩa lâm sàng của chỉ số HbA1c
Do sự hình thành HbA1c xảy ra chậm, bền vững và tồn tại cùng đời sống
hồng cầu nên HbA1c phản ánh mức glucose máu trong vòng 2 – 3 tháng trước
đó, là thông số cần thiết giúp theo dõi sự kiểm soát glucose máu, giúp quản lý
bệnh đái tháo đường tốt hơn.
1.1.3.1. Chỉ số HbA1c trong chẩn đoán bệnh ĐTĐ

Tiêu chuẩn mới chẩn đoán ĐTĐ theo khuyến cáo Hiệp hội Đái tháo
đường Hoa Kỳ 2010. Chẩn đoán dựa vào 1 trong 4 tiêu chuẩn sau:
1. HbA1c ≥ 6,5 %
Xét nghiệm nên được thực hiện tại phòng xét nghiệm sử dụng phương
pháp chuẩn.


6
2. Đường huyết đói ≥ 126mg/dL (7,0mmol/L).
Đường huyết đói được định nghĩa là đường huyết khi đo ở thời điểm
nhịn đói ít nhất 8 giờ.
3. Đường huyết 2 giờ ≥ 200mg/dL (11,1mmol/L) khi làm test dung nạp
Glucose.
4. Bệnh nhân có triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết hay tăng
đường huyết trầm trọng kèm theo xét nghiệm đường huyết ngẫu nhiên ≥
200mg/dL (11,1mmol/L) [1].
1.1.3.2. HbA1c trong theo dõi điều trị và kiểm soát biến chứng ĐTĐ
Những người mắc bệnh tiểu đường có HbA 1c càng cao hơn mức bình
thường thì nguy cơ phát triển các biến chứng của bệnh ĐTĐ càng lớn. Xét
nghiệm HbA1c được sử dụng để theo dõi sự kiểm soát glucose máu trong bệnh
ĐTĐ theo thời gian. Mục đích của xét nghiệm để duy trì nồng độ Glucose máu
về gần nhất với giá trị bình thường. Điều này giảm thiểu biến chứng, gây ra bởi
nồng độ Glucose cao kéo dài, như là việc phá hủy các cơ quan của cơ thể: Gan,
thận, mắt, hệ tuần hoàn, thần kinh. Giúp bệnh nhân ĐTĐ và bác sĩ biết được
việc tiến hành điều trị, kiểm soát ĐTĐ đã thành công hay chưa hay cần phải
điều chỉnh. Xét nghiệm có thể được chỉ định vài lần khi việc kiểm soát được
hoàn thành và sau đó vài lần trên 1 năm để xác thực lại rằng sự kiểm soát tốt
đang được duy trì.
Dựa vào typ ĐTĐ, tình trạng kiểm soát nồng độ Glucose máu và sự chỉ
định của bác sĩ, xét nghiệm HbA1c được tiến hành 2 - 4 lần / 1 năm. Hiệp hội

ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) khuyến cáo nên xét nghiệm HbA 1c cho bệnh nhân ĐTĐ
ít nhất 2 lần / 1 năm. Với bệnh nhân lần đầu được chẩn đoán là ĐTĐ, nếu
mức Glucose quá kiểm soát, xét nghiệm HbA1c nên được chỉ định thường
xuyên hơn.


7
Trong chẩn đoán và theo dõi ĐTĐ, HbA1c có thể được chỉ định như là 1
phần của kiểm tra sức khỏe định kỳ hoặc khi bệnh nhân nghi ngờ ĐTĐ bởi
những tín hiệu và triệu chứng tăng nồng độ Glucose máu (hyperglycemia)
như là: ăn nhiều, khát nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều, mệt mỏi, thị lực kém,
nhiễm trùng lâu khỏi.
Với mục đích theo dõi sự kiểm soát glucose, HbA1c được xác định theo tỉ
lệ phần trăm. Ở phần lớn bệnh nhân ĐTĐ, được khuyến cáo nên duy trì nồng độ
HbA1c dưới 7% như theo mục tiêu điều trị của ADA đối với bệnh nhân tiền ĐTĐ
mà không có tiền sử hạ glucose máu quá mức (excessive hypoglycemia), tốt
nhất nên trong khoảng giá trị bình thường. Nồng độ HbA1c tăng sẽ dẫn đến nguy
cơ biến chứng.
Tuy nhiên đối với ĐTĐ typ 2, mục tiêu điều trị HbA 1c (mức HbA1c đích)
có thể được lựa chọn bởi người bệnh và bác sĩ. “Đích” này phụ thuộc vào 1
vài yếu tố như là độ dài của thời gian từ khi chẩn đoán, sự có mặt của các
bệnh lý khác như là biến chứng của bệnh ĐTĐ (mất hoặc hạn chế thị lực, tổn
thương thận), nguy cơ của các biến chứng từ nồng độ glucose máu thấp
(hypoglycemia). Ví dụ, 1 người với bệnh tim bị ĐTĐ typ 2 trong vòng nhiều
năm mà không có biến chứng có thể có “đích” HbA 1c cao hơn (HbA1c target):
7,5 - 8% trong khi 1 người hoàn toàn khỏe mạnh và mới được chẩn đoán sẽ có
mức đích thấp hơn 6 - 6,5%.
Xét nghiệm HbA1c có thể được thể hiện dưới đơn vị % và cũng có thể
được thể hiện dưới đơn vị mmol/mol (SI units) và nồng độ glucose trung bình
tương đương – estimated Average Glucose (eAG), eAG được tính toán dựa

trên HbA1c.
Mục đích của eAG để giúp bệnh nhân liên kết giữa kết quả HbA 1c với
nồng độ glucose theo dõi hàng ngày và xét nghiệm glucose trong phòng xét
nghiệm. Đơn vị cho eAG được tính từ HbA1c là mg/ dL hoặc mmol/L. eAG là


8
sự ước lượng của nồng độ glucose kéo dài trong khoảng 2 tháng, nó không
tương ứng 1 cách chính xác với kết quả nồng độ glucose máu hàng ngày [10].
1.2. Xét nghiệm HbA1c
* Hiện nay trên thế giới có hơn 30 phương pháp xét nghiệm HbA1c. Dựa
trên 2 nguyên lý chính [11]:
- Sự khác biệt về điện tích (charge diffirences): trao đổi ion sắc ký lỏng
cao áp, điện di.
- Sự khác biệt về cấu trúc (structural diffrences): Ái lực Boronate, miễn
dịch, enzym.
Nồng độ HbA1c được đo và thể hiện qua phần trăm trên tổng
hemoglobin.
* Mẫu bệnh phẩm: máu được chống đông bằng EDTA, heparin hay
flourid. Máu toàn phần có thể bảo quản ở 4 - 8oC trong vòng 1 tuần, dịch
hemolysate có thể ổn định ở 4 oC 4 - 7 ngày và 30 ngày ở -70 oC. Tuy nhiên,
tính ổn định còn đặc hiệu phương pháp. Máu toàn phần có thể ổn định 1 năm
ở -70 oC [11].
1.2.1. Kỹ thuật định lượng HbA1c dựa trên sự khác nhau về điện tích
1.2.1.1. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp trao đổi ion
Sắc ký là một phương pháp phân tách và phân tích các chất trong một hỗn
hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh:
- Pha tĩnh (stationary phase) còn gọi là pha cố định, là phần chất liệu
hoặc dung dịch được giữ cố định trong quá trình sắc ký. Pha tĩnh có tác dụng
giữ các chất lại.

- Pha di động (mobile phase): là phần khí (sắc ký khí), dung dịch (sắc ký
lỏng) chảy qua pha tĩnh. Pha di động có tác dụng kéo các chất đi.
Hai pha này luôn tiếp xúc với nhau nhưng không trộn lẫn vào nhau. Các
chất có ái lực càng lớn với pha tĩnh sẽ di chuyển càng chậm trong quá trình
sắc ký và ngược lại [12].


9
Với các thiết bị hiện đại, khả năng tách và độ nhạy của phương pháp sắc
ký ngày càng cao, lượng mẫu cần để phân tích ngày càng nhỏ trong khi kích
thước các tiểu phân pha tĩnh và kích thước cột ngày càng nhỏ và áp suất của
dòng pha động ngày càng cao.
Tùy theo bản chất pha động mà ta chia thành hai loại sắc ký sau:
- Sắc ký lỏng: pha động là chất lỏng, có thể sử dụng một loại dung môi
hay hỗn hợp nhiều loại dung môi. Các phương pháp sắc ký lỏng thông dụng
gồm sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực và sắc ký
ion.
- Sắc ký khí: pha động là khí trơ không có lực tương tác hóa học hay vật
lý với chất cần phân tích.
* Sắc ký lỏng cao áp trao đổi ion trong định lượng HbA1c
Sắc ký lỏng hiệu năng cao trao đổi ion (HPLC) phân tách các loại Hb
dựa trên sự khác nhau về điện tích của chúng. Mẫu được bơm tự động hoặc
bằng tay vào cột có chứa resin hoặc gel có các nhóm chức điện tích trái dấu
với các phân tích. Dung dịch đệm với lực ion tăng dần chảy qua cột, đẩy các
loại Hb ra. Các phần Hb được phân tách lần lượt đi qua đầu dò, mật độ quang
được đo bằng quang phổ kế. Phần mềm tích hợp sẽ xử lý số liệu và tính toán
kết quả. Các thiết bị hiện nay sử dụng máu toàn phần và có cả bộ phận trộn
lắc mẫu, pha loãng và bơm mẫu tự động, HPLC là phương pháp có độ chính
xác cao và có khả năng phát hiện sự có mặt của các biến thể của Hb.
1.2.1.2. Điện di

Điện di là phương pháp phân tách các loại Hb dựa trên sự khác nhau về
điện tích, mẫu thử được đặt trên gel agarose và đặt trong 1 điện trường, các
loại Hb di chuyển và được phân tách. Sau điện di, các băng được lọc bởi
densitometer và so sánh với chuẩn đề định lượng. Năm 2007, Hiệp hội các
nhà bệnh học Mỹ (CAP) tổng kết không thấy phòng xét nghiệm nào định
lượng GHb (hemoglobin glycosyl hóa) bằng phương pháp điện di.


10
1.2.2. Kỹ thuật định lượng HbA1c dựa trên sự khác nhau về cấu trúc
1.2.2.1. Sắc ký ái lực Boronate
Boronate được gắn cố định trên một Matrix trơ, không tan. Boronate
tương tác chọn lọc với các nhóm cis-diol có mặt trong các phân tử đường như
glucose để tạo liên kết đồng hóa trị chặt nhưng thuận nghịch. GHb sẽ được
giữ lại, trong khi Hb không bị glycosyl hóa sẽ bị rửa giải bằng đệm. Tác nhân
hòa tan chứa diol như sorbitol được dùng để đấy GHb ra. Cả hai loại Hb được
phát hiện bằng phương pháp quang phổ tại bước sóng 414nm. Phương pháp
này định lượng tổng lượng GHb.
1.2.2.2. Miễn dịch
Sử dụng kháng thể nhận biết các nhóm tận amin được glycosyl hóa của
chuỗi beta. Các phương pháp có trên thị trường hiện nay sử dụng ngưng kết
latex - kháng thể hoặc miễn dịch đo độ đục.
1.2.2.3. Enzym
Máu toàn phần được tạo dịch huyết tán, sau đó được thủy phân bởi
protease. Valin glycosyl hóa là cơ chất của enzym fructosyl valin oxidase.
Hydrogen peroxid được tạo thành từ phản ứng trên sẽ bị phân hủy bởi
peroxidase với sự tham gia của chất sinh màu. Màu tạo thành tỉ lệ thuận với
nồng độ GHb.
Bảng 1.3. Ba phương pháp phổ biến định lượng HbA1c
Phương pháp

Cơ sở

Sắc ký lỏng cao

Dựa trên sự khác nhau về điện tích giữa HbA1c và các Hb

áp - trao đổi ion
Sắc ký lỏng cáo

khác.
Dựa trên phản ứng đặc hiệu của aminophenylboronic với

áp - ái lực

nhóm cis-diol của glucose gắn với Hb.


11
Boronate
Dựa trên sự đặc hiệu của phản ứng KN-KT, KT nhận ra
Miễn dịch

cấu trúc các amino acid bị glycosyl hóa ở đầu amin trên
chuỗi beta (thường là từ 4-10 acid amin đầu tiên).

1.2.3. Các kỹ thuật định lượng HbA1c được sử dụng trong nước
Tại các bệnh viện lớn ở Việt Nam, ba phương pháp được sử dụng nhiều hơn
cả là sắc ký lỏng cao áp - ái lực Boronate, sắc ký lỏng cao áp - trao đổi ion và
Miễn dịch. Ba phương pháp này được tích hợp trên ba máy xét nghiệm là

ultra2A1c ( sắc ký lỏng cao áp - ái lực Boronate), c311 ( miễn dịch đo độ đục - ức
chế ngưng kết vi hạt) và máy Tosoh ( sắc ký lỏng cao áp - trao đổi ion).
1.2.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp – ái lực Boronate tích hợp trên máy
ultra2A1c của hãng Primus
Hệ thống máy ultra2A1c hoạt động dựa trên nguyên lý của phương pháp
sắc ký lỏng cao áp và phương pháp sắc ký ái lực Boronate. Với thời gian phân
tích 2 phút / 1 mẫu bệnh phẩm và đưa ra kết quả với các đơn vị chuẩn hóa
(HbA1c%, HbA1c mmol/mol), ultra2A1c là hệ thống máy cho kết quả phân tích
HbA1c nhanh chóng cho các phòng xét nghiệm. Hệ thống bao gồm máy quét
barcode, hệ thống hút mâu tự động, máy phân tích, máy tính với phần mềm
điều khiển AffinityTM, giá để mẫu có khả năng chứa khoảng 475 mẫu bệnh
phẩm đưa đến năng suất cao cho các phòng xét nghiệm với quy mô vừa và
lớn, làm giảm áp lực của khâu xét nghiệm trong quá trình khám chữa bệnh,
tạo thuận lợi cho cả bác sỹ và bệnh nhân. Phần mềm ultra2A1c được đặc biệt
thiết kế cho việc phân tích GHb/ HbA 1c, kiểm soát 4 hệ thống chức năng mở:
xác định mẫu, phân tích, tính toán và in kết quả (hoặc lưu kết quả).
Sắc ký ái lực Boronate hoàn toàn không bị ảnh hưởng bởi những biến thể
Hb thông thường và những phân tử không bị glycosyl hóa vì chỉ có GHb bền
vững mới bị giữ lại bới Boronate. So sánh với kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp trao


12
đổi ion thì sắc ký ái lực Boronate ít bị sai số bởi những dao dộng nhỏ về pH và
nồng độ ion trong hóa chất [21].
Nguyên lý của phương pháp sắc ký lỏng cao áp – ái lực Boronate là: một
chất có chứa Boronate như phenylboronic acid được gắn trên bề mặt của cột
gel sắc ký. Khi một dung dịch protein (hemolysate và huyết tương loãng) đi
qua cột, thành phần có gắn đường được giữ lại bởi sự tạo phức của các nhóm
diol với chất boronate (Hình 1.2). Những thành phần không có gắn đường
không được giữ lại sẽ đẩy ra khỏi cột ngay. Tiếp theo, các thành phần có gắn

đường được tách khỏi cột nhờ một chất phản ứng tách thành phần này ra khỏi
chất Bonorate của cột.

Hình 1.2. Mối liên kết giữa Protein gắn đường và Boronate.
Trong hệ thống máy ultra2A1c, các đường ống dẫn sẽ vận chuyển các chất
phản ứng qua cột phân tích. Cột phân tích có chứa acid aminophenylboronic
liên kết với giá đỡ polymer dạng xốp (gel).
Các mẫu máu toàn phần cần định lượng GHb được tự động đưa vào cột
theo chất rửa 1 (buffer 2A). Các thành phần có gắn đường sẽ liên kết với
Boronate, trong khi những thành phần không có gắn đường đi qua cột tới bộ
phận phát hiện quang phổ kế và được phát hiện ở bước sóng 413 ± 2 nm.


13
Sau khi loại bỏ các thành phần không có gắn đường, hệ thống ultra 2 sẽ
đưa chất rửa 2 (Buffer 2B) vào, thay thế các thành phần có gắn đường trong
cột. Các thành phần này sau đó cũng di chuyển tới bộ phận phát hiện. Xem
Hình 1.3 để thấy sự liên kết của GHb trong hệ thống này.

Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế hoạt động
Các thành phần của chất rửa 1 và 2 được thiết kế để loại bỏ phần lớn sự
hấp thụ đồng nhất tại dải bước sóng 413 ± 2 nm nhằm đảm bảo cho một
đường nền ổn định.
Ở bước cuối của chu trình, cột được cân bằng lại bằng chất rửa 1. Việc lựa
chọn các chất phản ứng nhằm loại bỏ cả hai thành phần không có gắn đường và
có gắn đường lần lượt theo một trật tự với một thời gian hạn định.
Tất cả các bước được điều chỉnh bởi máy tính. Máy tính sẽ phân tích tín
hiệu từ bộ phận phát hiện quang phổ kế và tính toán nồng độ GHb hay protein
huyết tương theo phần trăm trên tổng số được phát hiện. Phép phân tích từng
khoảng cực đại tính theo đơn vị millivolt/ giây.

14
Máy tính đưa ra bản báo cáo bằng việc vẽ biểu đồ sắc ký trên màn hình
khi tín hiệu được nhận biết bởi bộ phận phát hiện. Sau đó máy tính sẽ in thông
tin xác nhận từng mẫu, tính toán và in kết quả xét. Một bản tóm tắt cũng được
lưu trữ trong ổ cứng.
Phần mềm điều hành chạy trên Window XP sẽ điều chỉnh những bước cơ
bản của hệ thống bao gồm xác định mẫu, vận hành quy trình, tính toán, in và
dự trữ báo cáo kết quả khi hoàn thành.
Việc tính toán phần trăm GHb trong mẫu theo công thức sau đây, với
khoảng cực đại tính theo millivolt/ giây:

×100
Kết quả cuối cùng thu được bằng việc so sánh với các mẫu tham chiếu sử
dụng 1 đường chuẩn 2 điểm [13].
1.2.3.2. Phương pháp miễn dịch đo độ đục - ức chế ngưng kết vi hạt tích hợp
trên máy Cobas c311 của hãng Roche
Máy c311 là hệ thống máy xét nghiệm hóa sinh - miễn dịch thông
thường. Trong đó xét nghiệm HbA1c được thực hiện dựa theo nguyên lý: Miễn
dịch đo độ đục - ức chế ngưng kết vi hạt.
Kỹ thuật định lượng hai nồng độ riêng biệt: HbA 1c và THb. Hai nồng độ
này dùng để xác định % HbA1c.
Nồng độ HbA1c được định lượng theo phương pháp miễn dịch độ đục ức chế ngưng kết vi hạt. HbA1c Reagent 1 chứa kháng thể đơn dòng từ chuột
đặc hiệu ghép cặp với vi hạt. HbA 1c Reagent 2 là yếu tố kết dính bao gồm 1
polymer tổng hợp chứa 1 loạt các bản sao chép kháng nguyên HbA 1c (hapten).
Khi không có mặt HbA1c trong mẫu, hapten HbA1c trong Reagent 2 gắn với
các lớp áo hạt kháng thể trong Reagent 1 và sự kết dính của cặp đôi kháng thể
- vi hạt với kháng nguyên xảy ra. Sự tăng tỷ lệ kết dính dẫn đến tăng độ hấp
thụ quang. Khi không có mặt của HbA1c trong mẫu, HbA1c cạnh tranh với

HbA1c hapten về vị trí gắn trên lớp áo vi hạt. Chỉ có duy nhất 1 vị trí gắn đặc