Sàng lọc hoạt tính enzyme cellulase của vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI NẤM
PHÂN LẬP TỪ NƯỚC BIỂN VEN BỜ THUỘC TỈNH KHÁNH HÒA

Giảng viên hướng dẫn:

TS. Phạm Thu Thủy

Sinh viên thực hiện:

Lê Thị Hồng Lộc

Mã số sinh viên:

57131647

Khánh Hòa – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI NẤM

PHÂN LẬP TỪ NƯỚC BIỂN VEN BỜ THUỘC TỈNH KHÁNH HÒA

GVHD:

TS. Phạm Thu Thủy

SVTH:

Lê Thị Hồng Lộc

MSSV:

57131647

Khánh Hòa – 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Sàng lọc hoạt tính enzyme
cellulase của vi nấm phân lập từ nước biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa”
được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan.
Kết quả này là một phần của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du
ở vùng ven biển Khánh Hòa dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy”
(mã số 106-NN.02-2016.70) do TS. Phạm Thu Thủy là chủ nhiệm đề tài và Quỹ
NAFOSTED tài trợ kinh phí.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn
thành luận văn đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều
chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc.
Khánh Hòa, ngày…tháng…năm 2019
Tác giả luận văn

Lê Thị Hồng Lộc

I


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của
nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công
nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học.
Đ c biệt, tôi xin bày t lòng biết ơn sâu s c đến giáo viên hư ng dẫn là TS.
Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha
Trang đã trực tiếp hư ng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm qu
báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi c ng g i lời cảm ơn chân thành t i PGS. TS. Nguyễn Văn Duy cùng toàn
thể Qu thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học và Bộ môn Sinh học đã tận tình
giúp đỡ. Đ c biệt cảm ơn chị Trần Thị Châu Loan, anh Phạm Bảo Khoa và chị
Huỳnh Thị Bích Mai, c ng như các bạn cùng Nhóm Nghiên cứu Vi sinh đã đồng
hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên và hỗ trợ tôi hoàn thành luận
văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày…tháng…năm 2019
Tác giả luận văn

Lê Thị Hồng Lộc

II

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ............................................................................VII
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ IX
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT.......................................................... X
PHẦN MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về vi nấm biển..................................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan về nấm mốc...............................................................................3
1.1.1.1. Đ c điểm hình thái và cấu tạo của nấm mốc................................... 3
1.1.1.2. Sinh trưởng và dinh dưỡng của nấm mốc........................................ 5
1.1.1.3. Sinh sản của nấm mốc...................................................................... 5
1.1.2. Tổng quan về nấm men...............................................................................6
1.1.2.1. Đ c điểm hình thái và cấu tạo tế bào của nấm men.........................6
1.1.2.2. Sinh trưởng và dinh dưỡng của nấm men........................................ 7
1.1.2.3. Sinh sản của nấm men...................................................................... 7
1.1.3. Khả năng sinh các hoạt chất sinh học của vi nấm...................................... 8
1.2. Tổng quan về enzyme cellulase............................................................................ 9
1.2.1. Gi i thiệu về enzyme cellulase................................................................... 9
1.2.2. Đ c điểm và cơ chế tác dụng của enzyme cellulase.................................10
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme cellulase...........................11
1.2.3.1. Nồng độ enzyme.............................................................................11
1.2.3.2. Nồng độ cơ chất..............................................................................11
1.2.3.3. Nhiệt độ.......................................................................................... 12
III


1.2.3.4. pH....................................................................................................13
1.2.3.5. Ion kim loại.....................................................................................13

1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme cellulase............................................................ 14
1.2.4.1. Thực vật và động vật...................................................................... 14
1.2.4.2. Vi sinh vật.......................................................................................14
1.2.5. Một số ứng dụng của cellulase hiện nay...................................................16
1.2.5.1. Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi.................................................. 16
1.2.5.2. Trong công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học........................... 17
1.2.5.3. Trong kỹ thuật di truyền.................................................................17
1.2.5.4. Trong x l môi trường.................................................................. 17
1.2.6. Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase từ vi sinh vật biển.....................17
1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase trên thế gi i....................18
1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase ở Việt Nam.....................20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP....................................................... 21
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu......................................................... 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 21
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 21
2.2. Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng.........................................................................21
2.3. Hóa chất............................................................................................................... 22
2.4. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu......................................................................... 26
2.5. Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu................................................... 26
2.5.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme CMCase của chủng VN15M.......................................... 26

IV


2.5.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme CMCase của chủng VN15M.......................................... 27
2.5.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh
tổng hợp enzyme CMCase của chủng VN15M..................................................28
2.5.4. Phương pháp hoạt hóa, nuôi cấy và bảo quản các chủng vi nấm.............30

2.5.4.1. Hoạt hóa các chủng vi nấm............................................................ 30
2.5.4.2. Nuôi l ng các chủng vi nấm thu dịch enzyme thô.........................30
2.5.4.3. Bảo quản các chủng vi nấm............................................................30
2.5.5. Phương pháp xác định vòng phân giải cơ chất.........................................30
2.5.6. Nhuộm đơn và quan sát hình thái tế bào vi nấm...................................... 31
2.5.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme CMCase.....................................31
2.5.8. Phương pháp x lí số liệu......................................................................... 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................35
3.1. Sàng lọc hoạt tính CMCase của các chủng vi nấm biển.....................................35
3.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi nấm có hoạt tính CMCase mạnh.......37
3.3. Xác định hoạt độ của chủng có hoạt tính CMCase mạnh...................................39
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp CMCase
của chủng VN15M......................................................................................................40
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình sinh tổng hợp CMCase
của chủng VN15M......................................................................................................42
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp CMCase của
chủng VN15M............................................................................................................ 44
3.7. So sánh hoạt độ CMCase của chủng VN15M v i enzyme của vi khuẩn và
enzyme thương mại.................................................................................................... 46

V


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 50
PHỤ LỤC........................................................................................................................

VI

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hệ sợi nấm mốc có và không có vách ngăn.............................................. 4
Hình 1.2. Các hình thái tế bào khác nhau của Candida albicans..............................6
Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose bởi hệ enzyme cellulase.............................. 10
Hình 1.4. Trichoderma sp. được dùng cho sản xuất cellulase thương mại.............15
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu...................................................... 26
Hình 2.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy của chủng VN15M..27
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon của chủng VN15M...... 28
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ của chủng VN15M........... 29
Hình 2.5. Phản ứng của thuốc th DNS...................................................................32
Hình 3.1. Kết quả vòng phân giải cơ chất của 3 chủng VN15M, DW7M, HMB7M
.................................................................................................................................. 37
Hình 3.2. Đ c điểm hình thái khuẩn lạc và sợi nấm chủng VN15M .................... 37
Hình 3.3. Đ c điểm hình thái khuẩn lạc và sợi nấm chủng DW7M....................... 38
Hình 3.4. Đ c điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào nấm men HMB7Y....................39
Hình 3.5. Hoạt độ CMCase của 3 chủng vi nấm đã qua sàng lọc........................... 40
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng phân giải cơ chất CMC
của chủng VN15M................................................................................................... 41
Hình 3.7. Khảo sát tối ưu nhiệt độ nuôi cấy của chủng VN15M............................ 42
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng phân giải cơ chất CMC của
chủng VN15M.......................................................................................................... 43
Hình 3.9. Khảo sát tối ưu nguồn cacbon của chủng VN15M................................. 43
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng phân giải cơ chất CMC
của chủng VN15M................................................................................................... 45
VII


Hình 3.11. Khảo sát tối ưu nguồn nitơ vô cơ của chủng VN15M.......................... 45
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng phân giải cơ chất CMC
của chủng VN15M................................................................................................... 46

Hình 3.13. Khảo sát tối ưu nguồn nitơ hữu cơ của chủng VN15M........................ 46
Hình 3.14. Vòng phân giải cơ chất CMC của chủng VN15M, HCR1 và enzyme
LEAFCELL.............................................................................................................. 47
Hình 3.15. Hoạt độ CMCase của VN15M, HCR1 và enzyme LEAFCELL...........47

VIII


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần môi trường PDA.................................................................. 22
Bảng 2.2. Thành phần môi trường YPD.................................................................. 22
Bảng 2.3. Thành phần môi trường sàng lọc hoạt tính CMCase.............................. 23
Bảng 2.4. Thành phần môi trường l ng thu CMCase..............................................23
Bảng 2.5. Dựng đường chuẩn glucose..................................................................... 29
Bảng 2.6. Các bư c xác định hoạt độ enzyme CMCase theo phương pháp DNS......
.................................................................................................................................. 30
Bảng 3.1. Hoạt tính carboxymethyl cellulase ngoại bào của các chủng vi nấm.........
.................................................................................................................................. 35

IX


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

Ghi chú

1

PDA

Potato Dextrose Agar

Môi trường nuôi cấy
nấm mốc

2
3

YPD
DNS

Yeast Extract Peptone

Môi trường nuôi cấy

Dextrose

nấm men

Axit dinitrosalicylic

Thuốc th dùng cho
xác định hoạt độ
enzyme cellulase

4

CMCase

Carboxymethyl cellulase

1 loại enzyme trong
phức hệ enzyme
cellulase

5

IU/ml

International

Đơn vị đo hoạt độ

units/mililiter

enzyme trong một
mililit

6

VK

Vi khuẩn

7

TM

Thương mại

8

CNM

Cao nấm men

9

ĐC

Đối chứng

10

TN

Thí nghiệm

11

TB

Trung bình

12

CMC

Carboxymethyl cellulose

13

FPase

Filter paper activity

X


PHẦN MỞ ĐẦU
 Tính cấp thiết của đồ án
Hệ enzyme cellulase là một trong số các enzyme được s dụng rộng rãi nhất
hiện nay trên thế gi i. Theo Bhat (2000), hỗn hợp các enzyme cellulase,
hemicellulase và pectinase chiếm gần 20% trong tổng số 1 tỷ USD thu được từ
lượng enzyme công nghiệp được bán ra trên toàn thế gi i. Enzyme cellulase được
ứng dụng khá rộng rãi trong hầu hết các ngành công nghiệp đ c biệt là trong ngành
công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và x l ô nhiễm môi trường…
Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1
(exo-1,4-β-D-glucanase), Cx (endo-1,4-β-D-glucanase) và β-glucosidase (Coral và
cộng sự, 2002; Henning và cộng sự, 2005).
Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu trên thế gi i về cellulase ngoại bào
được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật được tiến hành. Những lợi thế chính của
việc s dụng vi sinh vật để sản xuất cellulase là khả năng sản xuất hàng loạt và thao
tác dễ dàng hơn để thu được các enzyme có đ c tính mong muốn. Trong đó
cellulase có nguồn gốc từ vi nấm ổn định hơn so v i các enzyme vi khuẩn trên quy

mô thương mại (Abu và cộng sự, 2005). Đ c biệt hơn, các loại enzyme được sản
xuất từ vi sinh vật biển thể hiện các đ c tính ưu việt hơn so v i enzyme tương ứng
được sản xuất từ các loài vi sinh vật trên đất liền như khả năng chịu m n, chịu nhiệt,
chịu kiềm….
Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu về cellulase được sản xuất
từ vi sinh vật biển rất ít và chưa được khai thác triệt để. Vì vậy, chúng tôi quyết
định lựa chọn đề tài: “Sàng lọc hoạt tính enzyme cellulase của vi nấm phân lập
từ mẫu nước biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa”, nhằm lựa chọn được chủng có
khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào v i những đ c tính ưu việt nhằm góp
phần làm phong phú và đa dạng hơn nguồn enzyme của nư c nhà, đồng thời có
tiềm năng ứng dụng vào các ngành công nghiệp khác nhau.
 Mục tiêu đề tài

1


Sàng lọc hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ngoại bào của
các chủng vi nấm phân lập từ các mẫu nư c biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa.
Chọn chủng vi nấm có hoạt tính CMCase mạnh nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, nguồn cacbon, nguồn nitơ trong môi trường
nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme carboxymethyl cellulase của chủng vi
nấm đã lựa chọn.
 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đồ án
Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase của loài vi nấm biển Việt
Nam.
Góp phần cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của thành phần môi trường
và điều kiện nuôi đến hoạt tính sinh tổng hợp enzyme cellulase của vi nấm biển.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần tìm ra chủng vi nấm sản sinh enzyme cellulase có

tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM BIỂN
Gi i Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn, dị
dưỡng, là một trong 5 gi i chính trong hệ thống phân loại sinh học hiện nay. Những
đại diện tiêu biểu của gi i nấm là nấm mốc, nấm men và nấm l n (nấm quả thể).
Ư c tính có khoảng 3 – 4 triệu loài nấm, nhưng chỉ có chưa đến 150.000 loài đã
được phân loại và nghiên cứu (John, 2019).
Theo Willis (2018), gi i Nấm được phân loại thành 8 ngành:
















Ascomycota (90.000 loài).
Basidiomycota (50.000 loài).
Microsporidia

(1.250 loài).

Chytridiomycota (980 loài).
Zoopagocomyta (900 loài).
Mucoromycota (760 loài).
Blastocladiomycota (220 loài).
Cryptomycota (30 loài).
Vi nấm biển bao gồm các loài vi nấm sinh sống và phát triển trong môi trường

biển ho c được trôi dạt từ đất liền ra biển. Chúng phân bố ở kh p mọi nơi trong đại
dương như bám trên các sinh vật phù du, r ng san hô hay tồn tại ở nư c biển sâu,
nư c biển ven bờ, trầm tích,… Theo ư c tính có khoảng 10.000 loài vi nấm biển,
trong đó chỉ có 1.112 loài được phân loại và mô tả (Jones, 2015).
1.1.1. Tổng quan về nấm mốc
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm mốc
Đa số nấm mốc có dạng sợi, chúng thường phát triển trên bề m t cơ chất tạo
thành các dạng như lông tơ, mạng nhện ho c sợi bông. Sợi nấm có đường kính từ
3 – 5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí là 1 mm, chiều dài có thể lên đến vài chục cm.
Trên môi trường đ c và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào t nấm, tế bào nấm
ho c một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất
định gọi là khuẩn lạc nấm (Nguyễn Văn Bá, 2005). Phần l n sợi nấm có dạng trong
3


suốt, ở một số nấm sợi mang s c tố tạo nên màu tối hay màu s c sỡ. S c tố của một
số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm thay đổi khu vực có nấm phát triển. Một

số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề m t khuẩn lạc
(Nguyễn Lân D ng và cộng sự, 1997).
Dựa vào cấu tạo, nấm mốc được chia làm 2 loại chính (Nguyễn Thị Khả,
2015):


Nấm mốc có vách ngăn: phần l n hệ sợi nấm có vách ngăn, mỗi một khoang là
một tế bào riêng biệt, vì vậy, chúng là những sinh vật có cấu tạo đa bào. Ví dụ:
Penicillium sp., Aspergillus sp.,…



Nấm mốc không có vách ngăn: ở một số nấm mốc hệ sợi không có vách ngăn,
toàn bộ khuẩn ty coi như một tế bào. Đó là loại đơn bào. Ví dụ: Mucor sp.,
Rhizopus sp.,…
TẾ BÀO NẤM MỐC

Vách ngăn
Nhân

Hệ sợi có
vách ngăn

Sợi nấm
Hệ sợi không vách
ngăn

Hình 1.1. Hệ sợi nấm mốc có và không có vách ngăn [66]
Thành tế bào của nấm mốc được cấu tạo bởi những sợi chitin có đường kính
khoảng từ 15 – 25 nm, ngoài ra thành tế bào của nấm mốc còn có thể g p chitosan

và cellulose. Ngoài chitin và chitosan người ta còn g p glucan và galactan (nằm xen
giữa các sợi chitin và chitosan) và các loại enzyme khác nhau (Lê Xuân Phương,
2001).
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ hổng,
trong nhân có hạch nhân. Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn của sợi nấm.
Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1 – 2 nhân (Nguyễn Lân D ng và
4


cộng sự, 1997). Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục v i màng đôi
phospholipid và protein dày 0,02 µm, bên trong màng nhân chứa RNA và DNA
(Nguyễn Văn Bá, 2005).
Trong tế bào nấm còn có các cơ quan t giống như trong tế bào các sinh vật
nhân thực khác, đó là ty thể, mạng lư i nội chất, không bào, ribosome, bộ máy
golgi…
1.1.1.2. Sinh trưởng và dinh dưỡng của nấm mốc
Phần l n các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng.
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22 – 27oC và nhiệt
độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35 – 40oC, cá biệt có một số loài có thể
sống sót ở 0oC và 60oC. Bên cạnh đó, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường
acid (pH = 6) nhưng pH tối ưu là 5 – 6,5. Các nguồn thức ăn đơn giản như glucose,
muối amonium...sẽ được nấm hấp thu dễ dàng. Đối v i các nguồn thức ăn khó hấp
thu, nấm mốc sẽ tiết ra enzyme thích hợp để phân c t nguồn thức ăn thành các hợp
chất đơn giản để dễ hấp thu vào tế bào (Nguyễn Văn Bá, 2005).
1.1.1.3. Sinh sản của nấm mốc
Nấm mốc có 2 hình thức sinh sản là: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính: là hình thức sinh sản chủ yếu ở nấm mốc bằng cách hình
thành bào t mà không qua giảm phân như bào t đính, bào t kín hay bào t đốt.
Bào t rất nh , nhẹ và số lượng cực l n, chẳng hạn, chỉ trên một hạt lúa mạch bị
mốc sau một tuần người ta đã đếm được 120 triệu bào t . Tuy nh như vậy nhưng

bào t lại có màng bao bọc có cấu tạo đ c biệt, khiến chúng có thể chịu được điều
kiện khô hạn, nóng ho c lạnh đ c biệt qua nhiều tháng, thậm chí nhiều năm mà vẫn
giữ khả năng sinh tồn. Vì rất nhiều và nhẹ như vậy nên chỉ một làn gió hết sức nhẹ
c ng đủ cuốn theo hàng triệu bào t nấm phát tán đi kh p nơi, sẵn sàng rơi xuống
và phát triển nếu g p điều kiện thuận lợi (Đ ng V Hồng Miên, 2015).
Sinh sản hữu tính: là hình thức sinh sản xảy ra khi có sự kết hợp giữa giao t
đực và giao t cái thông qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải

5


qua 3 giai đoạn: tiếp hợp tế bào chất, tiếp hợp nhân và giảm phân (Nguyễn Văn Bá,
2005).
1.1.2. Tổng quan về nấm men
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo tế bào của nấm men
Nấm men có cấu tạo đơn bào, hình thái thay đổi tùy thuộc từng loại, điều kiện
nuôi cấy và giai đoạn phát triển của tế bào. Do đó nấm men có hình thái rất đa dạng:
hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình bầu dục, hình tròn… Một số nấm men có tế
bào hình dài nối tiếp nhau thành những sợi nấm gọi là khuẩn ty ho c khuẩn ty giả.
Kích thư c tế bào nấm men thay đổi nhiều phụ thuộc vào từng giống, từng loài,
trung bình khoảng 3 – 5 x 5 – 10 µm.
Tế bào giống nấm men

Khuẩn ty giả
Bào t chồi

Bào t vách dày

Hình 1.2. Các hình thái tế bào khác nhau của Candida albicans [67]
Thành tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền ch c cao, có chiều dày là

1,5 – 2,5 µm. Khi còn non, v tế bào nấm men tương đối m ng, tùy theo thời gian
nuôi dưỡng mà v tế bào dày lên. Thành phần hóa học chủ yếu của v tế bào là
glucan và mannan. Thành phần còn lại là protein, một ít lipid, polyphosphate,
6


enzyme, s c tố, đ c biệt v tế bào còn chứa chất chitin. Nhiệm vụ của thành tế bào
là bảo vệ tế bào trư c các tác động bên ngoài, khống chế các quá trình trao đổi chất
và áp suất thẩm thấu ở trong tế bào.
Màng sinh chất có chiều dày khoảng 7 – 8 µm cấu tạo chủ yếu là protein,
chiếm 50% khối lượng khô của tế bào, còn lại là lipid 40% và một ít polysaccharid.
Nhân tế bào có hình dạng cầu ho c oval và được bao bọc bởi một l p màng,
bên trong có dịch nhân. Trong đó có một thể r n gọi là hạch nhân hay nhân con.
Kích thư c của nhân tế bào thường bằng 1 – 3 µm. Trên bề m t của màng nhân có
các hạt riboxom. Trong nhân có chứa DNA, RNA, nucleprotein và các gen, do đó
nhân đóng vai trò quan trọng trong sinh sản di truyền các tính trạng cho thế hệ sau
(Nguyễn Thị Khả, 2015).
1.1.2.2. Sinh trưởng và dinh dưỡng của nấm men
Nấm men có hai hình thức dinh dưỡng chính là dinh dưỡng nội bào và ngoại
bào. Hầu hết các loài nấm men đều s dụng các nguồn C, N, P, S... và các nguyên
tố kim loại khác để tham gia vào chu trình Krebs, tổng hợp các protein, tham gia
vào quá trình hô hấp, lên men c ng như các quá trình trao đổi chất khác trong cơ thể
(Lương Đức Phẩm, 2005).
1.1.2.3. Sinh sản của nấm men
Nấm men có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu
tính. Tùy thuộc điều kiện nuôi cấy mà tế bào nấm men có thể sinh sản theo một
trong hai hình thức trên. Quá trình sinh sản vô tính và hữu tính xảy ra luân phiên
trong vòng đời của nấm men.
 Sinh sản vô tính
Nảy chồi là hình thức sinh sản chủ yếu của nấm men. Khi nấm men trưởng

thành sẽ nảy ra một chồi nh , chồi l n dần lên, một phần nhân của tế bào mẹ được
chuyển sang chồi, sau đó tách ra thành một nhân m i, rồi hình thành vách ngăn để
ngăn cách v i tế bào mẹ, tạo nên một tế bào m i. Tế bào con được tạo thành có thể
tách kh i tế bào mẹ hoạt dính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào m i. Một số
ít nấm men có khả năng sinh sản bằng cách phân chia tế bào giống như vi khuẩn, tế
7


bào dài ra sau đó sinh ra những vách ngăn đ c biệt và phân chia thành hai hay nhiều
tế bào (Nguyễn Thị Khả, 2015).
 Sinh sản hữu tính
Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng túi hay nang bào t , trong mỗi túi có 1
ho c nhiều bào t . Túi bào t được sinh ra do sự tiếp hợp của 2 tế bào nấm men.
Khi 2 tế bào khác gi i đứng gần nhau, ở mỗi đầu của 2 tế bào sẽ mọc ra mấu lồi và
tiến sát vào nhau, 2 tế bào sẽ tiếp hợp v i nhau và hình thành 1 hợp t , sau đó sẽ có
quá trình phối nguyên sinh chất và phối nhân. Nhân của hợp t phân chia thành 2
ho c 4 ho c 8 nhân m i, mỗi nhân con cùng v i nguyên sinh chất tạo thành 1 bào t .
Bào t

g p điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men m i

(Nguyễn Thị Khả, 2015).
1.1.3. Khả năng sinh các hoạt chất sinh học của vi nấm biển
Hiện nay, vi nấm biển thu hút nhiều sự quan tâm từ các nhà khoa học, bởi đây
là nguồn vô giá để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh, kháng vi
rút, kháng nấm, chất chống u, chống viêm…
1.1.3.1. Hoạt tính sinh enzyme thủy phân ngoại bào
Vi nấm có tiềm năng l n v i khả năng sinh các enzyme ngoại bào mạnh, phân
giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Đ c biệt,
enzyme được sản xuất từ vi nấm biển mang những đ c tính vượt trội so v i các

enzyme tương đồng được phân lập từ vi nấm ở đất liền như: khả năng chịu nhiệt,
chịu lạnh, chịu kiềm, chịu acid…Một số enzyme đã được tinh sạch, nghiên cứu và
ứng dụng phổ biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase
(Sawathi, 2013).
1.1.3.2. Khả năng sinh chất kháng sinh, kháng khuẩn
Hiện nay, nhu cầu s dụng kháng sinh đang dần trở nên phổ biến, do đó việc
tìm ra các nguồn sản xuất kháng sinh c ng như các loại kháng sinh m i đang được
nghiên cứu mở rộng. Đ c biệt, các nhà khoa học đã nghiên cứu các chất kháng sinh
m i có nguồn gốc từ vi nấm biển như: (+)-terrein được sản xuất từ chủng
Aspergillus terreus PF-26, phân lập từ bọt biển, có khả năng kháng vi khuẩn
8


Bacillus subtilis; 15G265α được phân lập từ chủng Hypoxylon oceanicum
LL-15G256, phân lập từ cây đư c, có khả năng kháng Staphyloccocus epidermidis,
Xanthomonas campestris, Propionibacterium acnes; enniatins được sản xuất từ
Halosarpheia sp., phân lập từ cây đư c, có khả năng kháng Escherichia coli,
Enterococcus

faecium,

Salmonella

enteria,

Shigella

dysenteriae,

Listeria

monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfiringens, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus (Johanna, 2016).
1.1.3.3. Khả năng sinh các acid hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng
Ngày nay, nhu cầu s dụng acid hữu cơ ngày càng nhiều. Các acid hữu cơ như
acid acetic, acid lactic và một số acid hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công
nghệ chế biến mủ cao su, trong thực phẩm và cả trong y học.
Belén và cộng sự (2010) đã nghiên cứu rằng đa số các chủng vi khuẩn đều có
khả năng sản xuất acid citric, tuy nhiên chỉ một vài chủng nấm mốc đột biến như
Aspergillus niger hay Aspergillus wentii m i được s dụng cho mục đích sản xuất
acid citric ở quy mô thương mại. Ramesh (2011), đã nghiên cứu sản xuất acid citric
từ chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập từ tảo đ Gelidiella acerosa. Trong
công nghiệp thực phẩm và sản xuất đồ uống, acid citric đóng vai trò như một chất
chống oxy hóa giúp bảo quản, tăng mùi vị cho sản phẩm. Trong công nghiệp dược
phẩm, acid citric được s dụng như chất chống oxy hóa giúp bảo quản vitamin, tăng
khả năng sủi bọt của các loại thuốc sủi, hiệu chỉnh pH hay để bảo quản và chống
đông máu (Belén và cộng sự, 2010).
1.2.

TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE

1.2.1. Giới thiệu về enzyme cellulase
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng c t mối liên kết β-1,4-O
glucoside trong phân t cellulose và một số cơ chất tương tự khác.
1.2.2. Đặc điểm và cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Dựa vào vị trí xúc tác của enzyme, cellulase được chia thành 3 loại chính.


Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4) được gọi v i nhiều tên gọi khác nhau như
endoglucanase, carboxymethyl cellulase, enzyme này tác động ngẫu nhiên lên

9


cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) tại vị trí liên kết 1,4-β-glucan. Ngoài ra,
enzyme này có khả năng phân giải cellodextrin (sản phẩm trung gian của quá
trình thủy phân cellulose) thành cellobiose và glucose. Enzyme này không có
khả năng phân giải cellulose tinh thể như bông hay avicel.


Exo-1,4-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91) hay còn được gọi là exoglucanase,
cellobiohydrolase. Enzyme này tấn công chuỗi cellulose từ đầu không kh và
giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân giải
cellulose dạng hòa tan như carboxymethyl cellulose và hydroxyethyl cellulose.



β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21): enzyme này hoàn thành quá trình thủy phân
cellulose bằng cách phân giải cellobiose và giải phóng glucose (Sajith và cộng
sự, 2016).
Cơ chế quá trình thủy phân cơ chất cellulose bởi hệ enzyme cellulase được thể

hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose bởi hệ enzyme cellulase (Sajith và cộng sự, 2016)
10


1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme cellulase
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ enzyme,
nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH,… Đ c biệt, các yếu tố hóa l không chỉ ảnh hưởng

đến phản ứng enzyme theo kiểu giống như các phản ứng hóa học thông thường mà
còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme thông qua tác dụng của chúng đối v i
cấu trúc phân t enzyme (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 2002).
1.2.3.1. Nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc tuyến tính
vào nồng độ enzyme:
v

v = k[E]
: vận tốc phản ứng

[E] : nồng độ enzyme
C ng có trường hợp nồng độ enzyme quá l n, vận tốc phản ứng tăng chậm.
1.2.3.2. Nồng độ cơ chất
Đối v i trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất S, enzyme E
xúc tác cho sự chuyển hóa và chỉ tạo thành một sản phẩm P, phản ứng xảy ra như
sau:

k2
k-2

k1
k-1

E + S → ES → P + E (1)

Trong đó k1, k-1, k2, k-2 là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES, v-1 là vận tốc của phản ứng
tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S, v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E
và P (sản phẩm).

v1 = k1[E][S]
v-1 = k-1[ES]
v2 = k2[ES]
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]
(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2)
Gọi E0 là nồng độ ban đầu:
[E0]=[E]+[ES] → [E]=[E0]-[ES] (3)
11


Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:
(k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES])[S]
[ES] 

k1[E0][S]
k  1  k2  k1[S]

Nếu đ t Km= k-1+k2/k1 (Km: gọi là hằng số Michalis Menten)
Ta có: [ES] = [E0][S]/Km+[S]. M t khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:
V = k2[ES]
Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:
v

k2[E0][S]
(4)
Km  [S]

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng l n.
Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết v i cơ chất, nghĩa là:

Vmax= k2[E0]
Thay vào phương trình (4) ta được:
v  v max

[S ]
(5)
Km  [ S ]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten Km gọi là hằng số Michelis
Menten đ c trưng cho mỗi enzyme. Km đ c trưng cho ái lực của enzyme v i cơ chất,
Km có trị số càng nh thì ái lực của enzyme v i cơ chất càng l n, nghĩa là vận tốc
của phản ứng do enzyme xúc tác càng l n.
Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị
vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S].
Khi Km = [S] thì v0 =

1
v max (Lê Ngọc Tú, 2002).
2

1.2.3.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất l n đến phản ứng enzyme. C ng như các phản ứng
thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do
enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền v i nhiệt độ, vì vậy tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào c ng tỷ lệ thuận v i nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản

12


ứng chỉ tăng đến một gi i hạn nhất định. Vượt qua gi i hạn đó, tốc độ phản ứng

enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu.
Đối v i enzyme cellulase, tùy vào nguồn sản xuất cellulase mà nhiệt độ tối ưu
sẽ khác nhau. Như enzyme endoglucanase được sản xuất từ Streptomyces sp. cho
thấy nhiệt độ tối ưu cho phản ứng enzyme là ở 50 – 60oC, và ở 70oC hoạt tính
enzyme giảm còn 70% (Li và cộng sự, 1998). Enzyme cellulase được sản xuất từ
chủng Aspergillus terreus cho thấy nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng từ 40 – 60oC
và đạt hoạt tính cao nhất ở 50oC; ở 80oC trở lên và dư i 20oC hoạt tính enzyme mất
đi gần như hoàn toàn (95 – 100%) (Rasha và cộng sự, 2011). Đối v i một số chủng
như Aspergillus aureoles, Aspergillus clavatus, Trichoderma viridie hay Morchella
viridie, nhiệt độ tối ưu cho phản ứng enzyme nằm trong khoảng từ 40 – 50oC
(Cavazzoni và Manzoni, 1994; Mishra, 1988; Ogawa, 1989).
1.2.3.4. pH
Enzyme rất nhạy cảm đối v i sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ
hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối thích. pH môi trường thường
ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đ c biệt là ảnh hưởng đến độ
bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất l n đến phản ứng enzyme.
Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều
enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, c ng có nhiều enzyme hoạt
động ở pH acid yếu. Theo Rasha và cộng sự (2011), enzyme cellulase được sản xuất
từ Aspergillus terreus có hoạt tính ổn định khi pH nằm trong khoảng từ 5 – 6 (ổn
định 100%). Han và Srinivasan (1969), đã tìm thấy cellulase từ Alcaligenes faecalis
có pH tối ưu nằm trong khoảng 6,5 – 7,8; trong khi Ani (2005) lại tìm thấy pH tối
ưu cho hoạt tính cellulase của Aspergillus spp. là nằm trong khoảng từ 5,0 – 7,0.
1.2.3.5. Ion kim loại
Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme. Các ion kim loại n ng,
ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme.
Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt
hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một gi i hạn
13