Nghiên cứu khả năng kích thích sinh cytokines của protein tái tổ hợp Interleukin-2 trên tế bào đại thực bào

Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 6: 434-444

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(6): 434-444
www.vnua.edu.vn

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH CYTOKINES
CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP INTERLEUKIN-2 TRÊN TẾ BÀO ĐẠI THỰC BÀO
Trương Anh Đức1*, Trần Thị Thanh Hà1, Nguyễn Thị Huyền1, Chu Thị Như1,
Nguyễn Thị Chinh1, Hoàng Văn Tuấn1, Lý Đức Việt1, Đặng Vũ Hoàng1, Yeong Ho Hong2
1

Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y Quốc gia
Khoa Công nghệ sinh học động vật, Trường Đại học Chung Ang, Anseong, Hàn Quốc

2

*

Tác giả liên hệ:
Ngày chấp nhận đăng: 16.06.2020

Ngày nhận bài: 20.11.2019
TÓM TẮT

Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine đa chức năng, đóng vai trò điều hòa sự nhân lên, biệt hóa và điều hòa miễn
dịch của nhiều loại tế bào và vật chủ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ dòng hóa gene mã hóa cho IL-2 của gà,
biểu hiện protein tái tổ hợp IL-2 của gà và đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp IL-2 trên tế bào dòng đại
thực bào. Gen mã hóa cho protein IL-2 của gà (mã số AF000631 trên Ngân hàng gen quốc tế) được tái tổ hợp cùng
tín hiệu Trx-Tag thioredoxin với trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế EcoRI ở đầu 5' và HindIII ở đầu 3', được
đưa vào véc tơ tách dòng pCR2.1-TA. Sau đó toàn bộ đoạn DNA được chuyển vào vị trí EcoRI- HindIII của véc tơ
biểu hiện pET32a(+) để tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp của gen IL-2 trong vi khuẩn E. coli BL21. Kết quả cho

thấy đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp IL-2 của gà trên hệ thống E. coli. Protein IL-2 của gà tái tổ hợp không
sản sinh độc tố tế bào, có khả năng kích thích sự nhân lên và sinh trưởng của tế bào dòng đại thực bào của gà.
Protein IL-2 tái tổ hợp của gà kích thích tế bào dòng đại thực bảo sản sinh IFNγ, IL-1β và IL-6 mRNA. Kết quả
nghiên cứu cho thấy protein IL-2 tái tổ hợp của gà có hoạt tính sinh học tự nhiên, được nhận diện bởi kháng thể
kháng IL-2.
Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-2, gà, cytokines, protein tái tổ hợp.

Study on Expression of Chicken Interleukin 2 Recombinant Protein and its Modulate
Cytokines Production in Macrophage Cell Line
ABSTRACT
Interleukin-2 is a multifunctional cytokine, which modulates the proliferation and differentiation of various types of
cells and induces cytokines expression. In this study, chicken IL-2 will be cloned, expressed and its functional
characterization was evaluated in Macrophage (HD11) cell line. Genes coding for IL-2 (AF000631 from GenBank)
linked with Trx-Tag thioredoxin leader and restriction sequences of EcoRI (5’end), HindIII (3’end) were cloned and
then ligated into a cloning véc tơvector pCR2.1-TA. Chicken IL-2 gene was incorporated into pET32a(+) at restriction
sites for the expression of the IL-2 gene in E. coli BL21. Chicken IL-2 recombinant protein produced in E. coli system
showed that it did not produce cytotoxicity and enhanced the proliferation of macrophage (HD11) cell line and
induced IFNγ, IL-1β và and IL-6 mRNA expression. These results showed that recombinant chicken IL-2 protein
production in E. coli system was possessed natural biological properties and was recognized by specific antibodies
against IL-2.
Keywords: Escherichia coli, Interleukin-2, chicken, cytokines, recombinant protein.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Interleukin-2 (IL-2) được sân xuçt bởi các

434

đäi thực bào, các tế bào T lympho (CD4+ T, CD8+
T), tế bào Natural killer (NK) và tế bào đuôi gai
được kích hoät (Itoh & cs., 1985; Mamontov &

Trng Anh c, Trn Th Thanh H, Nguyn Th Huyn, Chu Th Nh,
Nguyn Th Chinh, Hong Vn Tun, Lý c Vit, ng V Hong, Yeong Ho Hong

cs., 2019; Reichert & cs., 1999). IL-2 ũng vai
trũ trong min dch v t min ca c th; kớch
thớch sõn xuỗt IFN-ó dộn n s bit húa ca
cỏc t bo T tr giỳp (T helper) tr thnh cỏc
t bo Th1, Th2, Th17 v kớch thớch sõn sinh
khỏng th ch ng. IL-2 c phỏt hin lổn
ổu trờn ngi nởm 1976, cũ chc nởng kớch
thớch s phõn chia t bo (mitose) ca T lympho
ngi v h tr cho s phỏt trin tip theo ca T
lympho trong nuụi cỗy trong phũng thớ nghim
(Kawano & Noma, 1996; Lauener & cs., 1995;
Morgan & cs., 1976; Toren & cs., 1995). S kin
phỏt hin ra IL-2 m lỳc ổu ngi ta gi l yu
t phỏt trin t bo T lympho (T cell growth
factor) l mt tin b bc ngot v min dch,
vỡ lổn ổu tiờn m ra nghiờn cu cỏc cỏ th ca
t bo T v vai trũ ca nú trong quan h vi t
bo B, ọi thc bo v t bo NK (Greene & cs.,
1986; Rey & cs., 1984). Nhiu nghiờn cu ó
chng minh, IL-2 c sõn xuỗt t t bo T
lympho khi cú kớch thớch ca khỏng nguyờn.
Tuy nhiờn, trong mt s iu kin nhỗt nh, t
bo B v NK cng sõn xuỗt IL-2, nhng lng
sõn xuỗt ra rỗt thỗp. Khi T lympho c kớch
thớch khoõng 4 gi sau cú th phỏt hin thỗy IL2 v ợnh cao l sau 12 gi (Mamontov & cs.,

2019; Piscitelli & Minor, 1995).
S hoọt ng ca IL-2 thụng qua h thng
IL-2 receptor complex bao gm 03 chui: IL-2R
(CD25), IL-2R (CD122) v IL-2R (CD132) v
iu khin min dch thụng qua mt s con
ng min dch chớnh (immune signaling
pathways) nh JAK-STAT, PI3K/Akt/mTOR v
MAPK/ERK, qua ũ kớch thớch t bo, c th sõn
sinh min dch ch ng, sõn xuỗt cỏc
lymphokin nh TNF, TNF, TGF, sõn xuỗt
cỏc yu t kớch thớch phỏt trin B lympho nh
IL-4, IL-6, cỏc yu t kớch thớch sinh mỏu nh
IL-3, IL-5, GM-CSF (Kampa & Burnside, 2002).
Hin nay, protein tỏi t hp IL-2 c s dng
nh mt loọi thuc lm chỗt dộn trong vic kớch
thớch min dch iu tr ung th, nh ung th t
bo thờn, melanoma, bnh phong, leukemia
dũng T lympho hoc lm tởng min dch ch
ng ca c th (McMillan & cs., 1995; Piscitelli

& Minor, 1995; Reichert & cs., 1999; Toren &
cs., 1995).
Trờn g, IL-2 lổn ổu tiờn c dũng húa v
xỏc nh chc nởng nởm 1997 (Sundick & GillDixon, 1997), vai trũ ca IL-2 trờn g cng
tng t trờn ng vờt nh tởng hoọt húa t
bo, kớch thớch s phỏt trin t bo lympho T, B
v kớch thớch vờt ch sõn sinh khỏng th ch
ng chng lọi cỏc tỏc nhõn gõy bnh nh bnh
Newcastle v cỳm gia cổm (Susta & cs., 2015;
Szatraj & cs., 2014). Trong nghiờn cu ny,

chỳng tụi s dũng húa gene mó húa cho IL-2 ca
g, biu hin protein tỏi t hp IL-2 ca g bỡng
h thng E. coli, ng thi kim tra tớnh c
cng nh khõ nởng kớch thớch sõn sinh mt s
cytokines ca protein IL-2 tỏi t hp trờn t bo
dủng ọi thc bo (HD11) ca g.

2. PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. Vt liu nghiờn cu
- Plasmid pCR2.1-TA do hóng Invitrogen
sõn xuỗt c s dng lm vộc t tỏch dủng
trong t bo E. coli TOP 10 (Invitrogen, Hoa
K). Plasmid pET32a(+) do hóng Novagen sõn
xuỗt c s dng lm vộc t biu hin protein
trong t bo E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen,
Hoa K).
- Enzyme họn ch EcoRI, HindIII, DNA
marker, protein thang chuốn, T4-DNA ligase,
Trizol tỏch chit RNA, mụi trng nuụi cỗy t
bo DMEM v IPTG ca hóng Invitrogen
(Hoa K).
- Kớt tỏch chit protein B-PER bacterial
protein extraction, ct sớc khớ Ni-NTA resin,
mng thốm tớch SnakeSkinTM dialysis tubing,
c chỗt phỏt trin mổu Western Lightning PlusECL, tng hp cDNA bỡng Maxima First Strand
cDNA Synthesis Kit ca hóng Thermo Science
(Hoa K).
- Cỏc húa chỗt, sinh phốm khỏc: khỏng th
His-Taq c gớn HPR (Abcam, Hoa K),
SYBRđ Green Master Mix (Roche, Hoa K),

QIAQuick gel extraction kit (QIAgen, c).

435


Nghiờn cu kh nng kớch thớch sinh cytokines ca protein tỏi t hp Interleukin-2 trờn t bo i thc bo

T bo dủng ọi thc bo HD11 v khỏng
th n dủng khỏng IL-2 (Mouse Anti-Chicken
IL-2) ca g c cung cỗp bi GS Yeong Ho
Hong, ọi hc Chung-Ang, Hn Quc.
2.2. Tỏch RNA tng s v sinh tng
hp cDNA
Mộu mụ lỏch ca g bõo quõn -80C c
lỗy ra, nghin trong Nit lúng cho mn, ng
nhỗt ri hũa vo dung dch Trizol (Invitrogen,
Hoa K). Tỏch chit RNA v tinh khit RNA
theo hng dộn ca nh sõn xuỗt. Tng hp
cDNA s dng 2àg RNA tng s v s dng kit
cDNA synthesis ca hóng Thermo Scientific,
Hoa K, theo hng dộn ca nh sõn xuỗt.
2.3. To dũng gen IL-2
Nhõn gen bng k thut PCR: s dng 2X
Dream Taq Polymeraze (Thermo Scientific, Hoa
K), vi cp mi c thit k da theo trỡnh t
ca gen IL-2 kớch thc 429bp (Bõng 1) ó c
ởng kớ trờn Ngồn hng D liu Gen quc t
NCBI vi s ởng kớ AF000631. Chu trỡnh nhit
ca k thuờt PCR: hn hp c bin tớnh
94C trong 5 phỳt, tip theo l 35 chu kỡ gm

94C: 30 giõy, 56C: 30 giõy, 72C: 30 giõy v
72C trong 10 phỳt. Sõn phốm PCR sau ũ c
chọy in di trờn thọch 1,5% agarose. Sõn phốm
PCR nhõn gen IL-2 ca g cũ kớch thc khoõng
429bp c tinh sọch bỡng QIAQuick gel
extraction kit (QIAgen, c), theo hng dộn
ca nh sõn xuỗt. Sõn phốm PCR sau khi tinh
sọch c s dng ngay cho phõn ng ni
ghộp gen.
Phõn ng ni ghộp gen vo vộc t tỏch dũng
pCR 2.1-TA: Sõn phốm PCR c gớn vo vộc t
tỏch dũng pCR 2.1-TA (Invitrogen, Hoa K) sau
ũ c bin nọp vo t bo khõ bin E. coli
(dũng TOP10) ca hóng Invitrogen (Hoa K) vi
mc ớch chn lc cỏc dũng t bo mang vộc t
tỏch dũng pCR2.1-TA c gớn thờm sõn phốm
PCR. Vộc t tỏi t hp c tỏch chit theo
phng phỏp ca Truong & cs. (2016) v c
s dng lm nguyờn liu c trỡnh t. Trỡnh
t DNA c tin hnh xỏc nh trờn mỏy c

436

trỡnh t t ng theo hng dộn ca nh sõn
xuỗt (Gentis, Vit Nam).
2.4. Biu hin gen IL-2 ca g trờn h
thng E. Coli
Gen IL-2 ca g trong vộc t tọo dũng
pCR2.1 c lỗy ra bỡng cỏch x lý plasmid
pCR-2.1 bỡng hai enzyme họn ch EcoRI v

HindIII, oọn DNA di khoõng 429bp cha gen
IL-2 ca g c thu lỗy sau khi chọy in di
sõn phốm cớt trờn gel agarose v tinh sọch bỡng
b kit Qiaquick Gel Extraction. oọn gen thu
c c ni vi vộc t pET32a(+) ó c x lý
trc ũ bỡng 2 enzyme họn ch trờn. Vộc t tỏi
t hp pET32a(+) cha gen mó húa cho protein
lai gia theriodoxin vi IL-2 (Trx-rchIL2) hoc
i chng vộc t pET32a(+) chợ cha theriodoxin
(Trx) c bin nọp vo t bo E. coli BL21
(DE3) v nuụi cỗy trong mụi trng LB cú b
sung Amp (nng cui cựng l 100 ỡg/ml)
37C. Khi giỏ tr OD600 ca dch nuụi cỗy ọt
0,5; IPTG c b sung vo dch nuụi cỗy t bo
vi nng cui cựng l 1mM. Cỏc mộu t bo
c thu sau 12 gi sau khi cõm ng bỡng IPTG
(Invitrogen) theo phng phỏp ca Truong &
cs. (2016).
2.5. Tinh khit IL-2 protein tỏi t hp
Thu vi khuốn bỡng cỏch ly tõm 3,500
vũng/phỳt trong 30 phỳt 4C. Phỏ v mng t
bo thu protein tng s bỡng cỏch s dng kit
B-PER bacterial protein extraction reagent
(Thermo Scientific). Tinh khit protein tỏi t
hp bỡng cỏch s dng ct sớc khớ Ni-NTA resin
(Thermo Scientific) theo hng dộn ca nh sõn
xuỗt. Loọi bú c t endotoxin bỡng cỏch s
dng khõ nởng cồn bỡng in tớch thụng qua cỏc
lổn ra bỡng cỏc dung dch ra cũ pH khỏc
nhau ó c mụ tõ trc ũ (Truong & cs.,

2016). Protein tỏi t hp c cụ c bỡng cỏch
s dng mng lc cú kớch c l mng lc 3kDa
(EMD Millipore). Protein tỏi t hp thu c
c i dung dch m bỡng PBS, pH7.2 s
dng SnakeSkinTM dialysis tubing (Thermo
Scientific) 4C qua ờm. Nng protein IL-2


Trng Anh c, Trn Th Thanh H, Nguyn Th Huyn, Chu Th Nh,
Nguyn Th Chinh, Hong Vn Tun, Lý c Vit, ng V Hong, Yeong Ho Hong

tỏi t hp c o v tớnh toỏn bỡng phng
phỏp Bradford.
2.6. Kim tra tớnh c hiu ca IL-2 bng
phng phỏp Western Blot
Protein IL-2 tỏi t hp sau khi tinh khit
c x lý bỡng m pha mộu cú 1% SDS v
bin tớnh trong 10 phỳt, ri chọy din di SDSPAGE. Cỏc bởng protein c quan sỏt sau khi
nhum Coomassie blue. Sau khi in di trờn gel
12,5% polyacrylamide, cỏc bởng protein c
chuyn sang mng PVDF. Cỏc v trớ khụng cú
protein trờn mng c ph sa loọi bộo qua
ờm. Tip theo mng c ph khỏng th HisTaq gớn HPR (Abcam, Hoa K) hoc khỏng th
n dủng IL-2 (Mouse Anti-Chicken IL-2)
v cui cựng Goat anti-Mouse IgG (H + L),
HRP (Abcam, Hoa K). Phõn ng hin mu
vi c chỗt Western Lightning Plus-ECL
(Thermo Scientific).
2.7. ỏnh giỏ tớnh c ca protein tỏi t
hp IL-2 trờn t bo dũng HD11

T bo dủng ọi thc bo (HD11) c cung
cỗp bi GS Yeong Ho Hong, ọi hc ChungAng, Hn Quc. T bo c nuụi trong mụi
trng Dulbeccos modified Eagles medium
(DMEM, Invitrogen) cú b sung thờm khỏng
sinh 100 IU/ml penicillin, 100 mg/ml
streptomycin v 10% huyt thanh bo thai bờ
sọch vụ trựng (FBS, Invitrogen) v nuụi cỗy
trong iu kin 5% CO2 41C. Protein tỏi t
hp c gõy nhim trờn t no HD11 mờt
nuụi cỗy 1,0 ì 106 t bo/ging trờn ùa t bo 6
ging nng 25, 50 v 100 ng/ml, t bo sau
gõy nhim c nuụi iu kin 5% CO2 41C.
Thu t bo sau gõy nhim sau 6, 12, 24 v 48
gi ỏnh giỏ c tớnh trờn t bo bỡng MTT
Cell Proliferation Assay Kit (Abcam, USA) theo
hng dộn ca nh sõn xuỗt.
2.8. ỏnh hot tớnh protein tỏi t hp IL-2
trờn t bo dũng HD11
Protein tỏi t hp c gõy nhim trờn t
no HD11 mờt nuụi cỗy 1,0 ì 106 t

bo/ging trờn ùa t bo 6 ging nng 25,
50 v 100 ng/ml, t bo sau gõy nhim c
nuụi iu kin 5% CO2 41C. Nng
protein IL-2 tỏi t hp c la chn da trờn
cỏc thớ nghim trc ồy ca chỳng tụi (pilot
experiment) ó cho thỗy khõ nởng kớch hoọt
mt s yu t kớch thớch min dch nh JAK1/2,
STAT1/3, ERK1/2 trờn t bo dủng ọi thc bo
v t bo dũng T lympho. Thu t bo sau gõy

nhim sau 6, 12, 24 v 48 gi ỏnh giỏ khõ
nởng kớch thớch sõn sinh ca cỏc cytokine gene
bỡng phng phỏp qRT-PCR.
2.9. Phng phỏp quantitative real-time
PCR (qRT-PCR) xỏc nh biu hin ca
cytokine gen
Thu thờp t bo HD11 sau gõy nhim, t
bo c ra qua PBS lọnh 2 lổn, tỏch chit
RNA tng s bỡng TRIzol (Invitrogen) theo
hng dộn ca nh sõn xuỗt. Tng hp cDNA,
tng s 2àg RNA c loọi bú DNA bỡng cỏch
thờm vo 1,0 n v (unit) DNase I v 1,0àL of
10 ì reaction buffer (Thermo Scientific), sau ũ
30 phỳt 37C. dng s hoọt ng ca
DNase I, b sung 1,0àL of 50mM EDTA vo
dung dch v un 65C trong 10 phỳt. S
dng sõn phốm ny tng hp cDNA bỡng
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit
(Thermo Scientific), theo hng dộn ca nh
sõn xuỗt.
ỏnh giỏ mc biu hin ca cỏc
cytokines, chỳng tụi thit k mi cho phõn ng
qRT-PCR s dng phổn mm Lasergene
(DNASTAR, Hoa K) (Bõng 1), v thc hin
phõn ng qRT-PCR bỡng cỏch s dng 2 ì
Power SYBRđ Green Master Mix (Roche, Hoa
K), theo hng dộn ca nh sõn xuỗt. Gene
GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase) trờn g c s dng l gene

i chng tiờu chuốn tớnh toỏn mc biu
hin ca cỏc gene thụng qua quỏ trỡnh tiờu
chuốn húa chỗt lng RNA. Mc biu hin
ca cỏc gene c tớnh toỏn bỡng phng phỏp
2Ct thụng qua mc biu hin ca gene i
chng GAPDH.

437


Nghiờn cu kh nng kớch thớch sinh cytokines ca protein tỏi t hp interleukin-2 trờn t bo i thc bo

Bõng 1. Cỏc cp mi trong phõn ng nhõn gen v realtime PCR
Gen
GAPDH

IL-2 cloning

IFN-

IL-6

IL-1

Trỡnh t cỏc cp mi (5-3)
F: mi xuụi; R: mi ngc

Mó s truy cp
trờn Genbank

Tham kho

F

TGCTGCCCAGAACATCATCC

NM_204305

Truong & cs., 2016

R

ACGGCAGGTCAGGTCAACAA

F

CGGAATTCATGATGTGCAAAGTACTGATCTT

AF033563

Nghiờn cu ny

R

CCAAGCTTTTTGCAGATATCTCACAAAG
HQ739082

Truong & cs., 2016

JQ897539

Truong & cs., 2016

NM_204524

Truong & cs., 2016

F/R

F

AGCTGACGACGGTGGACCTATTATT

R

GGCTTTGCGCTGGATTC

F

CAAGGTGACGGAGGAGGAC

R

TGGCGAGGAGGGATTTCT

F

TCGGGTTGGTTGGTGATG

R

TGGGCATCAAGGGCTACA

Hỡnh 1. (A) Sõn phm PCR nhõn gen IL-2, DNA chun 100bp;
ng chy 1, 2: Sõn phm PCR v (B) Kt quõ ct kim tra DNA cỏc plasmid bng
enzyme EcoR I v Hind III. M: DNA chun 100bp; ng chy 1, 2 l cỏc plasmid cha
gene IL-2 sau khi c x lý bng EcoR I v Hind III
2.9. X lý s liu
S liu c phõn tớch bỡng phng phỏp
One-way ANOVA. Cỏc giỏ tr trung bỡnh c
so sỏnh s khỏc bit bỡng phng phỏp Tukeys
multiple comparison test. Sai khỏc cũ ý nghùa
c xỏc nh vi P <0,05.

3. KT QU V THO LUN
3.1. Thit k Plasmid mang gen IL-2 ca g
biu hin trong E. coli
Gen IL-2 ca g cũ kớch thc khoõng

438

429bp c nhõn lờn bỡng k thuờt RT-PCR vi
cp mi c hiu v cỏc iu kin nh ó c
mụ tõ trong phổn phng phỏp. Kt quõ trờn
hỡnh 1A cho thỗy xuỗt hin mt bởng DNA cú
kớch thc khoõng 429bp tng ng vi kớch
thc ca oọn gen cổn nhõn theo thit k. Nh
vờy, sõn phốm PCR thu c l c hiu v cú
th s dng cho phõn ng ni ghộp gớn gen vo
vộc t tỏch dủng.

Sõn phốm PCR nhõn gen IL-2 c gớn vo
vộc t tỏch dũng pCR 2.1-TA (Invitrogen) v
c bin nọp vo t bo khõ bin E. coli
TOP10. Cỏc dũng t bo c chn lc theo


Trng Anh c, Trn Th Thanh H, Nguyn Th Huyn, Chu Th Nh,
Nguyn Th Chinh, Hong Vn Tun, Lý c Vit, ng V Hong, Yeong Ho Hong

hng dộn ca hóng Invitrogen. DNA plasmid
c tỏch chit v lm sọch theo Truong & cs.
(2016). xỏc nh s cú mt ca oọn gen mi
c chốn trong vộc t tỏch dủng pCR 2.1 TA,
DNA plasmid ca cỏc dũng t bo ny c tỏch
chit v x lý bỡng enzyme gii họn EcoR I v
Hind III. DNA plasmid ca cỏc dũng t bo chn
lc sau khi cớt bỡng enzyme EcoR I v Hind III
c kim tra bỡng in di trờn gel agarose 1%
(Hỡnh 1B). Kt quõ in di trờn Hỡnh 1B cho
thỗy cỏc plasmid trờn ng chọy 1 v 2 sau khi
cớt bỡng EcoR I v Hind III cũ vởng ra mt bởng
cũ kớch thc tng ng vi sõn phốm PCR
(429bp). Nh vờy, cỏc dủng plasmid ny ó c
gớn sõn phốm PCR.
3.2. Xỏc nh trỡnh t nucleotide ca
gen IL-2
khợng nh sõn phốm ó tỏch dủng l
oọn gen mó húa cho IL-2, chỳng tụi tin hnh
xỏc nh trỡnh t nucleotide bỡng phng phỏp
giõi trỡnh t gen theo hng dộn ca nh sõn

xuỗt (Gentis, Vit Nam). Trỡnh t nucleotide
IL-2 ca g tỏch dủng c so sỏnh vi trỡnh t
gen IL-2 ó ởng kớ trờn Ngồn hng D liu
Gen quc t NCBI vi s ởng ký l AF000631
v phõn tớch bỡng phổn mm DNA Star v
Clustal-X (Hỡnh 2). Kt quõ phõn tớch trờn hỡnh
2 cho thỗy, so vi gen IL-2 ca g ó c ởng
kớ trờn ngõn hng d liu gen quc t vi s
ởng kớ AAB63150 thỡ gen IL-2 ca g ó tỏch
dủng cũ tng ng 100%. T cỏc kt quõ ó
nhờn c, chỳng tụi rỳt ra mt s kt luờn sau:
ó tỏch dủng v xỏc nh trỡnh t oọn gen mó
húa cho IL-2 ca g cũ kớch thc 429bp (143
amino acid) t RNA tng s ca g bỡng k
thuờt RT-PCR. Kt quõ phõn tớch trỡnh t gen
cho thỗy khụng cú s thay i v amino acid so
vi trỡnh t AAB63150 ca gen IL-2 ca g ó
c ởng ký trong Genbank.
3.3. Thit k vộc
pET32a(+)/chIL-2

t

chuyn

gen

Nhng nghiờn cu gổn ồy ó chng minh
rỡng (Hoang & cs., 2017; Truong & cs., 2018),
biu hin protein ca mt s cytokine gene s

dng vộc t pET32a(+) trong t bo E. coli cho
hiu quõ cao v s lng v chỗt lng, c bit
l n giõn d ỏp dng. Gen IL-2 v pET32a sau
khi x lý vi EcoR I v Hind III c phõn tỏch
trờn gel agarose v c tinh sọch bỡng kớt ca
Qiagen. Cõ hai oọn DNA pET32a v IL-2 gii
họn bi EcoR I v Hind III cũ kớch thc lổn lt
l 6,24kb v 429bp u c cớt v tinh sọch
hiu quõ. oọn gen IL-2 lổn lt c ni vo
vộc t pET32a tọo thnh vộc t pET32a-IL2.
Chn 5 khuốn lọc dng tớnh v thc hin
phõn ng colony PCR vi cp mi c hiu
IL2_F v IL2_R, kt quõ th hin trờn hỡnh 3.
Trờn hỡnh 3 cho thỗy, cỏc ng chọy 1-5 u
xuỗt hin mt bởng cũ kớch thc khoõng 429bp
tng ng vi kớch thc gen IL2 ca g c
nhõn lờn bỡng cp mi c hiu IL2-F/R theo
tớnh toỏn lý thuyt. iu ny chng tú ó bin
nọp thnh cụng vộc t pET32a/chIL2 vo t bo
E. coli BL21 (DE3) chuốn b cho thớ nghim
tip theo.
S cú mt ca gen IL-2 trong vộc t biu
hin c kim tra bỡng chớnh cp enzyme họn
ch EcoR I v Hind III v giõi trỡnh t gen. Kt
quõ kim tra cho thỗy khụng cú s thay i no
trong trỡnh t ca gen IL-2 trong vộc t biu
hin v trỡnh t cỏc vựng ni gia gen Trx v
IL-2 cú cha cỏc im his-tag v im cớt cho
enterokinase u chớnh xỏc nh d tớnh (kt

quõ khụng trỡnh by).
3.4. Biu hin v tinh khit
pET32a(+)/chIL-2 tỏi t hp

protein

Theo tớnh toỏn, oọn gen chIL2 c gớn
vo vộc t biu hin pET32a tọi v trớ cớt ca
enzyme họn ch EcoR I v Hind III s tọo ra
protein lai gia protein Trx-Tag thioredoxin vi
protein tỏi t hp khi biu hin. Kt quõ nhum
Coomassie trờn hỡnh 4 cho thỗy sau cõm ng
bỡng IPTG, trc tinh khit xuỗt nhiu bởng
protein cũ kớch thc khỏc nhau v mt bởng
protein khỏc cũ kớch thc khoõng gổn 38,5kDa,
v sau tinh khit biu hin bỡng mt bởng
protein duy nhỗt cũ kớch thc khoõng 38,5kDa
tng ng vi kớch thc ca IL-2. Kt quõ ny
phự hp vi kớch thc protein ca IL-2 c

439


Nghiên cứu khả năng kích thích sinh cytokines của protein tái tổ hợp Interleukin-2 trên tế bào đại thực bào

biểu hiện trong hệ thống E. coli sử dụng véc tơ
pET32a(+), trong đò peptide tín hiệu Trx-Tag
thioredoxin cò kích thước khoâng 22,3kDa và
khối lượng phân tử của chIL2 protein tái tổ hợp
khoâng 16,2kDa. Hơn nữa, để khîng đðnh läi,

chúng tôi tiến hành phân ứng lai western blot
dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng
nguyên-kháng thể được thực hiện bìng việc sử
dụng 02 kháng thể đơn dñng anti-6x-histag và
anti-IL2.

Hình 2. Kết quâ so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự
trên Ngân hàng Dữ liệu Gen quốc tế NCBI với số đăng ký là AF000631

Ghi chú: M: thang DNA chuẩn; các giếng 1-5 là thứ tự khuẩn lạc, giếng số 7 là đối chứng âm.

Hình 3. Phổ điện di sân phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen chIL2F/R
trên khuôn plasmid pET32a(+) từ các khuẩn lạc lựa chọn

440


Nghiờn cu kh nng kớch thớch sinh cytokines ca protein tỏi t hp interleukin-2 trờn t bo i thc bo

Kt quõ trờn hỡnh 5 cho thỗy, ng chọy
protein s 2-6 khi dựng anti-6x-Histag antibody
xuỗt hin mt bởng mu ờm, rừ nột cú kớch
thc khoõng 38,5kDa, l kớch thc protein IL2 ca g dung hp vi polytag bao gm: Trx,
Thioredoxin, 6xHis-Tag v S-Tag ỳng nh
tớnh toỏn lý thuyt (Hỡnh 5A). Kt quõ phõn
ng lai western blot gia protein tỏi t hp IL-2
vi khỏng th n dủng c hiu khỏng IL-2 ca
g cho thỗy cũ bởng mổu xuỗt hin khoõng 38.5
kDa, ũ l bởng ca protein IL-2 dung hp vi

polytag (Hỡnh 5B).
Biu hin protein s dng vộc t pET32a(+)
trong t bo E. coli thng cho hiu suỗt biu
hin thỗp v khụng phõi tỗt cõ protein biu hin
u c tit vo khoang chu chỗt m cũn tỡm
thỗy trong mụi trng, trong t bo chỗt v
mng nguyờn sinh chỗt (Baneyx, 1999). Theo
Mergulhao & cs. (2005), kớch thc protein cú
th õnh hng n hiu quõ biu hin ca
protein ớch. Thnh phổn amino acid ca
polytag v protein ớch cng ũng vai trủ quan
trng. Tc vờn chuyn protein ngoọi lai ra
khoang t bo/chu chỗt cú th bớt ngun t khõ
nởng tit họn ch ca b mỏy vờn chuyn trong
E. coli. Khi khõ nởng ny b lỗn ỏt thỡ phổn ln
protein biu hin ra di dọng th vựi. Vỡ th
vic ti u mc biu hin l iu rỗt quan
trng. Trong nghiờn cu ny chỳng tụi ó ti u
hũa c iu kin biu hin ca protein IL-2
tỏi t hp s dng t bo E. coli theo nh mụ tõ

phổn phng phỏp nghiờn cu. Hm lng
protein IL-2 ca g tỏi t hp biu hin s dng
vộc t biu hin pET32a trong t bo E. coli
BL21 (DE3) thu c l trờn 2mg protein IL-2
tỏi t hp trờn tng s dung tớch nuụi biu hin
l 500ml. T kt quõ trờn cho thỗy chỳng tụi ó
thit k v biu hin thnh cụng protein tỏi t
hp Trx-chIL2 ca g trong t bo E. coli.
3.5. Kim tra tớnh c ca protein IL-2 tỏi

t hp trờn t bo dũng Macrophage
(HD11) ca g
Mt s nghiờn cu gổn ồy chng minh
rỡng (Gu & cs., 2010; Hilton & cs., 2002;
Reichert & cs., 2000), protein IL-2 tỏi t hp cú
khõ nởng kớch thớch s nhõn lờn phỏt trin ca
mt s dũng t bo nh t bo T, B v t bo ọi
thc bo. T kt quõ hỡnh 6 cho thỗy, nng
25 ng/ml v 50 ng/ml protein IL-2 tỏi t hp
trờn h thng E. coli, khụng kớch thớch s nhõn
lờn ca t bo ọi thc bo trong khoõng thi
gian nghiờn cu, trong khi ũ nng 100
ng/ml protein IL-2 tỏi t hp ca g cú khõ nởng
kớch thớch t bo ọi thc bo phỏt trin trong
vũng 48h so vi nhũm i chng khụng dựng v
chợ dựng protein Trx tỏi t hp. T kt quõ trờn
chỳng tụi cú th kt luờn rỡng protein IL-2 ca
g tỏi t hp trờn h thng E. coli khụng cũ c
tớnh hoc khụng õnh hng n s nhõn lờn v
phỏt trin ca t bo dũng.

Ghi chỳ: ng chy M: Protein chun; ng chy 1-6: Protein Trx-chIL2 c elution cỏc ln khỏc nhau.

Hỡnh 4. in di SDS-PAGE protein Trx-chIL2 trờn gel polyacrylamide 12,5% trc
v sau khi tinh sch

441


Nghiên cứu khả năng kích thích sinh cytokines của protein tái tổ hợp Interleukin-2 trên tế bào đại thực bào

Ghi chú: Đường chạy M: Protein chuẩn; Đường chạy 1-6: Protein Trx-chIL2 được elution ở các lần khác nhau.

Hình 5. Western blot với kháng thể kháng 6xHisTag (A) và kháng thể đơn dòng IL-2 (B)

Hình 6. Xác định độc tính của chIL-2 protein tái tổ hợp đến sự phát triển
của tế bào dòng Marcrophage (HD11) của gà
3.6. Kết quâ xác định khâ năng kích thích
tế bào dòng đại thực bào sân sinh cytokine
của protein IL-2 tái tổ hợp
Hình 7 cho thçy, IL-1β và IL-6 mRNA đã
tëng biểu hiện (P <0,05) sau 12 và 24 giờ gây
nhiễm protein IL-2 tái tổ hợp trên tế bào đäi
thực bào của gà ở câ 3 nồng độ 25, 50 và 100
ng/ml IL-2 protein và kéo dài đến 48 giờ gây
nhiễm, trong đò protein IL-2 tái tổ hợp với nồng
độ 100 ng/ml kích thích sân sinh IL-1β và IL-6

442

mRNA mänh nhçt (Hình 7). Trong khi đò,
protein IL-2 tái tổ hợp kích thích sân sinh INFγ
mRNA mänh nhçt, sau 12, 24 và 48 giờ gây
nhiễm với protein IL-2 tái tổ hợp ở nồng độ 100
ng/ml læn lượt là 9,23 ± 0,75, 23,12 ± 1,20 và
52,23 ± 2,23 với độ tin cêy P <0,05. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh rìng, IL-2 kích thích
sân sinh miễn dðch chủ động của gà cũng thông
qua việc kích thích và hoät hòa các con đường
miễn dðch (immune signaling pathway) như

JAK/STAT, MAPK, NF-B, Toll-Like Receptor,


Trương Anh Đức, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Chu Thị Như,
Nguyễn Thị Chinh, Hoàng Văn Tuấn, Lý Đức Việt, Đặng Vũ Hoàng, Yeong Ho Hong

TGFβ signaling pathway (Kampa & Burnside,
2002; Kawano & Noma, 1996; Piscitelli &
Minor, 1995). Nghiên cứu của chúng tôi đã
chứng minh rìng, protein IL-2 tái tổ hợp kích
thích sự sân sinh của một số pro-inflammatory
như IFN, IL-1β và IL-6 trên tế bào đäi thực
bào, điều đò chứng tó protein tái tổ hợp thông
qua hệ thống E. coli có hoät tính sinh học tự
nhiên của IL-2 trên gà.

4. KẾT LUẬN
Đã dñng hòa được gen IL-2 của gà, thiết kế
gín với tín hiệu tiết Trx và đưa vào véc tơ biểu
hiện pET32a(+) và biểu hiện thành công trong
tế bào E. coli BL21. Protein IL-2 tái tổ hợp täo
ra trên hệ thống E. coli không cò tính độc với tế
bào dòng, có hoät tính sinh học tự nhiên và có
khâ nëng kích thích tế bào dñng đäi thực bào
(HD11) sân sinh các pro-inflammatory như
INFγ, IL-1β và IL-6 mRNA.

LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát
triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.022019.01.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Baneyx F. (1999). Recombinant protein expression in
Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 10: 411421.
Greene WC., Depper JM., Kronke M. & Leonard WJ.
(1986). The human interleukin-2 receptor: role in
normal T-cell growth and association with HTLVI-induced T-cell leukemia. Cold Spring Harb Symp
Quant Biol. 51(2): 731-737.
Gu J., Ruan X., Huang Z., Chen J. & Zhou J. (2010).
Identification of functional domains of chicken
interleukin 2. Vet Immunol Immunopathol. 134:
230-238.
Hilton LS., Bean AG., Kimpton WG. & Lowenthal JW.
(2002). Interleukin-2 directly induces activation
and proliferation of chicken T cells in vivo. J
Interferon Cytokine Res. 22: 755-763.
Hoang CT., Hong Y., Truong AD., Lee J., Lee K. &
Hong, Y.H. (2017). Molecular cloning of chicken
interleukin-17B, which induces proinflammatory
cytokines through activation of the NF-kappaB
signaling pathway. Dev Comp Immunol. 74: 40-48.
Itoh K., Tilden AB. & Balch C.M. (1985). Role of
interleukin 2 and a serum suppressive factor on the
induction of activated killer cells cytotoxic for
autologous human melanoma cells. Cancer Res.
45: 3173-3178.
Kampa D. & Burnside J. (2002). Jak3-regulated genes:
DNA array analysis of concanavalin a-interleukin-2activated chicken T cells treated with a specific jak3
inhibitor. J Interferon Cytokine Res. 22: 975-980.

Ghi chú: Các ký tự chữ thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (*P <0,05; **P <0,01 và ***P <0,001).

Hình 7. Protein chIL-2 tái tổ hợp kích thích sân sinh INF, IL-1β
và IL-6 mRNA trên tế bào đại thực bào Marcrophage (HD11)

443


Nghiên cứu khả năng kích thích sinh cytokines của protein tái tổ hợp interleukin-2 trên tế bào đại thực bào

Kawano Y. & Noma T. (1996). Role of interleukin-2
and interferon-gamma in inducing production of
IgG subclasses in lymphocytes of human
newborns. Immunology. 88: 40-48.
Lauener P., Huttner S., Buisson M., Hossle J.P.,
Albisetti M., Seigneurin J.M., Seger R.A. & Nadal
D. (1995). T-cell death by apoptosis in vertically
human immunodeficiency virus-infected children
coincides with expansion of CD8+/interleukin-2
receptor-/HLA-DR+ T cells: sign of a possible
role for herpes viruses as cofactors? Blood.
86: 1400-1407.
Mamontov P., Eberwine R.A., Perrigoue J., Das A.,
Friedman J.R. & Mora J.R. (2019). A negative role
for the interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK)
in human Foxp3+ TREG differentiation. PLoS
One.14: e0215963.
McMillan D.N., Kernohan N.M., Flett M.E., Heys
S.D., Deehan D.J., Sewell H.F., Walker F. &

Eremin O. (1995). Interleukin 2 receptor
expression and interleukin 2 localisation in human
solid tumor cells in situ and in vitro: evidence for a
direct role in the regulation of tumour cell
proliferation. Int J Cancer. 60: 766-772.
Mergulhao F.J., Summers D.K. & Monteiro G.A.
(2005). Recombinant protein secretion in
Escherichia coli. Biotechnol Adv. 23: 177-202.
Morgan D.A., Ruscetti F.W. & Gallo R. (1976).
Selective in vitro growth of T lymphocytes
from normal human bone marrows. Science.
193: 1007-1008.
Piscitelli SC. & Minor JR. (1995). Role of interleukin-2
in managing infection with the human
immunodeficiency virus. Am J Health Syst Pharm.
52: 541-542.
Reichert T.E., Kashii Y., Stanson J., Zeevi A. &
Whiteside T.L. (1999). The role of endogenous
interleukin-2 in proliferation of human carcinoma
cell lines. Br J Cancer. 81: 822-831.

Reichert T.E., Nagashima S., Kashii Y., Stanson J.,
Gao G., Dou Q.P., & Whiteside T.L. (2000).
Interleukin-2 expression in human carcinoma cell
lines and its role in cell cycle progression.
Oncogene. 19: 514-525.
Rey A., Klein B., Ilnicki C., Jourdan M. & Serrou B.
(1984). The role of interleukin-2 in T colony
formation by human pre-T cells (pTCFC). Clin
Exp Immunol. 58: 154-160.

Sundick RS. & Gill-Dixon C. (1997). A cloned chicken
lymphokine homologous to both mammalian IL-2
and IL-15. Journal of immunology (Baltimore,
Md.: 1950). 159: 720-725.
Susta L., Diel D.G., Courtney S., Cardenas-Garcia S.,
Sundick S., Miller P.J., Brown C.C. & Afonso C.L.
(2015). Expression of chicken interleukin-2 by a
highly virulent strain of Newcastle disease virus
leads to decreased systemic viral load but does not
significantly affect mortality in chickens. Virol J.
12: 122.
Szatraj K., Szczepankowska AK., Saczynsk, V., Florys
K., Gromadzka B., Lepek K., Plucienniczak G.,
Szewczyk B., Zagorski-Ostoja W. & Bardowski J.
(2014).
Expression
of
avian
influenza
haemagglutinin (H5) and chicken interleukin 2
(chIL-2) under control of the ptcB promoter in
Lactococcus lactis. Acta Biochim Pol. 61: 609-614.
Toren A., Ackerstein A., Slavin S. & Nagler A. (1995).
Role of interleukin-2 in human hematological
malignancies. Med Oncol. 12: 177-186.
Truong A.D., Hong Y., Rengaraj D., Lee J., Lee K. &
Hong Y.H. (2018). Identification and functional
characterization, including cytokine production
modulation, of the novel chicken Interleukin-11.
Dev Comp Immunol. 87: 51-63.

Truong A.D., Park B., Ban J. & Hong Y.H. (2016). The
novel chicken interleukin 26 protein is
overexpressed in T cells and induces
proinflammatory cytokines. Vet Res. 47: 65.

444