Xác Định Tần Suất Đột Biến Điểm Vùng D - Loop Trong Hệ Gen Ty Thể Ở Người Việt Nam

1


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM VÙNG
D – LOOP TRONG HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 60 42 01 14

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN
Người thực hiện

: NGUYỄN THÙY LINH

Lớp

: Cao học K17

Hà Nội – 2015

2


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề

1.

Trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể (ADN ty thể)
như một chỉ thị sinh học đang được phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau. Bên cạnh đó, những vấn đề về rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể, các bệnh
chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa….được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ
bản của di truyền học và y học.
Với nhiều phát minh cũng như các nghiên cứu mới về di truyền từ các thế kỷ
trước mà tiêu biểu là việc công bố trình tự hệ gen người hay còn gọi là “ trình tự tham
chiếu” (Cambridge Reference Sequencing – CRS) được Anderson và cộng sự công bố
đầu tiên vào năm 1981 và “trình tự tham chiếu sửa đổi” – rCRS (Andrew và cộng sự.
1991) đã tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu sinh học mà đặc biệt
là những nghiên cứu về loài người. Sau khi có bản đồ gen người, người ta thấy rằng
các cá thể người giống nhau đến 99.9% và chỉ khác nhau rất nhỏ (0.1%) về cấu trúc hệ
gen. Trong 0.1% khác biệt giữa hai cá thể thì có đến hơn 80% là các đa hình nucleotit
đơn (Single Nucleotide Polymorphism và được viết tắt là SNP). Chính vì thế SNP
được sử dụng rộng rãi các mảng y dược học, hình sự và cung cấp những kiến thức hữu
ích trong quá trình tiến hóa loài người ở các vùng địa lý trong bối cảnh và lịch sử khác
nhau.
Việc tìm được danh sách các SNP của người Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ vào
nghiên cứu tiến hóa di truyền, đồng thời cũng cung cấp được thông tin về các đột biến
có liên quan đến các căn bệnh ung thư, rối loạn ở người. Nhận thức được tầm quan
trọng về việc tìm hiểu các dữ liệu di truyền về dân tộc Việt Nam chính vì thế trong
khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xác định tần suất đột biến

điểm vùng D – Loop của hệ gen ty thể người Việt Nam”.
2.

Mục tiêu:
-

Lập được danh sách các SNP trong vùng D – Loop của AND ty thể đặc trưng

của người Việt Nam.
3.

Nội dung đề tài:
- Tách chiết ADN từ các mẫu móng tay
- Giải trình tự gen vùng D – Loop
3


- Phân tích trình tự gen vùng D – Loop ở các mẫu và so sánh trình tự mẫu phân
tích với trình tự tham chiếu sửa đổi (rCRS) và tìm đặc trưng SNPs ở chủng người Việt
Nam.

4


CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

Giới thiệu chung về ty thể
Ty thể (Mitochondrion) là bào quan có thể tìm thấy trong gần như tất cả các tế

bào có nhân. Số lượng của ty thể trong mỗi tế bào ở mỗi loài là khác nhau. Ty thể là
trung tâm hô hấp của tế bào, là nơi sản sinh ra ATP một dạng năng lượng có thể sử
dụng cho các phản ứng của tế bào. Không có ty thể các tế bào sẽ phải dựa vào quá
trình đường phân kỵ khí để cung cấp tất cả adenosin triphotphat (ATP) cho hoạt động
của mình. Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả năng tự sinh sản bằng cách phân đôi ty
thể mẹ để sinh ra các ty thể con (Alberts B, Johnson A, Lewis J và cộng sự. 2002).
Hình 1.1.

Hình 1.1. Ty thể
(Thepsychguru.com – 2012)
1.1. Cấu tạo và chức năng của ty thể

1.1.1. Cấu tạo
Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, có kích thước đường kính 0.1
– 0.5 µm, chiều dài 1 – 2 μm. Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngoài (outer
membrane) và màng trong (inner membrane). Màng ngoài chứa các protein tạp kênh
lớn (gọi là porin) và cho phép tất cả các phân tử nhỏ hơn 5kDa thấm qua được. Màng
trong được cuộn gấp rất phức tạp tạo thành các cấu trúc gọi là mào hoặc răng lược
(cristate). Khác với màng ngoài, màng trong chỉ thấm chọn lọc một số ion. Vùng bề
mặt khá lớn của màng trong ty thể (intermembrane space) chứa các enzym tham gia
vào quá trình oxy hóa - photphoryl hóa và tổng hợp ATP. Phần chất nền (matrix space)
của ty thể chứa các enzym cần thiết cho sự oxy hóa pyruvat và các axit béo, các enzym
tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper. 2000). Khoang nền cũng
5


chứa nhiều bản sao của ADN ty thể, các ribosome của ty thể, RNA vận chuyển
(tRNA) và nhiều loại enzym cần thiết cho phiên mã và dịch mã của các gen ty thể.
Hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc ty thể
(hallcpbio.com)

1.1.2. Chức năng của ty thể
Ty thể là trung tâm giải phóng và chuyển hóa năng lượng của tế bào (photphoryl
hóa – oxy hóa). Phần lớn năng lượng được tích lũy trong các nguyên liệu hữu cơ được
giải phóng và chuyển thành dạng ATP sử dụng trong pha phân giải hiếu khí diễn ra ở
ty thể. Vì vậy ty thể được xem là “nhà máy năng lượng” của tế bào (Dahout, Gonzalez
. 2006).
Trong mỗi tế bào số lượng ty thể dao động từ 50 – 1.000. Các tế bào hoạt động
mạnh như tế bào cơ và tế bào gan có số lượng lớn ty thể. Ở nơi tế bào hoạt động nhiều
thì số vách ngăn lại tăng lên, ứng với số enzym tăng lên. Bên trong tế bào ty thể phân
bố ở nơi cần dùng nhiều năng lượng. Ví dụ trong tế bào gan, ty thể nằm chèn mạng
lưới nội chất hạt nơi cần nhiều năng lượng cho tổng hợp protein.
Tổng hợp năng lượng trong ty thể thông qua quá trình đường phân. Chỉ một phần
rất nhỏ năng lượng dự trữ của gluco được chuyển hóa (2ATP). Sự chuyển hóa
cacbohydrat được hoàn tất khi sản phẩm của quá trình đường phân (pyruvat) được
chuyển vào trong ty thể và bị oxy hóa từ O2 thành CO2, nước và 36 ATP.
Các protein liên quan trong quá trình oxy hóa – photphoryl hóa đều định vị ở
màng trong ty thể, bao gồm các thành phần trong chuỗi truyền điện tử (phức hệ 1 đến

6


4), enzym F0F1 ATP synthase. Quá trình truyền điện tử và tổng hợp ATP được tóm tắt
ở hình 1.3.

Hình 1.3. Sơ đồ tổng hợp ATP trong ty thể
Ty thể còn có khả năng tổng hợp các chất: photpholipit, axit béo và đặc biệt là
protein (protein cấu trúc và các enzym). ADN trong ty thể chịu trách nhiệm tổng hợp

phần protein ty thể.
Ty thể có khả năng di truyền độc lập đối với nhân. Tuy nhiên vẫn có sự phối hợp
giữa nhân, cơ chất của tế bào chất với cơ chất của ty thể trong quá trình biểu hiện của
gen (phiên mã và tổng hợp protein).
1.2. Đặc điểm của ADN ty thể người và ứng dụng trong nghiên cứu
Ty thể đóng vai trò quan trọng đối với sự tiến hóa của động vật. Những nghiên
cứu phổ biến hiện nay đối với di truyền ở người là trên ADN ty thể (mitochondrial
DNA – ADN ty thể). Mặc dù bộ gen ty thể người chỉ bằng 0.0005% so với toàn bộ
kích thước bộ gen trong nhân nhưng các SNP được tìm thấy trong gen ty thể có liên
quan đến nhiều bệnh chuyển hóa, rối loạn cũng như các đặc trưng ở người và đặc biệt
là các SNP ở vùng D – Loop.

1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ty thể người
Hệ gen ty thể người có chiều dài khoảng 16.569 bp, là một phân tử mạch vòng
kín nằm trong chất nền ty thể và có hàng ngàn bản sao trong một tế bào. Phân tử ADN
ty thể có hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotit:
 Chuỗi nặng có chứa nhiều Guanin (H – strand), mã hóa cho 28 gen.

7




Chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosin (L – strand), mã hóa cho 9 gen trong tổng số 37

gen của hệ gen ty thể.
Trong 37 gen này có 13 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ
thống photphoryl hóa – oxy hóa, bao gồm 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (complex I), một
tiểu đơn vị của phức hệ III (complex III), 3 tiểu đơn vị cửa phức hệ VI (complex VI)
và hai tiểu đơn vị của phức hệ V (complex V). Số gen còn lại mã hóa cho 22 tRNA, 2

rRNA (12S và 16S) phục vụ quá trình dịch mã của ty thể (Anderson S. 1981). Các
chuỗi polypeptit khác cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể được mã hóa bởi
gen nhân và được tổng hợp trong ribosom của tế bào chất.
Một đặc điểm đáng chú ý là hệ gen ty thể người có rất ít phần trình tự không mã
hóa. Chỉ có khoảng 7% gen ty thể người không mã hóa các protein, rRNA, tRNA
trong khi phần lớn hệ gen nhân là các vùng ADN không mã hóa (intron). Đoạn ADN ở
giữa các gen ty thể hoặc là không có hoặc là ngắn hơn 10 bp. Ở một vài gen thay vì có
mã kết thúc mRNA cần được polyadenin hóa để tạo thành mã kết thúc. Khoảng 90%
số gen ty thể không mã hóa lại nằm trong vùng điều khiển hay D – Loop. Phần lớn các
trình tự liên quan tới quá trình nhân đôi của ADN ty thể hay quá trình phiên mã đều
nằm trong hoặc gần vùng D – Loop. Đoạn D – Loop có kích thước khoảng 1.1 kb
ADN ty thể có một số vùng bất biến nằm trong vùng D – Loop bao gồm vùng
promoter và vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình tự bất
biến này đều nằm ở D – Loop và được bảo tồn ở rất nhiều loài động vật có xương sống
nên chúng được cho rằng có vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của ADN ty
thể. Ví dụ, CSB I có vị trí ngay gần vùng khởi đầu của quá trình nhân đôi chuỗi nặng
(Wallberg and Clayton. 1981). Thêm nữa, vùng D – Loop còn chứa các vùng siêu biến
(hypervariable regions) HVI, HVII và HVIII. Những vùng này có tần suất đột biến cao
hơn đáng kể so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Greenberg. 1983).

8


Hình 1.4. Cấu trúc ty thể người
(Innovitaresearch – 2003)

1.2.2. Vị trí và độ dài vùng gen điều khiển D – Loop
Như đã giới thiệu ở trên, vùng gen điều khiển D – Loop có chiều dài xấp xỉ 1.100
bp và chứa các trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản hệ gen ty thể và các đoạn điều
khiển cho quá trình phiên mã của các gen chức năng trong vùng được mã hóa

(Anderson. 1981, Lightowlers. 2001). Hệ thống đánh số bazơ bắt đầu tại điểm gần
giữa vùng điều khiển và đi về hai phía, vì thế vùng điều khiển trải dài từ vị trí 16024
đến 16569, sau đó tiếp tục từ vị trí bazơ 1 cho đến 576. Đây là vùng xuất hiện nhiều
đột biến nhất với tần số đột biến cao hơn so với các vùng khác của hệ gen ty thể
(Horai. 1995, Sorenson, Fleischer. 1996). Hình 1.5

Hình 1.5. Vùng điều khiển D – Loop của ty thể người
()
9


 Vùng siêu biến 1 (HV1) kéo dài từ vị trí 16024 đến 16365.
 Vùng siêu biến 2 (HV2) kéo dài từ vị trí 73 đến 340.
 Vùng siêu biến 3 (HV3) kéo dài từ nucleotit 438 đến 574.
1.3.

Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs)

1.3.1. Đa hình nucleotit đơn là gì?
Đa hình nucleotit đơn hay còn gọi là SNPs, được định nghĩa là biến thể trình tự
ADN xảy ra khi một nucleotit đơn A, T, G hay C trong hệ gen khác biệt so với các cá
thể khác trong cùng một loài.

Hình 1.6. Đa hình nucleotit đơn
(learn.genetics.utah.edu)
Ở cá thể người, có 99.9% là giống nhau, chỉ 0.1% là khác biệt. Sự khác biệt này
có thể là các đặc trưng tính trạng. Ví dụ như các sự phát triển bệnh nào đó ở người
hoặc kiểu hình …
Những biến đổi này có thể không có hại (những thay đổi về kiểu hình), có hại
(gây bệnh ung thư, bệnh tim, Huntington’s, bệnh tan huyết bẩm sinh), hoặc phát triển

sau khi về già (đây là những biến đổi được tìm thấy trong vùng mã hóa và điều hòa
gen).

1.3.2. Các vị trí SNP trên gen
SNP có thể nằm trong vùng mã hóa các gen, vùng không mang mã hoặc trong
vùng xen giữa các gen. Các SNP trong trình tự mã hóa không nhất thiết sẽ làm thay
đổi trình tự các axit amin.

10


Các SNP xuất hiện ở ngoài gen thì thường không ảnh hưởng đến chức năng và
sản phẩm của protein.
Các SNP xảy ra trong vùng gen không mã hóa làm thay đổi hàm lượng protein
được tạo ra.
Các SNP xuất hiện trong vùng gen mã hóa (từ đó dẫn đến thay đổi biểu hiện gen
như hình 1.7.

Hình 1.7. Vị trí SNPs trong gen
()
Tuy nhiên trong một số trường hợp, SNP không nằm trong vùng mã hóa protein
vẫn có thể gây ảnh hưởng đến sự nối ghép các gen, tác động lên các yếu tố phiên mã,
làm suy thoái RNA thông tin…. Sự biểu hiện gen bị ảnh hưởng bởi dạng này được gọi
là một eSNP (sự biểu hiện SNP) và có thể biểu hiện tăng hoặc giảm trong gen.

1.3.3. Ứng dụng và tầm quan trọng
Ứng dụng đầu tiên của SNPs phải kể đến đó là chìa khóa tiềm năng trong việc
tiến hành y học cá nhân. Các biến thể trong trình tự ADN của con người có thể ảnh
hưởng đến cách cơ thể phát triển bệnh, cách cơ thể đáp ứng với các tác nhân gây bệnh,
các hóa chất, thuốc, vacxin và các loại tác nhân khác. Tuy nhiên, vai trò quan trọng

nhất của chúng trong các nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gen giữa các
nhóm người (có thể là giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh trong các nghiên cứu ở
mức toàn bộ hệ gen (Genome Wide Association studies – GWAS)).
Một SNP có thể là nguyên nhân gây ra một bệnh di truyền. Đối với các bệnh
phức tạp, các SNP thường không hoạt động đơn lẻ, chúng thường hoạt động trong một
11


sự kết hợp với các SNP khác để biểu hiện một trình trạng bệnh như ta thấy ở bệnh
loãng xương.
Các nghiên cứu về SNP không những tạo ra điều kiện thuận lợi trong quá trình
phát hiện các biến thể di truyền và bệnh di truyền mà còn phát triển nghiên cứu nhằm
tìm ra cách phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai. Các SNP có thể mang lại các
phản ứng khác nhau đối với thuốc điều trị. Ngoài ra nhiều SNP được sử dụng làm chỉ
thị giúp cho việc lập bản đồ gen liên quan đến bệnh hoặc một đặc điểm nào đó. Những
SNP có liên hệ với các bệnh ở người như ung thư, các bệnh truyền nhiễm, các bệnh tự
miễn, bệnh thần kinh có thể được sử dụng để tìm ra đích tác dụng của thuốc và các liệu
pháp chữa trị(John M. Butler và cộng sự., 2004).
Năm 2004, John M.Butler và cộng sự cũng đã chỉ ra một vai trò khác của SNP đó
là đặc trưng cho dân tộc người nào đó, những dân tộc phân bố ở các khu vực địa lý,
không gian, thời tiết khác nhau thường có những đặc trưng riêng.
1.4. Đột biến ty thể và bệnh ty thể
Do hệ gen ty thể chỉ mã hóa cho một số lượng rất ít protein/enzym. Chính vì vậy
chức năng ty thể còn được thực hiện nhờ vào hàng loạt các protein/enzym do gen nhân
quyết định và được tổng hợp trong tế bào chất rồi được vận chuyển đến ty thể. Chính
vì vậy, các rối loạn ty thể (hay bệnh do ty thể có thể phát sinh do những đột biến ở gen
nhân hoặc gen ty thể (ADN ty thể). Một số rối loạn ảnh hưởng đến một cơ quan như
bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber. Nhưng cũng có những rối loạn ảnh hưởng đến
rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội về thần kinh – cơ.
Hiện nay người ta đã biết đến có trên 150 bệnh di truyền khá nhau theo mẫu hệ

do ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường rất đa dạng. Chúng có
thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột
biến điểm thay đổi các nucleotit (Sevidei et al. 2002).

1.4.1. Đột biến ty thể trong vùng D – Loop
Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú (Tan và cộng sự. 2002) đã giải
trình tự hệ gen ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của bệnh nhân và đã
cho thấy 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81.5% đột biến thuộc vùng
D – Loop.

12


Với bệnh ung thư buồng trứng (Liu và cộng sự. 2004) đã xác định được 60% đột
biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột
biến điểm T – C hoặc G – A. Bốn vùng có đột biến điểm này là D – Loop, 12sRNA,
16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có tần suất
đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng.
Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày (Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được 48%
mang đột biến soma ở vùng D – Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc
mất bazơ tại vị trí nucleotide 303 – 309 (Vị trí D310).
Trong các nghiên cứu khác (Burgart và cộng sự. 2001) đã tìm thấy đột biến mất đoạn
nhỏ (50 bp) trong vùng D – Loop ở 4/32 (12.5%) ở bệnh nhân ung thư dạ dày.
Thêm đoạn
(Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈ 260 bp và ≈
520 bp) trong vùng D – Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của một bệnh nhân
ung thư dạ dày. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.

1.4.2. Đột biến ty thể nằm ngoài vùng D – Loop

Các bệnh như liệt mắt tăng tiến kinh niên (Chronic Progressive External
Ophthalmoplegia, CPRO), hội chứng Kearn – Sayre (Kearn – Sayre syndrome, KSS),
đái đường và câm điếc (Diabetes and deafness) đều do mất đoạn hoặc sắp xếp lại trong
gen tại vị trí 1555G. Các đột biến G1177A, T14484C, G3460A, 14459A, cũng làm
biến đổi protein, dẫn đến liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (Leber hereditary optic
neuropathy, LHON). Đột biến trong gen cytb gây bệnh không dung nạp vận động và
myoglobin niệu (Chia-Chi Hsu và cộng sự. 2013)
Cho đến nay nhiều dạng đột biến ADN ty thể được xác định, các đột biến này
bao gồm: đột biến điểm, đột biến thêm hoặc mất bazơ, đột biến lặp đoạn, mất đoạn hay
thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể.
Đột biến điểm
Tan và cộng sự. 2002 phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú và chỉ ra
18.5% bệnh nhân mang đột biếnđược xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và
ATPase 6. Trong số các đột biến trên đột biến thêm hoặc mất bazơ chiếm 42% thuộc
vùng D – Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng mã hóa và không mã hóa.

13


Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng (Polyak và cộng sự.
1998) đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng mã hóa ND1, ND4, ND5,
cytochrome b, COXI, COXII và COXIII cũng như các gen rRNA 12S và 16S.
Mất đoạn
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn như mất đoạn 4977 bp đã được xác định ở ung
thư vú, ung thư đại trực tràng.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư.
Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng.
Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh nhân ung
thư vú, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư buồng trứng. Như vậy biến đổi về hàm

lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư.
Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ
thuộc vào vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong vùng
D – Loop điều khiển sự sao chép ADN ty thể sẽ làm giảm số bản sao. Mặt khác đột
biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi photphoryl hóa – oxy hóa
lại có thể làm tăng số bản sao như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty
thể.

14


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu

2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu sinh phẩm được dùng để tách chiết ADN là móng tay hoặc móng chân của
những người khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống, kích cỡ mẫu (n=200). Quy
trình thu thập mẫu được tiến hành theo các bước như trong hình 2.1 .

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

Hình 2.1. Các bước tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm
(A) Móng tay/móng chân được rửa sạch bằng xà phòng và nước trước khi lấy mẫu
(B) Đeo găng tay để tránh nhiễm ADN từ người này sang người khác
(C) Sử dụng cắt móng tay mới hoặc đã được khử trùng hoàn toàn bằng cách đun
trong nước 5 phút. Mẫu được lấy ít nhất là 1 bên bàn tay, nếu có thể sẽ lấy ở cả 2
bàn tay/chân để thu được nhiều mẫu hơn.
(D) Mẫu móng tay/chân được đựng trong dụng cụ chứa mẫu đã được khử trùng
như túi nhựa hoặc phong bì để dễ dàng gửi đi.
(E) Đóng gói và chuyển mẫu đi theo hướng dẫn.
2.1.2. Hóa chất
Agarose (Sigma)
Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)
Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)
Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche)
Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma)
Proteinase K (Fermentas)
Dung dịch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)
Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
Etanol (Fermentas)
RNase A (Fermentas)
H2O vô trùng (Fermentas), Marker 1 kb (Fermentas)
15


2.2. Trang thiết bị
Các thiết bị khác phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1.
Ứng dụng

Thiết bị

Hãng sản xuất
Eppendorf CHLB Đức

Ly tâm nhanh
Ly tâm

Avanti TM 30 centifuge

Ly tâm lạnh

Beckman

So màu

Đo OD

Hewlett Packard, Mỹ

Đo pH

S20

Metter Toledo

Cân

Cân 10-4

Ohaus

Điện di

Điện di Agarose

Bio-rad

Pipetman
Khử trùng
Giải trình tự
DNA
PCR

10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,
1ml

Eppendorf

HVE-50

Hirayama, Nhật Bản

ABI 3100 Avant

(Applied, Biosystem).

PCR 9700

(Applied, Biosystem).

Máy khuấy từ

RotoLab, OSI

Vortex

Rotolab, OSI

Ổn/gia nhiệt

Bể ổn nhiệt

Techne, OSI

Lò vi sóng

Samsung

Tủ lạnh sâu – 750C, Tủ lạnh
-200C

Tủ lạnh
Chụp ảnh

Sanyo, Nhật Bản

Tủ lạnh thường

Sanyo, Nhật Bản

Máy soi chụp ảnh gel

Phamarcia

Tủ cấy

Sanyo, Nhật Bản
Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

2.3. Phần mềm tin sinh học
Các phần mềm tin sinh học được sử dụng trong nghiên cứu này và chức năng của
chúng được liệt kê theo Bảng 2.2.
16


Chức năng

Địa chỉ

Kiểm tra chất lượng trình tự và so

/>
sánh trình tự

oedit.html

Phần mềm
BioEdit

BLAST

So sánh trình tự với gen chuẩn
công bố trên ngân hàng gen

SOFTGEN Bao gồm các phần mềm bổ trợ tìm
ETICS

đột biến điểm

/>
/>
Bảng 2.2. Phần mềm sử dụng
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay
Dựa theo phương pháp tách ADN từ móng tay sử dụng Phenol: Chroloform
(Sambrook và cộng sự. 1989) và quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu móng tay được cho vào ống Eppendorf 1.5 ml, rửa 5 – 10 lần bằng nước
khử trùng
- Rửa lại bằng cồn 70%
- Bổ sung 200 µl EDTA (pH 8, 0.5M)
- Đảo nhẹ, ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng
- Loại dịch, bổ sung 200 µl SDS trong EDTA + proteinase K (5 µl)
- Ủ trong 1h
- Rửa lại bằng nước khử trùng
- Bổ sung 400 µl NaOH 2N rồi ủ qua đêm
- Chỉnh pH về 6 – 7
- Bổ sung dung dịch 25:24:1 theo tỉ lệ 1:1
- Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút

- Thu dịch trong
- Bổ sung Etanol 100% + Natri Axetat NaOAc 3M
- Để trong tủ -200C trong 30 phút
- Ly tâm thu tủa
- Rửa lại tủa bằng cồn Etanol 700
- Ly tâm
- Làm khô và hòa tan lại bằng nước
17


2.4.2. Định lượng ADN tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế
Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN
đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu ADN tách chiết.
Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại ở bước sống 260 nm
(OD260) đối với axit nucleic và ở bước sóng 280 nm (OD280) đối với protein.
Mức độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm của mẫu đó cho phép xác định
nồng độ axit nucleic trong mẫu theo tương quan: Một đơn vị OD260 tương ứng với
nồng độ 50 µg/ml ADN sợi kép. Do vậy, nồng độA sẽ được tính theo công thức:
CDNA = OD260 x 50 x d
Trong đó: d = Độ pha loãng mẫu khi đo; CADN =Nồng độ ADN
Tuy vậy, cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch axit nucleic là sạch, nếu dung
dịch chứa ADN còn có lẫn protein hoặc 1 số dung môi, hóa chất tách chiết thì protein
cũng sẽ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm và 230 nm do đó làm sai lệch giá trị thật
của nồng độ ADN trong mẫu. Để khẳng định cho kết quả chính xác hơn, chúng tôi đo
thêm giá trị OD280 để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch ADN. Nếu tỷ lệ
OD260/OD280> 1,8 thì mẫu ADN tách chiết được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ
tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc
nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của một loại

enzym DNA polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng
các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy
để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài
từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và
được enzym DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Các
sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên
900C (92 – 980C) mà thường là 940C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra (Lê Thanh Hoà
và cộng sự. 2001b).
Cả 2 sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn
mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho
cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở 2 đầu đoạn ADN cần
nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài
18


về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất
hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ
lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó
được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp
ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý
thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi (Hình
2.2). Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được “nhân lên” với một lượng rất
lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 230 = 1.073.741.824.

Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi.
Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN.

Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã
được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh
khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lượng ADN khuôn cần cho phản
ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1 –
19


100 ng DNA tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp,
phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ.
Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:
- ADN làm khuôn
- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (primer)
- Enzym chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là Taq,
chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus).
- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP).
- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++).
- Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v...)
- Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l.
Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ (Hình 2.3).
Bung liên kết của ADN (Denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90C - 98C
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra
tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym RNA
Polymerase xúc tác tổng hợp.
Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – Annealing). Sau bước 1, ngay lập tức, nhiệt
độ được hạ xuống 37 – 68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương
ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – Extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng
lên 68°C – 72°C (thông thường 72C) trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi
ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm
PCR.

Hình 2.3. Các bước của một chu kỳ PCR
20


Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 – 40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ
cuối cùng. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72C trong 5 – 10 phút sao cho tất
cả các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng,
nhiệt độ hạ xuống 4C để bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm được
kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose (nồng độ 0,8% - 2%), và ADN của
PCR sẽ được nhìn thấy rõ dưới tác dụng của tia cực tím (ultra – violet) sau khi được
nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm hiển thị
ADN. Độ dài của ADN sản phẩm được tính bằng cách so sánh với chỉ thị ADN (DNA
Marker).
2.4.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger
Sau khi thu sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định trình tự dựa trên phương
pháp tổng hợp Sanger trên máy giải trình tự ABI PRISM tại Singapore.
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger
Vào năm 1975, F. Sanger và A.R.Coulson lần đầu tiên giới thiệu phương pháp giải
trình tự ADN, công trình hữu ích này đã giúp cho sinh học phân tử có những bước đi
mới. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thường còn sử
dụng thêm 4 loại dideoxynucleotit (mất nhóm - 3’OH). Điều này khiến các
dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối photphodieste với các
nucleotit tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp ADN. Hình 2.4.

21


Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger

(esciencecentral.org)
2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự
Các thông số và dữ liệu thu nhận sau khi đọc trình tự (Hình 2.5) được kiểm tra
bằng phần mềm BioEdit. Phần mềm này cho phép xem xét độ phân tách các đỉnh tín
hiệu và các phần nhiễu tín hiệu (background noise).

22


Mẫu đọc trình tự chấtlượng tốt

Mẫu đọc trình tự có nhiễu tín hiệu nhưng ở mức chấp nhận được

Mẫu đọc trình tự có nhiều nhiễu tín hiệu, chất lượngkhông tốt
Hình 2.5. Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự
Mặc dù là một phương pháp tiên tiến xong việc đọc trình tự bằng máy vẫn có
những lỗi mà các phần mềm không thể tự động sửa, vì vậy dựa trên các biểu đồ hiển
thị tín hiệu, chúng tôi thực hiện kiểm tra thủ công độ phân định của tín hiệu một lần
nữa bằng mắt thường và thay thế các nucleotit mà máy đọc không thể xác định hoặc
gọi nhầm (Hình 2.6).

23


Lỗi nhận biết tínhiệu sai

Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông
2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen
Các trình tự được đưa so sánh với trình tự tham chiếu sửa đổi Revised
Cambridge Reference Sequence (rCRS) (NC_012920.1) trên chương trình BLAST và

một vài chương trình tìm kiếm đột biến điểm khác nhau như GeneMarker, NovoSNP
và MutationSurveyor. Dựa trên kết quả tổng hợp phân tích từ tất cả các phần mềm, đột
biến đặc trưng được xác định dựa trên phần trăm các điểm đột biến xuất hiện ở các cá
thể đã được lấy mẫu để phân tích trình tự.

24


CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm
ADN tổng số là nguyên liệu cơ bản của phản ứng PCR, vì vậy chất lượng của nó
quyết định đến chất lượng của phản ứng PCR và các kết quả thí nghiệm sau này. ADN
tổng số có độ tinh sạch cao, trạng thái không bị đứt gãy và có nồng độ hợp lý cần thiết
cho quá trình thực hiện phản ứng PCR hiệu quả và tạo cơ sở tốt cho các công việc tiếp
theo.
Sau khi tách chiết được ADN tổng số, chúng tôi tiến hành kiểm tra nồng độ ADN
trong mẫu bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm.

Bảng 3.1. Kết quả đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại 2 bước sóng
260 nm và 280 nm
3.2. Nhân gen bằng phương pháp PCR
Vùng D – Loop được chọn nghiên cứu. Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR bao
gồm mồi xuôi: định vị trên RNA vận chuyển Proline (RNAvPro) và mồi ngược: định
vị trên vùng bảo tồn D – Loop, nhân đoạn ADN cho độ dài xấp xỉ 1000 cặp nucleotit .
Chúng tôi dùng trình tự hệ gen ty thể người được công bố tại Ngân hàng Gen
() để thực hiện các bước thiết kế mồi và so sánh trình tự.
Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn nucleotit mạch đơn có kích thước từ 6 – 100 bp, có trình tự
bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn ở 2 đầu mạch đơn. Có 2 loại mồi là mồi xuôi
(primer forward) và mồi ngược (primer reverse) tham gia vào PCR.

Mồi xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 5’ của mạch khuôn, mồi ngược bắt cặp bổ sung và
gắn vào đầu 3’ của mạch khuôn. Mồi ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả của PCR. Để
25