Phân tích các biến đổi ở 3 protein vỏ fiber, penton và hexon của HAdV 3 gây bệnh đau mắt đỏ phân lập ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Lê Tuấn Anh

PHÂN TÍCH CÁC BIẾN ĐỔI Ở 3 PROTEIN VỎ
FIBER, PENTON VÀ HEXON CỦA HADV-3 GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Lê Tuấn Anh

PHÂN TÍCH CÁC BIẾN ĐỔI Ở 3 PROTEIN VỎ
FIBER, PENTON VÀ HEXON CỦA HADV-3 GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Sáng

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng –
giảng viên tại Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQGHN - người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp tôi tiếp thu được
nhiều kiến thức về kỹ thuật chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Những chỉ dẫn của thầy là định hướng
quan trọng giúp tôi hoàn thành tốt luận văn cao học và bước đi tự tin trên con đường
khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền
học: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Đỗ Thị Phúc, TS. Trần Đức Long, ThS.
Trần Thùy Anh, và các thầy cô công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên. Cảm ơn các thầy cô đã hết lòng giảng dạy những kiến thức quý báu và
giúp đỡ tôi trong suốt hai năm học vừa qua.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Sinh học Phân
tử và Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học đã tạo điều
kiện cho chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Nghiên cứu này được tài
trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số QG.17.19.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân – những người
đã luôn bên cạnh, tạo điều kiện và động viên, cho tôi động lực để phấn đấu trong quá
trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019
Học viên
Lê Tuấn Anh


BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
µL

Microliter

µM

Micromol

ADN

Acid Deoxyribonucleic

bp

Base pairs

CAR

Coxsackie and Adenovirus Receptor

DF

Dodecahedron-fiber

GON

Group of nine

GOS

Group of six

HAdV

Human Adenovirus

HVR

Hypervariable region

IgA

Immunoglobulin A

IgG

Immunoglobulin G

NGS

Next Generation Sequencing

PCR

Polymerase Chain Reaction

SCR

Short Consensus Repeats

SNP

Single nucleotide polymorphism

UV

Ultra violet


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các chủng HAdV và các bệnh gây ra [22] ....................................................6
Bảng 2: Giá trị pI và chỉ số pH của các axit amin ....................................................14
Bảng 3: Thành phẩn phản ứng PCR ..........................................................................20
Bảng 4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................................20
Bảng 5: Mồi khuếch đại gen fiber của HAdV-3 ở Việt Nam ...................................23
Bảng 6: Các biến đổi trên gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham
chiếu ..........................................................................................................................25
Bảng 7: Các biến đổi axit amin trên đầu tương tác fiber ..........................................29
Bảng 8: Mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 ở Việt Nam ................................30
Bảng 9: Các biến đổi trên gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham
chiếu ..........................................................................................................................33
Bảng 10: Các biến đổi axit amin trên protein penton ...............................................36
Bảng 11: Mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 ở Việt Nam ...............................37
Bảng 12: Các biến đổi trên gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham
chiếu ..........................................................................................................................40
Bảng 13: Các biến đổi axit amin trên protein hexon.................................................44


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Mô tả cấu trúc của HAdV [63] ......................................................................8
Hình 2: Cấu trúc fiber và sự liên kết với penton .........................................................9

Hình 3: Sự liên kết giữa fiber và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 [40] ...............10
Hình 4: Sự liên kết giữa GON và GOS tạo nên vỏ capsid HAdV [8] ......................11
Hình 5: Cấu trúc axit amin [59] ................................................................................13
Hình 6: Cấu trúc chuỗi xoắn α và nếp gấp β [3] .......................................................15
Hình 7: Liên kết kỵ nước và cầu disulfua trong cấu trúc bậc 3 của protein [59]......16
Hình 8: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen fiber .........................................24
Hình 9: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự của gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam.....24
Hình 10: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen fiber ..........26
Hình 11: Hình ảnh xếp chồng của đầu tương tác protein fiber HAdV .....................27
Hình 12: Đầu tương tác fiber của HAdV-3 tại Việt Nam và domain SCR1-2 của thụ
thể CD46 ...................................................................................................................28
Hình 13: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen penton ...................................31
Hình 14: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam ......31
Hình 15: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen penton.......32
Hình 16: Protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam và các axit amin biến đổi ........35
Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen hexon.....................................38
Hình 18: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự của gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam 38
Hình 19: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen hexon ........39
Hình 20: Protein hexon của HAdV-3 ở Việt Nam ở dạng monomer và các axit amin
biến đổi ......................................................................................................................43
Hình 21: Biến đổi G42A và M884L trên cấu trúc trimer hexon ...............................43


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Tổng quan bệnh đau mắt đỏ .............................................................................3
1.2. Tổng quan về Human adenovirus ....................................................................5
1.3. Phản ứng của hệ miễn dịch với HAdV ............................................................7
1.4. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV .........................................................................7

1.5. Các protein vỏ của HAdV ................................................................................8
1.6. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp giải trình tự Sanger ..........................12
1.7. Tổng quan về axit amin .................................................................................12
1.8. Cấu trúc của protein .......................................................................................15
1.9. Phương pháp phân tích mô phỏng cấu trúc protein .......................................17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................19
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 23
3.1. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein fiber của HAdV-3 tại Việt
Nam .......................................................................................................................23
3.2. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein penton của HAdV-3 tại Việt
Nam .......................................................................................................................30
3.3. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein hexon của HAdV-3 tại Việt
Nam .......................................................................................................................37
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 46


4.1. Kết luận ..........................................................................................................46
4.2. Kiến nghị........................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................47


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đau mắt đỏ (tên tiếng Anh: pink-eye hoặc conjunctivitis) là một trong những
bệnh về mắt phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh thường không nguy hiểm đến tính mạng
nhưng có mức độ lây truyền rất nhanh trong người dân, gây ra những hệ lụy sức khỏe
cho cộng đồng [16, 32, 36, 49]. Nguyên nhân chủ yếu gây ra đau mắt đỏ là vi-rút
Human Adenovirus (HAdV). Các thành phố lớn ở Việt Nam có mật độ dân cư dày
đặc là môi trường lý tưởng cho các chủng vi-rút này lan truyền.

Cho đến nay, các nghiên cứu về HAdV ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc
xác định và phân loại [24, 27]. Các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra HAdV-3 là một
trong những chủng phổ biến gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Nếu như không có
những nghiên cứu đi sâu vào phân tích các protein cấu trúc vỏ của HAdV-3 thì sẽ rất
khó để Việt Nam có thể ứng phó kịp thời nếu xuất hiện các chủng biến đổi mới có
độc lực cao.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Phân tích các biến đổi ở 3
protein vỏ Fiber, Penton và Hexon của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ phân lập
ở Việt Nam” với các mục tiêu cụ thể:
1. Giải mã được trình tự của 3 đoạn ADN mã hóa các protein Fiber, Penton và
Hexon của chủng HAdV-3 - một trong những chủng gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt
Nam.
2. Phát hiện những biến đổi trong trình tự dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc của
các protein nêu trên.
3. Phân tích hậu quả của những biến đổi cấu trúc tới khả năng xâm nhiễm và
gây bệnh của HAdV-3 ở Việt Nam.
Nghiên cứu này sẽ cung cấp rất nhiều thông tin về ADN và cấu trúc protein
vỏ của HAdV-3 tại Việt Nam đầu tiên trên thế giới. Kết quả từ nghiên cứu cũng sẽ
được so sánh với các công bố trên thế giới để đánh giá mức độ biến đổi và làm mốc
nghiên cứu tốc độ biến đổi trình tự ADN của HAdV-3 tại Việt Nam trong tương lai.

1


Đây sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn về hệ protein của chủng virút này, góp phần định hướng nghiên cứu cách phòng tránh sự lây lan của HAdV-3 ở
Việt Nam và thế giới. Các kết quả trong nghiên cứu này cũng đã được chấp nhận
đăng trên tạp chí khoa học của Bộ Khoa học và Công nghệ.

2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan bệnh đau mắt đỏ
Bệnh đau mắt đỏ có tên tiếng Anh là “conjunctivitis”, xuất phát từ
“conjunctiva”, để chỉ trạng thái viêm của phần kết mạc ở mắt người. Biểu hiện thường
gặp nhất ở bệnh nhân đau mắt đỏ là các mạch máu vùng kết mạc sưng đỏ, có thể đi
kèm chảy nước mắt, sưng đau, ngứa rát, giảm thị lực và nhạy cảm với ánh sáng [78].
Dựa vào nguyên nhân gây bệnh mà đau mắt đỏ được chia thành các dạng sau đây
[74]:
- Đau mắt đỏ do dị ứng:
+ Đau mắt đỏ dị ứng: Thường xảy ra ở những người có tiền sử dị ứng theo
mùa.
+ Đau mắt đỏ có gai thịt: Gây ra bởi những vật lạ tiếp xúc với mắt trong thời
gian dài như kính áp tròng hoặc mắt giả.
- Đau mắt đỏ lây nhiễm:
+ Đau mắt đỏ vi khuẩn: Dạng đau mắt đỏ này thường xuất phát từ việc tiếp
xúc với những môi trường chứa khuẩn cầu chum và khuẩn cầu chuỗi. Nguồn
lây nhiễm có thể từ chính cơ thể bệnh nhân hoặc tiếp xúc với người khác thông
qua việc dùng chung đồ trang điểm, kính,…
+ Đau mắt đỏ vi-rút: Đây là dạng phổ biến nhất và dễ lây lan từ người sang
người thông qua việc hắt hơi. Nếu tiếp xúc với dịch cơ thể của những người
mắc đau mắt đỏ vi-rút như nước mắt, dịch nước mũi; thì nguy cơ lây bệnh sẽ
rất cao.
+ Viêm mắt sơ sinh: Dạng đau mắt đỏ này rất nguy hiểm và hay gặp ở trẻ nhỏ.
Nếu người mẹ mắc bệnh chlamydia hoặc bệnh lậu, khi sinh nở, mắt trẻ sẽ rất
dễ tiếp xúc với các vi khuẩn này và gây biến chứng lớn tới thị lực của trẻ.

3

- Đau mắt đỏ do hóa chất: Dạng này cũng khá phổ biến khi bệnh nhân phải
làm việc trong môi trường khói bụi hoặc chất clo trong bể bơi.
Tuy không nguy hiểm đến tính mạng nhưng bệnh đau mắt đỏ là cực kỳ phổ
biến; bệnh nhân phải chịu nhiều khó khăn trong sinh hoạt và có thể mắc bệnh ở mọi
độ tuổi, giới tính và vùng địa lý; những trường hợp nặng có thể dẫn đến các biến
chứng về thị lực, thậm chí mù lòa [4, 43, 73]. Ngoài ra, chi phí để điều trị cho các
bệnh nhân đau mắt đỏ cũng tiêu tốn khoảng 589 triệu đô la (tại Mỹ năm 2005), đấy
là mới chỉ tính riêng nguyên nhân gây bệnh là vi khuẩn [55]. Năm 2015 ở đảo Réunion
của Pháp, một trận dịch đau mắt đỏ kéo dài 13 tuần cũng đã làm thiệt hại hơn 3,3
triệu euro cho các công tác kiểm soát dịch, chưa tính các tác động như người dân phải
nghỉ việc để điều trị bệnh,… [19].
Để phòng tránh và giảm nguy cơ bị đau mắt đỏ, các bác sỹ khuyến cáo mọi
người không nên sử dụng chung những đồ dùng cá nhân như khăn mặt, khăn tay; hạn
chế dụi mắt và thường xuyên rửa tay sạch sẽ; và đeo kính bảo vệ khi tiếp xúc với môi
trường khói bụi, nhiễm khuẩn [76]. Nếu đã bị bệnh thì bệnh nhân cũng được khuyến
cáo là chưa cần điều trị ngay lập tức bởi vì các triệu chứng thường sẽ giảm hoặc biến
mất sau khoảng 1-2 ngày [46, 52]. Trường hợp bệnh kéo dài hơn, tùy thuộc vào
nguyên nhân mà có cách điều trị khác nhau:
Đau mắt đỏ do dị ứng: Đầu tiên cần loại bỏ tác nhân gây dị ứng. Với những trường
hợp nhẹ thì có thể nhỏ nước mắt bình thường. Nặng hơn thì có thể cần sự can thiệp
của thuốc kháng viêm (loại không chứa steroid) hoặc thuốc kháng histamin. Những
bệnh nhân mãn tính thì có thể phải dùng thuốc nhỏ mắt chứa steroid.
Đau mắt đỏ do vi khuẩn: Sử dụng thuốc nhỏ mắt có chứa chất kháng sinh hoặc thuốc
mỡ để tra vào mắt. Việc điều trị đau mắt đỏ với tác nhân vi khuẩn thường kéo dài 34 ngày.
Đau mắt đỏ do vi-rút: Đau mắt đỏ dạng này vẫn chưa có cách chữa trị đặc hiệu mà
chỉ có các phương pháp làm giảm mức độ khó chịu của bệnh như: tra thuốc nhỏ mắt
loại thường hoặc chườm lạnh. Bệnh sẽ tự thuyên giảm sau 2-3 tuần. Đặc biệt, thuốc

4

kháng sinh không có tác dụng đối với đau mắt đỏ do vi-rút gây ra vì việc này chỉ phù
hợp với nguyên nhân vi khuẩn; điểm nguy hại là nếu sử dụng sai loại kháng sinh và
liều lượng thì bệnh nhân có thể bị bệnh nặng hơn [38].
Đau mắt đỏ do hóa chất: Nhẹ nhàng rửa mắt với rất nhiều nước, sau đó đến gặp bác
sỹ ngay để nhận tư vấn.
Nói tóm lại, bệnh đau mắt đỏ có thể xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau:
thời tiết, môi trường làm việc, thói sinh hoạt hàng ngày,… [4]. Tuy nhiên; hầu hết
các bác sỹ chuyên khoa mắt sử dụng thuật ngữ “đau mắt đỏ” để ám chỉ bệnh do
nguyên nhân vi-rút gây ra [76], bởi vì đây là tác nhân hay bắt gặp nhất và có nguy cơ
lây lan nhanh nhất. Những vi-rút gây bệnh đau mắt đỏ có thể kể đến như: Human
adenovirus, Herpes simplex, Herpes zoster, và Enterovirus [73], Trong đó, Human
adenovirus được thống kê là vi-rút gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến nhất và thường gây
ra những trận đại dịch lớn trên khắp thế giới [35, 38, 68, 73].
1.2. Tổng quan về Human adenovirus
HAdV thuộc chi Mastadenovirus, họ Adenoviridae, bao gồm 7 loài được kí
hiệu bằng các chữ cái từ HAdV-A đến HAdV-G [7, 26]. HAdV không có vỏ ngoài,
đường kính vỏ capsid khoảng 90 nm, vật chất di truyền là ADN sợi đôi không phân
mảnh, có kích thước khoảng 36 Kb [37, 79]. HAdV rất phổ biến ở cả người và động
vật. Chúng có thể tồn tại một thời gian dài bên ngoài vật chủ, thời gian ủ bệnh lên tới
vài năm và có khả năng xâm nhiễm vào nhiều cơ quan khác nhau [75]. Theo số liệu
thống kê và nghiên cứu, các chủng HAdV gây ra rất nhiều nhóm bệnh khác nhau, bao
gồm: viêm dạ dày, viêm gan, viêm cơ tim, viêm phổi,… (Bảng 1). Tuy nhiên, các
bệnh này thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi và các dấu hiệu bệnh cũng khá lành tính
[22]. Trường hợp đặc biệt là HAdV-14 đã từng gây ra một trận đại dịch viêm phổi đã
làm 7 người chết ở bang Oregon (Mỹ) [29]. Bên cạnh những bệnh cấp tính ở người,
nhiều chủng HAdV cũng có thể là tác nhân tiền ung thư cho các loài động vật nhỏ.
Ví dụ như HAdV-12 (loài HAdV-A) có khả năng gây u nhú ở động vật gặm nhấm
[69, 70].

5


Bảng 1: Các chủng HAdV và các bệnh gây ra [22]
HAdV

Chủng

Đường gây bệnh

A

12, 18, 31

Hệ tiêu hóa, Hệ hô hấp, Đường tiết
niệu

B, tuýp 1

3, 7, 16, 21

Viêm giác mạc, Hệ tiêu hóa, Hệ hô
hấp, Đường tiết niệu

B, tuýp 2

11, 14, 34, 35

Hệ tiêu hóa, Hệ hô hấp, Đường tiết
niệu

C

1, 2, 5, 6

Hệ hô hấp, Hệ tiêu hóa (bao gồm
viêm gan), Đường tiết niệu

D

8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 2230, 32, 33, 36-39, 42-49

Viêm giác mạc, Hệ tiêu hóa

E

4

Viêm giác mạc, Hệ hô hấp

F

40, 41

Hệ tiêu hóa

G

52

Hệ tiêu hóa

Bởi vì sự đa dạng và phức tạp trong cơ chế biến đổi di truyền của HAdV, một
nhóm các nhà khoa học trên thế giới đã hợp tác để thống nhất cách xác định các chủng
HAdV mới phát hiện; tới nay, đã có 103 chủng HAdV được chính thức công nhận
bởi nhóm này [77]. Đáng chú ý nhất, các chủng thuộc loài HAdV-D có khả năng tái
tổ hợp rất cao và hình thành nên các chủng mới [61], và đa phần các chủng trong loài
này đều được phát hiện là tác nhân gây đau mắt đỏ. Bên cạnh loài HAdV-D thì loài
HAdV-B và HAdV-E cũng có những chủng được phân lập trong các trận dịch đau
mắt đỏ, các chủng thường xuyên liên quan đến đau mắt đỏ bao gồm HAdV-3, 4, 7, 8,
19 và 37 [67].

6


1.3. Phản ứng của hệ miễn dịch với HAdV
HAdV có nhiều cách để tiếp cận tế bào chủ, vì vậy, tùy thuộc vào chủng
HAdV, trạng thái cơ thể và cơ quan bị lây nhiễm, hệ miễn dịch sẽ có những đáp ứng
khác nhau. Thậm chí, HAdV còn có những cách để lẩn trốn tế bào miễn dịch như: ức
chế quá trình tự chết apoptosis của tế bào bị lây nhiễm, ức chế các đáp ứng của
interferon, và ngăn chặn biểu hiện của MHC-1 (Major Histocompatibility Complex)
trên bề mặt tế bào [23, 34, 53, 60, 66]. Ba cách xâm nhiễm thường gặp ở HAdV gồm
có:
- Xâm nhiễm sinh tan (đối với tế bào biểu mô): HAdV sẽ làm tan tế bào và
giải phóng các hạt vi-rút mới.
- Xâm nhiễm tiềm ẩn (đối với tế bào lympho): chỉ có rất ít tế bào bị phá vỡ và
số lượng tế bào chết đi được bù đắp lại bởi quá trình nhân bản tự nhiên.
- Xâm nhiễm tiền ung thư: ADN của HAdV được gắn vào vật liệu di truyền
của tế bào chủ và tái bản cùng với nó mà không sản xuất thêm hạt vi-rút mới.
Kháng thể chống lại HAdV đa phần là IgA. Đầu tên, trong vòng 3 ngày sau

lây nhiễm, kháng thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên, đến 7 ngày thì thấy ở dịch
nước mũi, huyết thanh (thường có cả kháng thể IgG) [60]. Các kháng thể sẽ tấn công
trực tiếp vào protein hexon trên bề mặt vỏ capsid của HAdV vì chúng mang những
thành phần kháng nguyên phổ biến [23, 66]. Một mặt khác, các tế bào T tham gia vào
quá trình hồi phục của tế bào sau khi sự xâm nhiễm kết thúc. Trên thực tế, các tế bào
T CD4+ có khả năng ghi nhớ được các kháng nguyên của HAdV và có thể được tái
kích hoạt nếu cơ thể bị nhiễm một chủng HAdV khác với chủng đã nhiễm trước đó
[20].
1.4. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV
Cơ chế xâm nhiễm chính xác của HAdV vẫn còn là một dấu hỏi lớn cần được
giải đáp. Cho đến hiện tại, các nhà khoa học trên thế giới mới chỉ biết chắc chắn rằng
HAdV sử dụng kết hợp 3 protein vỏ là fiber, penton và hexon, để xâm nhập vào tế

7


bào chủ. Thậm chí, mỗi chủng HAdV khác nhau lại sử dụng 3 protein nêu trên theo
cách riêng biệt để thực hiện chức năng của chúng. Trên thực tế, các loài HAdV-A, C,
D, E và F xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua thụ thể Coxsackie and Adenovirus
Receptor (CAR) [5, 45, 58]. Trong khi đó, các chủng thuộc loài B như HAdV-3 lại
sử dụng thụ thể CD46 để nhận biết tế bào vật chủ [21, 51, 54].
1.5. Các protein vỏ của HAdV
Lớp vỏ capsid của HAdV tương tác với môi trường bên ngoài bởi 3 protein
cấu trúc chính là: fiber, penton và hexon. Ở dạng chức năng trong tự nhiên, các protein
fiber và hexon của HAdV tồn tại ở dạng trimer, còn penton ở dạng pentamer. Vỏ
capsid của mỗi một hạt vi-rút HAdV được tạo thành từ 12 fiber trimer, 12 penton
pentamer, và 240 hexon trimer; mang cấu trúc dạng đa diện 20 mặt cắt. Cấu trúc vỏ
capsid đặc biệt này đã được Waye mô tả đơn giản như trong Hình 1.

Các protein vỏ

Các protein lõi

Hình 1: Mô tả cấu trúc của HAdV [63]

8


1.5.1. Protein fiber của HAdV
Cấu trúc chung của protein fiber của HAdV gồm có 3 phần: đầu tương tác
(fiber knob), trục (fiber shaft) và đuôi (fiber tail). Đầu tương tác chính là phần tiếp
xúc với tế bào vật chủ để mở đầu cho việc xâm nhiễm. Tuy nhiên, fiber không thể
thực hiện được chức năng một mình, mà phải luôn liên kết với protein penton; bộ
phận nắm giữ vai trò đó chính là đuôi fiber (Hình 2A).

A

B

Hình 2: Cấu trúc fiber và sự liên kết với penton
A. Cấu trúc chung protein fiber [71], B. Sự sắp xếp penton trong cấu trúc DF (cắt nửa) [56]

Sự kết hợp của hai protein fiber và penton của HAdV-3 đã được chỉ ra là “chìa
khóa” giúp HAdV bám lên và xâm nhiễm tế bào chủ [6]. Chúng tạo thành cấu trúc
Dodecahedron-fiber (DF) được tổng hợp rất nhiều trong vòng đời của HAdV3,4,7,9,11,15 [18, 56]. Trên thực tế, trong quá trình xâm nhiễm của HAdV-3, cấu trúc
DF còn được tổng hợp nhiều hơn cả các hạt vi-rút hoàn chỉnh. Mỗi DF được cấu
thành từ 12 pentamer penton gắn với 12 trimer fiber tương ứng (Hình 2B). Cơ chế
hoạt động chính xác của DF vẫn chưa sáng tỏ, nhưng đã biết được đầu tương tác fiber
của HAdV-3 nhận biết 2 domain SCR1 và SCR2 của thụ thể CD46, kết hợp với
Penton để “mở đường” chui vào tế bào (Hình 3). Nhiều nhóm nghiên cứu đã ứng

dụng những hiểu biết về cấu trúc DF để tạo ra những vector chuyển gen ở người [17,
18, 31, 42].

9


Hình 3: Sự liên kết giữa fiber và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 [40]
1.5.2. Protein penton của HAdV
Có thể nói penton là protein trung gian giữa hai protein fiber và hexon bởi vì
penton liên kết chặt chẽ với 2 protein này ở những phần cấu trúc riêng biệt: Phần lõi
lõm vào của pentamer penton là đặc điểm thích hợp để gắn protein fiber; còn hình
dáng bên ngoài của penton là “hẹp ở chân, rộng ở đầu” – bắt cặp khít với hình dáng
“hẹp ở đầu, rộng ở chân” của hexon [72]. Đáng chú ý, penton của các chủng HAdV
khác nhau có trình tự axit amin tương đối bảo thủ hơn so với fiber và hexon [72], điều
này thích hợp để lý giải cho những chức năng quan trọng của protein này. Đặc biệt
hơn là penton còn thể hiện thêm nhiều vai trò quan trọng khác khi liên kết với nhiều
thành phần lõi của vi-rút như: protein IIIa và genome [30]. Một nghiên cứu đã chỉ ra
penton là protein đích thứ 2 của các tế bào miễn dịch T (chỉ xếp sau hexon) [57].
Chính vì vậy mà penton được xem là giữ vai trò quan trọng trong tính đặc hiệu và
hiệu quả của các vector chế tạo từ human adenovirus [33].

10


1.5.3. Protein hexon của HAdV
Hexon là protein cấu trúc có kích thước lớn nhất và có số lượng nhiều nhất
trong lớp vỏ của HAdV. Một trimer hexon có cấu trúc không gian dạng lục giác, việc
này giúp chúng có thể liên kết sát nhau và hạn chế các khoảng trống trên bề mặt
capsid. Hơn nữa, protein hexon liên kết chặt chẽ với protein penton để tạo nên cấu
trúc “nhóm sáu” (Group of Six – GOS) giúp liên kết các “nhóm chín” (Group of Nine

– GON) với nhau (GOS và GON là hai đơn vị thành phần tạo nên lớp vỏ 20 mặt của
HAdV) (Hình 4) [9, 30]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: hexon là mục
tiêu nhận biết của hệ miễn dịch để chống lại HAdV [47, 65]. Nghiên cứu năm 2007
của David Onion đã thể hiện rõ ràng sự nhận biết của tế bào miễn dịch CD4+ đối với
hexon chứ không phải fiber hay penton [39]. Các tế bào miễn dịch có thể nhận biết
được hexon là vì protein này có những vùng cấu trúc siêu biến (hypervariable regions
- HVR). Các vùng siêu biến này cũng từng được sử dụng như một đặc điểm riêng biệt
để phân biệt các chủng HAdV khác nhau [50].

Hình 4: Sự liên kết giữa GON và GOS tạo nên vỏ capsid HAdV [8]

11


Như vậy, 3 protein vỏ: fiber, penton, và hexon kết hợp chặt chẽ với nhau để
giúp HAdV tồn tại, lây nhiễm và gây ra nhiều loại bệnh cho con người. Tuy nhiên,
tại Việt Nam, các nghiên cứu sâu về các protein nêu trên còn cực kỳ hạn chế. Luận
văn này là công trình nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của 3 protein fiber, penton, và
hexon ở Việt Nam. Việc phân tích và so sánh với các công bố trên thế giới sẽ chỉ ra
những biến đổi quan trọng trên 3 protein vỏ, giúp HAdV-3 ở Việt Nam có khả năng
lây lan mạnh mẽ.
1.6. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp giải trình tự Sanger
Về cơ bản thì hai phương pháp giải trình tự này sử dụng cùng một cơ chế là:
các nucleotide (gắn huỳnh quang) được sử dụng để tổng hợp nên mạch ADN mới, và
tín hiệu huỳnh quang phát ra được đọc bởi các máy quay siêu nhạy. Điểm khác biệt
lớn nhất là phương pháp Sanger chỉ giải được trình tự của 1 đoạn ADN mỗi lần chạy,
trong khi đó, NGS có thể giải trình tự được hàng triệu đoạn ADN cùng một lúc (kích
thước mỗi đoạn ADN ngắn hơn so với phương pháp Sanger). Chính vì điểm khác biệt
này mà phương pháp NGS có những ưu điểm vượt trội về: thời gian ngắn và lượng
dữ liệu đầu ra rất lớn. Tuy nhiên, NGS chỉ thích hợp để giải trình tự của những hệ

gen lớn (trên 100 gen mỗi lần chạy). Còn trong luận văn này, chúng tôi chỉ giải trình
tự của 3 gen fiber, penton và hexon, nên phương pháp Sanger là lựa chọn tiết kiệm
hơn, phù hợp với điều kiện kinh phí của đề tài. Hơn nữa, giải trình tự Sanger được
xem là tiêu chuẩn vàng với độ chính xác lên tới là 99,99%, và thường được sử dụng
để kiểm tra lại kết quả giải trình tự NGS. Khẳng định này được đưa ra bởi một trong
những công ty hàng đầu thế giới về NGS là ThermoFisher [81].
1.7. Tổng quan về axit amin
Axit amin là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng trong mọi cơ thế
sống. Cấu trúc chung của mỗi axit amin gồm 3 phần: Nhóm chức amin (-NH2), Nhóm
axit cacboxylic (-COOH) và một nhóm thay thế (gọi là R). Ba bộ phận này được kết
nối bởi một nguyên tử Cacbon tại vị trí α (Hình 5).

12


Nhóm thay thế R

Nhóm Amin

Nhóm Axit cacboxylic
Hình 5: Cấu trúc axit amin [59]

Trong đó, các tính chất vật lý và hóa học nhóm R chính là yếu tố quyết định
những đặc điểm riêng biệt của mỗi axit amin, từ đó tạo ra các chức năng, vai trò riêng
của mỗi chuỗi polypeptide (cấu trúc bậc 1 của protein, mục 1.7) [59, 80]. Chính từ
những tính chất của nhóm R, 20 axit amin được tổng hợp trong cơ thể người được
chia thành 4 nhóm chính: axit amin không phân cực, axit amin phân cực tích điện âm,
axit amin phân cực tích điện dương, và axit amin phân cực trung tính [80]. Thông
thường, các axit amin không phân cực cũng sẽ được xếp vào nhóm kỵ nước, còn axit
amin phân cực sẽ có tính ưa nước [59].

Để có thể đánh giá được độ mạnh-yếu những tính chất của các axit amin, hai
chỉ số thường được sử dụng nhất là: giá trị pI và chỉ số H. Bảng 2 trình bày các giá
trị cụ thể của giá trị pI theo tiến sỹ Allison Soult [80], và chỉ số H theo nghiên cứu
của Jack Kyte [28].

13


Bảng 2: Giá trị pI và chỉ số pH của các axit amin
Axit amin

Giá trị pI

Chỉ số H

Alanine (A)

6,11

1,8

Arginine (R)

10,76

Asparagine (N)

Axit amin

Giá trị pI

Chỉ số H

Leucine (L)

6,04

3,8

-4,5

Lysine (K)

9,47

-3,9

5,41

-3,5

Methionine (M)

5.74

1,9

Aspartate (D)

2,87

-3,5

Phenylalanine (F)

5,91

2,8

Cysteine (C)

5,02

2,5

Proline (P)

6,30

-1,6

Glutamine (Q)

5,65

-3,5

Serine (S)

5,68

-0,8

Glutamate (E)

3,08

-3,5

Threonine (T)

5,60

-0,7

Glycine (G)

6,06

-0,4

Tryptophan (W)

5,88

-0,9

Histidine (H)

7,64

-3,2

Tyrosine (Y)

5,63

-1,3

Isoleucine (I)

6,04

4,5

Valine (V)

6,02

4,2

Một cách đơn giản, khi so sánh chỉ số pI với pH của môi trường, axit amin nào
có giá trị pI càng cách xa pH thì càng phân cực mạnh (mang tính axit (tích điện âm)
nếu pI < pH và mang tính bazơ (tích điện dương) nếu pI > pH). Đối với chỉ số H, theo
nghiên cứu của Jack Kyte [28], khi H càng lớn thì axit amin càng kỵ nước, càng nhỏ
thì càng ưa nước. Nói cách khác, H lớn thì axit amin dễ tan trong nước và ngược lại.
Các nhóm chức amin và cacboxylic cũng có một chức năng rất quan trọng là
tạo phản ứng trùng hợp để tạo ra chuỗi polypeptide. Khi nhóm chức amin của 1 axit
amin tiếp cận với nhóm chức cacboxylic của 1 axit amin khác, chúng tương tác với
nhau trong phản ứng khử nước, và tạo ra liên kết peptide nối 2 axit amin lại với nhau.

Quá trình phản ứng này lặp lại nhiều lần sẽ tạo ra một chuỗi polypeptide có một đầu
mang nhóm amin tự do, một đầu mang nhóm cacboxylic tự do. Chuỗi liên kết các
nhóm amin và cacboxylic được gọi là “xương sống” của chuỗi polypeptide. Thông
thường, mỗi chuỗi polypeptide này bao gồm dưới 1.000 axit amin và được coi là một
protein ở dạng cấu trúc bậc 1 [59].

14


1.8. Cấu trúc của protein
Có tất cả 4 dạng cấu trúc của protein. Dạng cơ bản nhất chính là chuỗi
polypeptide như đã nêu trên, tuy nhiên, protein chưa thể thực hiện được các chức
năng sinh học khi tồn tại ở dạng này. Vì vậy mà các chuỗi polypeptide cần phải cuộn
gập theo nhiều cách khác nhau để hình thành những cấu trúc không gian bậc cao hơn,
tùy thuộc vào các axit amin thành phần và trật tự sắp xếp của chúng.
Một protein ở dạng cấu trúc bậc 2 là một chuỗi polypeptide đã hình thành
những đoạn cuộn xoắn α, hoặc nếp gấp β, hoặc kết hợp cả hai. Điểm chung của hai
dạng cấu trúc này là hình thành liên kết hydro giữa các nguyên tử nằm trên “xương
sống” của chuỗi polypeptide. Sự khác biệt nằm ở chỗ, dạng xoắn α xuất hiện khi các
axit amin thứ 4, 8, 12, 16,… trên cùng một chuỗi polypeptie liên kết với nhau bằng
liên kết hydro. Còn dạng nếp gấp β hình thành khi các đoạn của chuỗi polypeptide
liên kết với nhau bằng liên kết hydro theo phương song song và hướng ngược chiều
(Hình 6). Trên thực tế, mỗi loại protein sẽ có tỉ lệ cuộn xoắn α và nếp gấp β khác
nhau. Ví dụ như protein α-keratin có phần lớn cấu trúc cuộn xoắn theo kiểu α để cấu
tạo nên các sợi tóc; ngược lại, phần lớn các protein trong tơ nhện lại liên kết với nhau
theo dạng nếp gấp β [59].

Hình 6: Cấu trúc chuỗi xoắn α và nếp gấp β [3]

15

Cấu trúc bậc 3 của protein đã có sự tham gia của các liên kết giữa các nhóm
R. Cần kể đến trước tiên là liên kết kỵ nước giữa các nhóm R kỵ nước của các axit
amin trên cùng chuỗi polypeptide. Vì các nhóm R kỵ nước có xu hướng quay vào bên
trong trung tâm protein, khi chúng tiến đến gần nhau, lực tương tác van der Waals đã
giữ chúng lại để tạo thành liên kết kỵ nước (Hình 7). Một liên kết khác bền vững hơn
tạo nên cấu trúc bậc 3 của protein là cầu disunfua. Vì axit amin Cysteine có nhóm R
mang gốc sunfit (–SH) tự do, nên khi các cấu trúc cuộn gập khác đưa 2 axit amin này
được đưa lại gần nhau, hai gốc sunfit sẽ phản ứng với nhau tạo ra cầu disunfua (-SS-) (Hình 7).

Hình 7: Liên kết kỵ nước và cầu disulfua trong cấu trúc bậc 3 của protein [59]
Với các liên kết nêu trên, hầu hết các protein đã đạt được cấu trúc để thực hiện
được chức năng sinh học của mình. Chỉ có một số trường hợp đặc biệt, hai hoặc
nhiều hơn các chuỗi polypeptide bậc 3 tập hợp lại với nhau để hình thành một đại
phân tử protein lớn hơn, chúng được gọi là protein bậc 4. Một protein bậc 4 điển hình
được tìm thấy trong cơ thể người là collagen, và chúng chiếm khoảng 40% tổng số
protein trong cơ thể: da, xương, gân,… [59].
Có thể thấy, mỗi axit amin đơn lẻ đều đóng góp chung vào sự hình thành cấu
trúc của protein. Ở người, chỉ một biến đổi axit amin có thể gây ra những bệnh lý
nguy hiểm. Ví dụ như bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm do codon GAG trên gen β-

16


globin bị biến đổi thành codon GTG, dẫn đến việc axit amin Glutamate (E) bị thay
thế bằng axit amin Valine (V) tại vị trí số 6 [11]. Hay trong nghiên cứu năm 2012,
chỉ với một biến đổi SNP trên gen LMNA, khiến axit amin thứ 527 của protein này là
Arginine (R) bị thay thế bởi axit amin Leucine (L), đã dẫn đến sự biểu hiện cùng lúc
của hội chứng loạn sản và già trước tuổi [1]. Các ví dụ trên là dẫn chứng rõ ràng cho

những tác động nghiêm trọng tới cấu trúc và chức năng của protein khi có một axit
amin bị mất đi, thêm vào hoặc thay thế [12, 44]. Các thực thể sống như vi-rút cũng
không phải là ngoại lệ, mỗi axit amin bị thay thế có thể mang đến những tác động
đáng kể tới chức năng các protein của chúng. Những tác động này sẽ đem lại nguy
hiểm cho con người nếu như chúng giúp vi-rút tăng cường sức sống và độc lực. Mặt
khác, như đã đề cập phía trên, hệ gen của HAdV có khả năng biến đổi rất nhanh và
các chủng liên tục biến đổi, tái tổ hợp với nhau. Vậy nên, việc đi trước đón đầu, theo
dõi và đánh giá sớm các biến đổi trong trình tự axit amin của các protein vỏ của
HAdV sẽ giúp ích lớn cho hiểu biết chung về loại vi-rút phổ biến này, tiến tới tìm
cách phòng tránh, điều trị các bệnh do HAdV gây ra.
1.9. Phương pháp phân tích mô phỏng cấu trúc protein
1.9.1. Khái niệm mô phỏng tương đồng
Mô phỏng tương đồng (Homology modeling) là việc tạo dựng một mô hình ở
mức độ phân tử của một protein đích (dựa trên trình tự axit amin của protein đó và
cấu trúc 3D thực nghiệm của một trình tự tương đồng). Trong luận văn này, chúng
tôi tạm gọi trình tự tương đồng đó là “Trình tự khuôn”. Cấu trúc 3D của một protein
đã được chứng minh là bảo thủ hơn so với trình tự axit amin của chính protein đó
[10]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc protein theo phương pháp mô phỏng tương đồng
là cách hiệu quả hơn để đánh giá được những biến đổi trong trình tự axit amin của
protein. Trên thực tế, phương pháp này cũng đang là phương pháp chính xác nhất để
mô phỏng cấu trúc 3D của protein và được sử dụng rất nhiều trong những nghiên cứu
ứng dụng thực tiễn.

17