Tạp chí Khoa học – Công nghệ thủy sản: Số 2/2020

ISSN 1859 - 2252

Số

2 - 2020

NHA TRANG UNIVERSITY

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


TẠP CHÍ

KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ THỦY SẢN
ISSN 1859 - 2252
TỔNG BIÊN TẬP
TS. TRẦN DỖN HÙNG
PHĨ TỔNG BIÊN TẬP
TS. VŨ KẾ NGHIỆP
BAN BIÊN TẬP
PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Anh
Trường Đại học Nha Trang

GS. TS. Augustine Arukwe

PGS. TS. Lê Phước Lượng
Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Nguyễn Đình Mão

Norwegian University of Science and Technology, Trondheim,

Norway

Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

Trường Đại học Nha Trang

Trường Đại học Nha Trang

TS. Phan Thị Dung
Trường Đại học Nha Trang

TS. Nguyễn Hữu Dũng
Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Nguyễn Tiến Dũng
Trường ĐH Kinh tế Luật- ĐHQG Tp HCM

PGS. TS. Nguyễn Văn Duy
Trường Đại học Nha Trang

PGS.TS. Nơng Văn Hải
Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

PGS. TS. Lê Văn Hảo
Trường Đại học Nha Trang

TS. Nguyễn Thị Hiển
Trường Đại học Nha Trang

TS. Nguyễn Văn Hòa
Trường Đại học Nha Trang

GS. TS. Hồng Đình Hòa
Trường ĐH Bách khoa Hà Nội

GS. TS. Nguyễn Trọng Hồi
Trường ĐH Kinh tế Tp. HCM

PGS. TS. Lê Minh Hồng
Trường Đại học Nha Trang

TS. Mai Thị Tuyết Nga
PGS. TS. Ngơ Đăng Nghĩa
Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Nguyễn Văn Nhận
Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Nguyễn Hữu Ninh
Viện Nghiên cứu NTTS I - Bộ NNPTNT

PGS. TS. Mai Thanh Phong
Trường ĐH Bách khoa - ĐHQG Tp. HCM

GS. TS. Nguyễn Thanh Phương
Đại học Cần Thơ

PGS. TS. Trần Gia Thái

Trường Đại học Nha Trang

GS. TS. Trương Bá Thanh
Đại học Đà Nẵng

PGS. TS. Phạm Hùng Thắng
Trường Đại học Nha Trang

TS. Khổng Trung Thắng
Trường Đại học Nha Trang

TS. Hồng Văn Tính
Trường Đại học Nha Trang

GS. TS. Toshiaki Ohshima
Tokyo University of Marine Science and Technology,
Japan

TS. Hồng Hoa Hồng

PGS. TS. Trang Sĩ Trung

Trường Đại học Nha Trang

Trường Đại học Nha Trang

PGS. TS. Lại Văn Hùng

PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn

Trường Đại học Nha Trang

Trường Đại học Nha Trang

GS. TS. Nguyễn Ngọc Lâm
Viện Hải dương học - Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam

GS. TS. Yew-Hu Chien
National Taiwan Ocean University, Taiwan

GS. TS. Nguyễn Kế Tuấn
Trường Đại học Kinh tế quốc dân Hà Nội

PGS. TS. Đỗ Thị Thanh Vinh
Trường Đại học Nha Trang

BAN THƯ KÝ
ThS. Trần Nhật Tân - ThS. Lương Đình Duy

•
•
•
•
•
•
•

Tòa soạn
: Trường Đại học Nha Trang, số 02 Nguyễn Đình Chiểu, TP. Nha Trang - Khánh Hòa
Điện thoại

: 0258.2220767
Fax: 0258.3831147
E-mail:
Giấy phép xuất bản : 292/GP-BTTTT ngày 3/6/2016
Chế bản tại
: Phòng Khoa học và Công nghệ - Trường Đại học Nha Trang
In tại
: Công ty cổ phần In và Thương mại Khánh Hòa, số 08 Lê Thánh Tôn - Nha Trang


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

MUÏC LUÏC
Ghi nhận mới và mối quan hệ tiến hóa của Epiphyte (Melanothamnus thailandicus) trên
rong sụn (Kappaphycus alvarezii) tại Khánh Hòa
Đặng Thúy Bình, Khúc Thị An,
Văn Hồng Cầm, Trần Văn Tuấn
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình thủy phân sụn cá mập
(Carcharhinus dussumieri)
Đinh Hữu Đông, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thị Mỹ Trang
Nghiên cứu đặc điểm sinh học tinh sào cá khế vằn (Gnathanodon speciosus)
Hứa Thị Ngọc Dung, Đào Thị Đoan Trang, Phạm Quốc Hùng
Giáp xác, sán dây và giun tròn ký sinh ở cá diếc (Carassius auratus auratus (Linnaeus,
1758)) thu tại Phú Yên
Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn Nhất Duy
Tiềm năng, thực trạng và giải pháp phát triển nuôi tôm trên cát ở tỉnh Hà Tĩnh
Trương Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Hữu Nghĩa, Nguyễn Thị Nguyện,
Tống Trần Huy, Chu Chí Thiết, Lê Thị Mây và Phan Thị Vân

Ảnh hưởng của nước thải từ ương tôm giống tới tỷ lệ sống, sinh trưởng và sinh sản của
Artemia
Nguyễn Đình Huy, Trương Thị Bích Hồng, Lư Thị Ngọc Nhanh
Kết quả nghiên cứu xây dựng giải pháp chuyển đổi nghề lưới kéo của huyện Vân Đồn, tỉnh
Quảng Ninh khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ sang nghề nuôi biển
Phan Trọng Huyến, Đỗ Đình Minh, Hoàng Văn Tính
Thành phần hoá học cơ bản và một số tính chất vật lý của cá ngừ đại dương đánh bắt tại
Việt Nam
Mai Thị Tuyết Nga, Lê Thiên Sa, Lương Đức Vũ, Lê Văn Luân
Nghiên cứu thực trạng nghề lưới kéo hoạt động khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ
huyện Vân Đồn tỉnh Quảng Ninh
Đỗ Đình Minh, Hoàng Văn Tính, Phan Trọng Huyến
Thành phần loài và các loại nghề khai thác cá ở đầm Đông Hồ, Hà Tiên tỉnh Kiên Giang
Lê Thị Thu Thảo, Nguyễn Phi Uy Vũ
Ảnh hưởng của tần suất cho ăn đến cá bè đưng (G. Speciosus forsskål, 1775) ở giai đoạn
đầu nuôi thương phẩm

2

10

19
26

34

40

49

59

68

79
90

Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung
Đa dạng thành phần loài cá ở hạ lưu sông Cái, Nha Trang

97

Trần Công Thịnh, Võ Văn Phú,
Nguyễn Phi Uy Vũ, Bùi Đức Lỉnh
112
Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị đo áp suất phun nhiên liệu trên đường ống cao áp để
chẩn đoán trạng thái kỹ thuật của động cơ diesel máy chính tàu cá

Hồ Đức Tuấn, Đoàn Phước Thọ
VẤN ĐỀ TRAO ĐỔI
Một vài khía cạnh quản lý môi trường đối với hoạt động nuôi trồng thủy sản
119
Nguyễn Văn Quỳnh Bôi, Lục Minh Diệp


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

GHI NHẬN MỚI VÀ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA CỦA

EPIPHYTE (Melanothamnus thailandicus) TRÊN
RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) TẠI KHÁNH HÒA
NEW RECORD AND THE MOLECULAR PHYLOGENY OF
EPIPHYTE (Melanothamnus thailandicus) ON RED ALGAE (Kappaphycus alvarezii) IN
KHANH HOA
Đặng Thúy Bình¹, Khúc Thị An¹,
Văn Hồng Cầm¹, Trần Văn Tuấn¹
¹Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang
Tác giả liên hệ: Đặng Thúy Bình (Email: )
Ngày nhận bài: 25/03/2020; Ngày phản biện thông qua: 21/05/2020; Ngày duyệt đăng: 17/06/2020

TÓM TẮT
Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty) là loài rong có giá trị kinh tế cao, phân bố ở vùng biển Châu
Á Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Trong những năm gần đây, nghề nuôi rong sụn phát triển ở các
tỉnh Miền Trung góp phần xóa đói giảm nghèo. Tuy nhiên, bệnh do rong phụ sinh (epiphyte) ảnh hưởng đến
sản lượng và chất lượng rong sụn. Mẫu rong sụn nhiễm epiphyte được thu tại vịnh Cam Ranh và Vân Phong,
Khánh Hòa. Epiphyte được khảo sát và định loại dựa trên đặc điểm hình thái, kiểm chứng phân loại và khảo
sát mối quan hệ tiến hóa bằng chỉ thị rbcL của DNA lục lạp. Nghiên cứu phát hiện dạng true epiphyte (u lồi
dạng sợi), định loại và ghi nhận mới Melanothamnus thailandicus, ở Việt Nam và trên song sụn. Trình tự rbcL
của epiphyte thể hiện sự tương đồng cao (99,98%) với loài M. thailandicus phân bố ở Thái Lan. Cây phát sinh
loài cho thấy M. thailandicus ở Khánh Hòa và Thái Lan sắp xếp cùng nhánh, và cùng với các loài thuộc giống
Melanothamnus tạo thành nhánh đồng dạng. Nghiên cứu định loại chính xác epiphyte, khảo sát mối quan hệ
phát sinh loài, bổ sung thành phần loài rong của Việt Nam, và góp phần phát hiện sớm tác nhân gây bệnh trong
nghề nuôi rong sụn.
Từ khóa: Rong sụn, Epiphyte, Kappaphycus alvarezii, Melanothamnus, Khánh Hòa
ABSTRACT
Kappaphycus alvarezii Doty is a species of red algae with high economic value, distributed in Asia Pacific
waters, including Vietnam. In recent years, seaweed farming has rapidly developed in the Central Provinces,
contributing to poverty reduction. However, parasitic epiphyte affects the yield and quality of K. alvarezii.
Samples of epiphyte infected K. alvarezii were collected in Cam Ranh and Van Phong Bays, Khanh Hoa.

Epiphyte was investigated and identified based on morphological characteristics. Taxonomic verification and
molecular phylogeny were examined by rbcL gene of Chloroplast DNA. The study discovered a true epiphyte,
identified as Melanothamnus thailandicus, a new record in Vietnam, and on K. alvarezii. The rbcL sequence
of M. thailandicus exhibits a high similarity (99.98%) with this species distributed in Thailand. Phylogenetic
tree showed that M. thailandicus in Khanh Hoa and Thailand were clustered in the same clade, and together
with species of the genus Melanothamnus formed monophyletic lineage. Curent research identified parasitic
epiphyte on K. alvarezii, examined the molecular phylogeny, contributing to update list of seeweed species in
Vietnam, as well as early pathogen detection for seaweed aquaculture.
Key words: Red algae, Epiphyte, Kappaphycus alvarezii, Melanothamnus, Khanh Hoa

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty)
sinh trưởng tự nhiên ở vùng biển Châu Á Thái
Bình Dương, nhất là vùng Đông Nam Á. Rong
2 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

sụn có giá trị kinh tế cao, dùng để chế biến
carrageenan, một chế phẩm được ứng dụng
rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến
thực phẩm, y dược, mỹ phẩm. Nghề trồng rong


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
sụn hiện nay đem lại lợi ích kinh tế khá lớn
cho nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các
nước Đông Nam Á như Philippines, Malaysia,
Indonesia và Việt Nam với tổng sản lượng lên
đến 95% tổng sản lượng rong sụn khô tiêu thụ
trên toàn thế giới, ước chừng khoảng 160.000
tấn khô/ năm [3,12].

Khánh Hòa với lợi thế đường bờ biển dài
200 km, với hơn 200 hòn đảo lớn nhỏ, nhiều
vũng, vịnh lớn (Vân Phong, Nha Trang, Cam
Ranh), có khí hậu ôn hòa là điều kiện thuận lợi
để nuôi trồng rong sụn [2,3]. Tuy nhiên, hiện
nay nghề trồng rong sụn đang phải đối mặt với
rất nhiều khó khăn và thách thức như nguồn
giống và chất lượng giống không đảm bảo,
năng suất và chất lượng rong giảm, đặc biệt khí
hậu thay đổi phức tạp (cường độ ánh sáng tăng,
độ mặn nước biển cao, mực nước biển dâng) do
ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu làm
dễ dẫn đến bùng phát các dịch bệnh như bệnh
ice-ice (bệnh trắng lũn thân) và bệnh epiphyte
(rong tảo phụ sinh) trên rong nuôi [4].
Các nghiên cứu trên thế giới về bệnh
epiphyte cho thấy epiphyte gây ảnh hưởng rất
lớn đến năng suất và chất lượng của rong sụn
[8,17]. Các công bố đã chỉ ra mùa vụ là nhân tố
chính ảnh hưởng đến việc bùng phát dịch bệnh
do epiphyte và gây nhiễm khuẩn thứ cấp ở rong
sụn [13,20,22].
Ở Việt Nam các nghiên cứu chủ yếu tập
trung vào các kỹ thuật nuôi trồng và chiết suất
carrageenan từ rong sụn [2,3,5]. Epiphyte
hiện diện thường xuyên và là một thành phần

Số 2/2020
quan trọng trong hệ sinh thái biển [6]. Đối
với nghề nuôi rong sụn, bệnh trắng lũn thân

(ice-ice disease) đã ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của rong sụn [1,4]. Tuy
nhiên, các nghiên cứu về bệnh do epiphyte
vẫn còn hạn chế.
Trong những thập kỷ gầm đây, chỉ thị
phân tử được sử dụng rộng rãi trong phân loại
sinh vật. Đối với thực vật, chỉ thị Ribulose
bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL)
của DNA lục lạp chứng tỏ là công cụ hữu hiệu
trong định loại và khảo sát mối quan hệ phát
sinh loài, đặc biệt đối với rong biển [16], trong
đó có rong phụ sinh [9,15].
Nghiên cứu hiện tại định loại và khảo sát
mối quan hệ tiến hóa với ghi nhận mới loài
rong nâu dạng sợi sống phụ sinh trên rong sụn
dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền. Phát
hiện này bổ sung dữ liệu về thành phần rong
phụ sinh trên rong sụn, góp phần phát hiện sớm
mầm bệnh trong phát triển nghề nuôi rong.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CƯU
1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu
Mẫu rong sụn được thu tại các vị trí khác
nhau, trải đều trên diện tích nuôi trồng của
các hộ nuôi tại Cam Phúc Bắc (11º58’7’’N,
109º12’8’’E), Cam Ranh - Khánh Hòa (50
mẫu) và Vịnh Vân Phong (12º39’38”N,
109º20’47”E), Vạn Ninh, Khánh Hòa (50 mẫu)
từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018
(Hình 1).

Hình 1. Bản đồ thu mẫu (a) rong sụn nhiễm epiphyte (b) tại Khánh Hòa. Khung hình vuông màu xanh
chỉ khu vực thu mẫu (Địa điểm được chi tiết tại vịnh Vân Phong và Cam Ranh).
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 3


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Các mẫu rong sau khi thu được bao bọc
bằng giấy báo, sau đó vận chuyển về phòng thí
nghiệm trong các thùng xốp được làm ẩm (nhiệt
độ 22 ± 2ºC) bằng nước biển. Mẫu rong sau đó
được lưu giữ trong các bể kính (80/50/30 cm)
chứa nước biển, chiếu sáng tự nhiên, và sục khí.
Mẫu rong được được rửa sạch lần nữa bằng bàn
chải mềm và bảo quản trong formalin 5% (đệm
nước biển, pH 7.8, độ mặn 30 ppt) [20].
2. Định loại epiphyte bằng phương pháp
hình thái và di truyền
2.1. Định loại epiphyte bằng đặc điểm hình thái
Sử dụng dao lam cắt những lát cắt mỏng
<0,1mm trên thân rong tại những vị trí nhiễm
epiphyte (có biểu hiện chấm đen, phồng lên
hoặc lộ lông). Lát cắt được quan sát dưới kính
hiển vi quang học (Olympus DP50) ở các độ
phóng đại 100 - 400 [20]. Sau đó dùng panh,
kẹp và kim nhỏ để gỡ các epiphyte ra khỏi thân
rong và quan sát dưới kính hiển vi quang học
(Olympus DP50). Epiphyte được định loại dựa
theo Trono (1999) [19] và Muangmai et al.
(2014) [15].

2.2. Định loại epiphyte bằng phương pháp
sinh học phân tử
Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số
Mẫu rong phụ sinh được thu nhận trong ống
ly tâm ependorf 1,5ml, nghiền trong Nitơ lỏng
thành dạng bột mịn. Sau đó, DNA tổng số được
tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic
DNA Purification System (Promega, Mỹ) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất có hiệu chỉnh. Ở
bước thu hồi, thay vì rửa giải một lần duy nhất
với thể tích 250 μl Nuclease-Free Water, tiến
hành rửa giải 3 lần với 70 μl AE Buffer nhằm
thu được DNA có chất lượng tốt và nồng độ cao.
Sản phẩm tách chiết DNA tổng số được điện
di trên gel agarose 1,5% bằng hệ thống điện
di ngang (Biorad), nhuộm Ethidium bromide
và quan sát bằng thiết bị UV Transilluminator
(M-20E, Mỹ).
Khuếch đại đoạn gen rbcL của DNA lục lạp và
giải trình tự
Nghiên cứu tiến hành phản ứng PCR
khuếch đại đoạn gen Ribulose bisphosphate
carboxylase large subunit (rbcL) của DNA lục
lạp sử dụng cặp mồi F57-5'-GTA ATT CCA

4 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Số 2/2020
TAT GCT AAA ATG GG-3' và R1381-5'ATC
TTT CCA TAG ATC TAA AGC-3' [10]. Phản

ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích
25 μL gồm: 5 μl Green Gotaq® Flexi Buffer
(Promega) 5X, 3 μl MgCl2 25mM, 1 μl dNTPs
10mM, 1 μl mỗi mồi (10 mM), 0,2 μl GoTaq
polymerase (5 U/μl), 5 μl ADN và nước cho
đủ thể tích. Thành phần phản ứng được hiệu
chỉnh bằng cách cho thêm PEG 10% và bột
Skim Milk 0.,% (W/v) (mỗi loại 0,5 μl) để
tăng độ nhạy của phản ứng [7]. Phản ứng
được chạy trên máy luân nhiệt C1000 Touch
(Bio-Rad) theo chu trình nhiệt độ như sau:
Biến tính ban đầu tại 94ºC trong 3 phút; sau đó
là 38 chu kỳ của 94ºC trong 45 giây, nhiệt độ
bắt cặp 49ºC trong 50 giây, 72ºC trong 1 phút;
cuối cùng là bước kéo dài tại 72ºC trong 10
phút và giữ mẫu ở 4ºC. Sản phẩm PCR được
giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles
dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1,
Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương
tự như phản ứng PCR theo chương trình luân
nhiệt như sau: 96ºC trong 20 giây, 50ºC trong 20
giây, cuối cùng là 60ºC trong 4 phút. Sản phẩm
sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism
3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems) tại
Công ty 1st Base, Singapore.
3. Kiểm chứng phân loại và xây dựng mối
quan hệ phát sinh chủng loại
Trình tự của mẫu rong phụ sinh được kết
nối sử dụng tính năng Contig Expres thuộc
phần mềm Geneious Pro v.5.5.7 [14]. Sau đó,

các trình tự được kiểm chứng bằng chương
trình BLAST Nucleotide trên website của
Ngân hàng quốc tế Genbank. Trình tự rong phụ
sinh thu được và các trình tự cùng loài và giống
có trên Genbank được dóng hàng và so sánh sự
khác biệt di truyền dựa trên phần mềm Bioedit
[11].
Mối quan hệ phát sinh loài của epiphyte
được khảo sát dựa trên trình tự loài rong thu
được (loài Melanothamnus thailandicus), trình
tự cùng loài (3 trình tự), 10 trình tự của loài
cùng giống (trước kia được dịnh danh là giống
Neosiphonia), và 4 trình tự loài khác giống
(Polysiphonia spp.) trên Genbank. Thông
tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
genbank được trình bày ở Bảng 1. Phân tích
được tiến hành dựa trên thuật toán Neighbour
Joining (NJ), với giá trị tin cậy (Bootstrap –

Số 2/2020
BT) là 1000 sử dụng phần mềm Mega 7.0 [18].
Spyridiocolax capixaba và Spyridia clavata
(Spyridiaceae) được sử dụng làm nhóm ngoại.

Bảng 1. Thông tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số Genbank của các loài epiphyte. Tên loài
được liệt kê theo Genbank. Tên loài cập nhật được mô tả ở hình 6.

1
2
3
4
5
6

Địa điểm thu
mẫu
Melanothamnus thailandicus Việt Nam
Neosiphonia thailandica
Thái Lan
Neosiphonia yongpilii
Hàn Quốc
Neosiphonia yendoi
Hàn Quốc
Neosiphonia sphaerocarpa Hàn Quốc
Neosiphonia japonica
Nhật Bản

7

Neosiphonia tongatensis

Panama

HM573570

8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18

Neosiphonia harlandii

Hàn Quốc
Hàn Quốc
Hàn Quốc
Hàn Quốc
Úc
Canada
Canada
Úc
Tây Ban Nha
Brazil
Panama

DQ787485
DQ787480
KX265441
KX265439
MF101437
MF120858

EU492916
MH101825
JX828142
MH884603
KU756119

STT

Loài

Neosiphonia decumbens

N.teradomariensis
Neosiphonia flavimarina
Melanothamnus harveyi
Polysiphonia pacifica
Polysiphonia stricta
Polysiphonia adamsiae

Polysiphonia atlantica
Spyridiocolax capixaba
Spyridia clavata

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO
LUẬN
1. Định loại dựa trên đặc điểm hình thái
Sau khi quan sát các lát cắt, kết hợp với
quan sát hình thái từng mẫu epiphyte dưới kính
hiển vi quang học, đối chiếu với các tài liệu
về phân loại, nghiên cứu định loại và ghi nhận

mới 1 loài epiphyte trên rong sụn dựa trên đặc
điểm hình thái.
Melanothamnus thailandicus (N. Muangmai
& C.Kaewsuralikhit) Díaz-Tapia & Maggs,
2017
Địa điểm thu mẫu: Vịnh Cam Ranh và Vịnh
Vân Phong, Khánh Hòa
Vật chủ: Gracilaria fisher (Thái Lan),
Kappaphycus alvarezii (Việt Nam, ghi nhận mới)
Dạng Epiphyte (true epiphyte): Đầu tiên,

Mã số Genbank

Nguồn

MT499883
KM502785-87
KT964453
KX265484
KX265479
KX265440

Nghiên cứu hiện tại
Muangmai (2014)
Kim và Kim (2016)
Kim et al. (2016)
Kim et al. (2016)
Kim et al. (2016)
Mamoozadeh và Freshwater
(2012)

Kim và Yang (2006)
Kim và Yang (2006)
Kim et al. (2016)
Kim et al. (2016)
Díaz-Tapia et al. (2017)
Savoie và Saunders (2019)
Stuercke (2006)
Díaz-Tapia et al. (2008)
Bárbara et al. (2013)
Chen et al. (2019)
Won et al. (2019)

epiphyte hình thành các đốm đen li ti, chưa có
hình dạng rõ ràng, xung quanh các đốm đen có
dấu hiệu của sự tổn thương cấu trúc mô, sau đó,
tạo thành các u lồi (Hình 2a), có thể chỉ là các u
lồi có đỉnh đen, ngay tâm hình thành nên dạng
sợi, ban đầu chỉ là sợi nhỏ, nhưng dần dần hình
thành dạng sợi lớn (Hình 2b,c) rồi sau đó có
khả năng phân nhánh tạo dạng cây (Hình 2d).
Đặc điểm hình thái: Kích thước chiều dài
từ 0,3 - 2 cm, trung bình 1,5 ±0,05 (n=30) có
màu nâu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi, thân
chia thành các đốt theo chiều dọc, phân nhánh
ở gốc, dạng chữ Y (Hình 3b,c), có 4 tế bào
quanh tế bào trung tâm ở mỗi đốt (Hình 3b),
nhánh mang bào tử chỉ có 3 tế bào (Hình 3d).
Đỉnh sinh trưởng chia thành 3 thùy, 1 thùy lớn
ở giữa, 2 thùy nhỏ 2 bên (Hình 3a).
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 5

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Hình 2. Các dạng của epiphyte dưới kính hiển vi
soi nổi. a) Dạng u lồi; b và c) Dạng u lồi mọc sợi,
d) Dạng sợi.

2. Kiểm chứng định loại epiphyte bằng
phương pháp sinh học phân tử
2.1. Tách chiết DNA và khuếch đại gen rbcL
của DNA lục lạp
Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ
mẫu epiphyte là 1 băng rõ nét nhưng có vệt
sáng kéo dài (lần rửa giải thứ nhất - E1) do có
nhiều DNA bị đứt gãy, và 1 băng cho dải sáng
mờ hơn nhưng không có vệt sáng kéo dài (lầm

Số 2/2020

Hình 3. Hình thái ngoài của M. thailandicus.
a) Đỉnh sinh trưởng. b) Phân nhánh chữ Y.
c) Phân nhánh ở gốc. d) Nhánh mang bào tử.

rửa giả thứ hai - E2) (Hình 4). Để đảm bảo chất
lượng DNA cho phản ứng PCR, nghiên cứu sử
dụng DNA tách chiết từ mẫu rửa giải E2 để
khuếch đại đoạn gen rbcL.
Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết làm
khuôn, cặp mồi F57 và R1381 [10], sản phẩm

PCR của gen rbcL thu được cho kết quả phù hợp
với tính toán lý thuyết. Các mẫu đều có băng với
kích thước tương ứng 1324 bp (Hình 4).

Hình 4: Hình ảnh điện di DNA tổng số và sản phẩm PCR gen rbcL của loài
Melanothamnus thailandicus
M: Thang chuẩn DNA 100 bp, E1, E2: DNA tổng số ở lần rửa giải 1 và 2, M1, M2:
sản phẩm PCR của M. thailandicus, N: mẫu đối chứng âm.

2.2. Kiểm chứng định loại bằng chỉ thị phân tử
Sản phẩm khuếch đại gen rbcL của loài
M. thailandicus được giải trình tự và dóng
hàng, thu được trình tự dài 1120 bp. Sử dụng
6 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

tính năng Blast, và so sánh trình tự khác
biệt, trình tự loài M. thailandicus thể hiện
sự tương đồng 99,98% (1 sai khác nuceotide
tại vị trí 683 trên 1120 bp). Sự khác biệt di


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
truyền là 0,02 % khi so sánh với các trình tự
của loài này trên Genbank (Hình 5).
M. thailandicus được mô tả bởi Muangmai
et al (2014) [15] với tên loài Neosiphonia
thailandica ở cảng Sri Racha, Vịnh Thái Lan.
Tên loài
M.thailandica
M.thKM502785

M.thKM502787
M.thKM502786

665

675

Số 2/2020
Đặc trưng hình thái cơ bản là các nhánh bào
tử có 3 tế bào xung quanh. Phân tích mối quan
hệ phát sinh loài cho thấy M. thailandicus sắp
xếp chung nhánh với các loài Neosiphonia, và
gần gũi với loài N. sphaerocarpa và P. forfex.
685

695

705

715

CATAGAATAT

AGAAATCTTT CTTTCCAGCG CATAAAAGGC

TGCGAATTAA TGTTTTCATC

CATAGAATAT

AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC

TGCGAATTAA TGTTTTCATC

CATAGAATAT

AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC

TGCGAATTAA TGTTTTCATC

CATAGAATAT

AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC

TGCGAATTAA TGTTTTCATC

Hình 5: Vị trí khác biệt Nucleotide (vị trí 683, in đậm) của trình tự rbcL loài M. thailandicus
so với các trình tự trên Genbank.

Nghiên cứu hiện tại cho thấy sự tương đồng
về mặt hình thái (phân nhánh gốc chữ Y, đỉnh
sinh trưởng có 3 tế bào), và di truyền (tương
đồng là 99,98% dựa trên chỉ thị rbcL của DNA
lục lạp) có thể định loại chính xác loài này là
Melanothamnus thailandicus. Theo Muangmai
et al (2014) [15], M. thailandicus được tìm
thấy trên Gracilaria fisher, vì vậy đây là lần

đầu tiên loài này được ghi nhận trên rong sụn.
2.3. Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài
Melanothamnus thailandicus

Dựa trên trình tự loài M. thailandicus từ
nghiên cứu hiện tại, và các trình tự có sẵn trên
Genbank (Bảng 1), phân tích mối quan hệ phát
sinh loài với giá trị BT trên các nhánh được
biểu hiện ở Hình 6.

Hình 6: Cây phát sinh loài (phương pháp NJ, phần mềm Mega) của các loài Melanothamnus. Giá trị
tin cậy (Boostraps) được biểu hiện trên các nhánh. Hình chữ nhật là loài trong nghiên cứu hiện tại.
Tên mới được cập nhật theo Díaz-tapia et al. (2017) [9]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Trên Hình 6, Loài M. thailandicus (tên cũ
Neosiphonia thailandica) được xếp chung một
nhánh riêng biệt với các loài này thu từ Thái
Lan (BT 100%), giúp khẳng định sự định loại
chính xác và vị trí phân loại của loài. Loài M.
thailandicus cùng với các loài cùng giống tạo
thành một nhánh đồng dạng với giá trị BT cao
(100%). Các loài Melanothamnus spp. thể hiện
mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc giống
Polysiphonia.
Theo Muangmai et al. (2014) [15], N.
thailandica có quan hệ gần gữi với loài
N. sphaerocarpa và Polysiphonia forfex.
Díaz-tapia et al. (2017) [9] đề xuất giống
Melanothamnus (bao gồm các loài của giống
Fernandosiphonia và Neosiphonia, và xếp
3 loài trên vào giống Melanothamnus. Giống

Melanothamnus (gồm 46 loài) đặc trưng bởi
đỉnh sinh trưởng có 3 tế bào. Nguồn gốc tiến
hóa của giống Melanothamnus được ước tính

Số 2/2020
là 75,7 - 95,78 triệu năm trước. Mặc dù phát
sinh trong kỷ Phấn trắng, Melanothamnus
là một giống chủ yếu ở Ấn Độ - Thái Bình
Dương, do đó sự vắng mặt của giống này ở
phía đông bắc Đại Tây Dương hiện vẫn chưa
thể giải thích [9].
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ:
Nghiên cứu ghi nhận mới epiphyte trên
rong sụn. Dựa trên đặc điểm hình thái và di
truyền, nghiên cứu định loại chính xác loài
Melanothamnus thailandicus và khảo sát mối
quan hệ tiến hóa. Cần có nghiên cứu chuyên
sâu và trên diện rộng các dạng/loài epiphyte
trên rong sụn nhằm bổ sung thành phần loài,
tác nhân gây bệnh góp phần phát hiện sớm và
có biện pháp phòng, trừ bệnh thích hợp.
LỜI CẢM TẠ: Nhóm tác giả xin gửi lời cảm
ơn đến Ths. Trương Thị Oanh, và Ths. Trần
Quang Sáng đã hỗ trợ xử lý hình ảnh và số liệu
di truyền.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Bùi Đình Lâm, Định Thị Ngọc Mai, Nguyễn Lâm Anh, Hoàng Thị Lan, Đinh Thị Thu Hằng, Trần Thị Hồng

Hà, Lê Mai Hương, Đặng Diễm Hồng (2010), “Đa dạng sinh học của các loài vi sinh vật cơ hội gây bệnh trắng
nhũn thân (ice – ice disease) trên Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, K. striatum) ở miền trung Việt Nam”. Tạp
chí Khoa học và Công nghệ. 48, Tr. 311–319.
2. Đinh Thị Hải Yến, (2005) “Thử nghiệm trồng rong sụn (Kappapphycus alvarezii Doty) tại Đàm Bấy, Nha
Trang, Khánh Hòa”, Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Toàn Quốc về Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật Lần Thứ
6. Tr. 1828–1833.
3. Huỳnh Quang Năng (2006), “Hoạch định vùng phát triển trồng rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ven biển
phía Nam Việt Nam”. Báo cáo khoa học, Tr. 25-28.
4. Lê Mai Hương, Trần Mai Đức (2010), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh trong
phòng bệnh nhũn thân (ice-ice disease) ở rong sụn Việt Nam”, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học chương
trình CNSH thủy sản.
5. Ngô Thị Thu Thảo, Huỳnh Hàn Châu, Trần Ngọc Hải (2010), “Ảnh hưởng của việc nuôi kết hợp các mật
độ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) với tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei)”. Tạp chí Khoa học, Trường
Đại học Cần Thơ 16a, Tr. 100–110.
6. Nguyễn Hữu Đại (1999), “Rong biển phụ sinh (Epiphyte) trên cỏ biển ở Khánh Hòa”. Tuyển tập Nghiên cứu
biển IX, Tr. 196–204.

Tiếng Anh
7. Arbeli, Z., Fuentes, C.L., (2007), "Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental
samples". FEMS Microbiology Letters 272, pp. 269–275. />
8 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

8. Borlongan, I.A.G., Luhan, M.R.J., Padilla, P.I.P., Hurtado, A.Q., (2016), "Photosynthetic responses of
‘Neosiphonia sp . epiphyte-infected’ and healthy Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta) to irradiance, salinity and
pH variations", Journal of Applied Phycology. 28, pp. 2891–2902 />9. Díaz-tapia, P., Mcivor, L., Freshwater, D.W., Verbruggen, H., Wynne, M.J., Maggs, C.A., Gray, V.S.F.,

(2017). "The genera Melanothamnus Bornet & Falkenberg and Vertebrata S . F . Gray constitute well-defined
clades of the red algal tribe Polysiphonieae". European Journal of Phycology 52, 1–30. />0/09670262.2016.1256436.
10. Freshwater, D.W., Ueness, J., (1994). "Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales,
Rhodophyta) species, based on rbcL nucleotide sequence analysis". Phycologia 33.
11. Hall, T.A., (1999). "BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for
Windows95/98/NT". Nucleic Acids Symposium Series. 41, pp. 95–98.
12. Hayashi, L., Anicia., Hurtado, Msuya, F., Bleicher-Lhonneur, G., Critchley, Alan, (2010). "A Review of
Kappaphycus Farming: Prospects and Constraints, in: Seaweeds and Their Role in Globally Changing Environments".
Springer Dordrecht Heidelberg, London, pp. 254–283. />13. Hurtado, A.., Critchley, A.., (2006). "Seaweed industry of the Phillipines and the problem of epiphytism in
Kappaphycus farming, in: &, Critchley, Ang, P.O. (Eds.)", Advances in Seaweed Cultivation and Utilisation in
Asia. University of Malaya, Kuala Lumpur, pp. 21–28.
14. Kearse, M., Moir, R., Wilson, A., Stones-Havas, S., Cheung, M., Sturrock, S., Buxton, S., Cooper, A.,
Markowitz, S., Duran, C., Thierer, T., Ashton, B., Meintjes, P., Drummond, A., (2012). "Geneious Basic: An
integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data".
Bioinformatics 28, pp. 1647–1649. />15. Muangmai, N., Yamagishi, Y., Maneekat, S., Kaewsuralikhit, C., (2014). "The new species Neosiphonia
thailandica sp. nov. (Rhodomelaceae, Rhodophyta) from the Gulf of Thailand". Botanica Marina. 57, pp.
459–467. />16. Nguyen, X., Nguyen, T., Dao, V., Liao, L., (2019). "New record of Grateloupia taiwanensis S . -M . Lin et
H . -Y . Liang in Vietnam : Evidence of morphological observation and rbc L sequence analysis". Biodiverstas
20, 688–695. />17. Rantetondok, Alexander., Latama, G., (2017). "Epiphytic and Ice-ice Diseases of Seaweed, Kappaphycus
alvarezii and its Effect on Growth Rate and Carrageenan Qualit". International Journal of Aquaculture 7, pp.
134–138. 10.5376/ija.2017.07.0021.
18. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., (2013). "MEGA6: Molecular evolutionary
genetics analysis version 6.0". Moecular Biology and Evoluion 30, pp. 2725–2729. />molbev/mst197.
19. Trono, C., (1999). "Seaweeds, in: Carpenter, K.E. and Niem, V.H. (Ed.)", The Living Marine Resources of the
Western Central Pacific, Vol. 1. FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes. . FAO, Rome, pp. 19–99.
20. Vairappan, C., Chung, CS., Matsunaga, S., (2014). "Effect of epiphyte infection on physical and chemical
properties of carrageenan produced by Kappaphycus alvarezii Doty (Soliericeae, Gigartinales, Rhodophyta)".
Journal of Applied Phycolog 26, pp. 923–931. />21. Vairappan, C.S., (2006). "Seasonal occurrences of epiphytic algae on the commercially cultivated red alga
Kappaphycus alvarezii (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)". Journal of Applied Phycolog 18 (3,. pp.
611–617. />22. Vairappan, C.S., Chung, C.S., Lhonneur, G.B., Critchley, A., (2007). "Distribution and symptoms of

epiphyte infection in major carrageenophyte-producing farms". Journal of Applied Phycolog. https://doi.
org/10.1007/s10811-007-9299-8.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME VÀ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH
THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP (Carcharhinus dussumieri)
EFFECTS OF THE ENZYME CONCENTRATION AND HYDROLYSIS TIME
TO THE PROCESS OF SHARK CARTILAGE (Carcharhinus dussumieri) HYDROLYSIS
Đinh Hữu Đông1, Vũ Ngọc Bội2, Nguyễn Thị Mỹ Trang2
1
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp. HCM
2
Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang
Tác giả liên hệ: Vũ Ngọc Bội (Email: )
Ngày nhận bài: 06/05/2020; Ngày phản biện thông qua: 18/05/2020; Ngày duyệt đăng: 12/06/2020

TÓM TẮT
Bài báo này công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân sụn cá
mập (Carcharhinus dussumieri) bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ
enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng mạnh đến hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa, chondroitin
sulphate và NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain. Kết quả
nghiên cứu cũng cho thấy nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá
mập là 0,3%. Sau 10h thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain với nồng độ enzyme 0,3%,
nhiệt độ thủy phân 50ºC, thủy phân ở pH tự nhiên (6,8), khối lượng mẫu 2kg và tỷ lệ nước bổ sung 2 lít, dịch

thủy phân có hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa, chondroitin sulphate và NNH3 cao gấp 7,06 lần, 3,68 lần,
9,01 lần, 83,42 lần và 1,27 lần so với ban đầu.
Từ khóa: hỗn hợp alcalase - papain, protein, peptide, Naa, NNH3, chodroitin sulphate, sụn cá mập, thủy phân.
ABSTRACT
This paper focused on the research to determine the effect of the enzyme concentration on hydrolyzing
shark cartilage (Carcharhinus dussumieri) by the alcalase-papain enzyme mixture. The results showed that
the enzyme concentration and hydrolysis time strongly affected the content of soluble proteins, peptides, Naa,
chondroitin sulphate, and NNH3 formed in shark cartilage hydrolyzate. The results also indicated that the
alcalase-papain enzyme mixture concentration of 0.3% was suitable for shark cartilage hydrolysis. After 10
hours of shark cartilage hydrolysis by alcalase-papain enzyme mixture at concentration of 0.3%, temperature of
50ºC, natural pH (6.8), sample weight of 2 kilograms and the additional water ratio of 2 liters, the hydrolyzate
had the content of protein, peptide, Naa, chondroitin sulphate, and NNH3 higher than 7.06 times, 3.68 times,
9.01 times, 83.42 times and 1.27 times higher than that in the original.
Key words: mixture of alcalase-papain enzyme, protein, peptide, Naa, NNH3, chodroitin sulphate, shark
cartilage, hydrolysis.

I. MỞ ĐẦU
Từ xưa người ta đã biết sụn cá mập có khả
năng làm sáng mắt, khả năng ức chế sự hình
thành các vi mao mạch tân sinh nên có thể hạn
chế các khối u, có khả năng ức chế hệ miễn dịch
nên giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như
đau nhức xương, vẩy nến, ... [5]. Sụn cá mập có
chứa chondroitin sulfat là thành phần chiếm tỷ
lệ chính tạo nên cấu trúc của mô sụn, hoạt dịch
bao quanh khớp, giúp bôi trơn sụn khớp [6].
Do vậy, sụn cá mập còn thường được điều chế
10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

thành các loại thực phẩm chức năng hỗ trợ điều

trị các bệnh về xương khớp và mắt [6]. Tuy
vậy, mô sụn nói chung và sụn cá mập nói riêng
thường được cấu trúc bởi các protein không tan
trong nước nên con người rất khó hấp thụ các
chất từ mô sụn [3, 5, 6, 7, 10]. Chúng tôi tiến
hành nghiên cứu thu nhận các chất tự nhiên từ
sụn cá mập bằng phương pháo thủy phân sụn
cá mập tươi bằng phương pháp thủy phân sử
dụng enzyme protease và thu dịch thủy phân
định hướng cho việc sử dụng làm thực phẩm


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
hỗ trợ phòng chống thoái hóa sụn khớp. Trong
bài báo này, chúng tôi tiếp tục công bố nghiên
cứu về ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp enzyme
alcalase - papain và thời gian thủy phân đến
quá trình thủy phân sụn cá mập.
II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu
1.1. Sụn cá mập:
Cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri

Số 2/2020
(Muller & Henle, 1839)) được thu mua nguyên
con tại các tầu khai thác tại vùng biển Khánh
Hòa. Cá tươi có trọng lượng trung bình 4060kg/con. Cá mập được khai thác trong thời
gian từ tháng 3÷7 và tháng 9÷12 hàng năm.
Sau thu mua, thu toàn bộ vây cá, sụn cá và vận

chuyển về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí
nghiệm, tiến hành xử lý loại bỏ thịt, mô liên
kết, làm sạch, cấp đông và bảo quản đông ở
-20ºC để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu.

Hình 1. Hình ảnh về sụn cá mập (Carcharhinus dussumieri) đã xử lý.

1.2. Enzym alcalase
Enzym alcalase 2.4L là chế phẩm protease
thương mại do hãng Novozyme - Đan Mạch
cung cấp. Alcalase thuộc nhóm enzyme serine
endopeptidase có các đặc tính kỹ thuật như
sau: pH thích hợp trong khoảng 6 - 8, nhiệt độ
thích hợp 30 - 65ºC, hoạt tính 2,4AU/g được
bảo quản ở 0 - 5ºC.
1.3. Enzym papain: Papain thương mại có hoạt
tính ≥2,0 mAnsonU/mg (cơ chất hemoglobine,
pH 6, nhiệt độ 35,5ºC) do Merck - Đức sản
xuất. Papain là một enzyme chịu được nhiệt độ
tương đối cao. Ở dạng nhựa khô, papain không
bị biến tính trong 3 giờ ở 100ºC, còn ở dạng
dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút
ở 82,5ºC. Papain có pH thích hợp 4,5 - 8,5, dễ
bị biến tính ở pH<4,5 và ở pH >12.

2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Các phương pháp phân tích:
* Định lượng Nitơ axit amin (Naa): theo
TCVN 3708-1990 Thủy sản- Phương pháp xác
định hàm lượng Nitơ amin.

* Định lượng Nitơ ammoniac (NNH3): theo
TCVN 3706-1990 Thủy sản – Phương pháp
xác định hàm lượng Nitơ ammoniac.
* Xác định hoạt độ protease theo phương
pháp Anson [1, 2, 9]
Nguyên tắc của phương pháp: dùng protein
casein làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân
protein của enzyme protease trên cơ sở định
lượng sản phẩm được tạo thành trong phản
ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để
định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
thành dưới tác dụng của enzyme.
- Định lượng protein hòa tan theo phương
pháp Lowry [1, 9]:
Nguyên tắc của phương pháp là các axit
amin có vòng thơm, Tyr và Trp có mặt trong
protein sẽ phản ứng với thuốc thử FolinCiocalteau tạo thành phức chất màu xanh đen
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 650nm. Dựa
vào đường chuẩn protein người ta có thể định
lượng hàm lượng protein.
- Xác định hàm lượng peptid [1]: hàm
lượng peptid được định lượng dựa vào đường
chuẩn tyrosine. Lấy 1g mẫu thủy phân, cho
thêm 9ml nước cất sau đó khuấy đều trong
khoảng 5 ÷10 phút rồi ly tâm lấy dịch trong
để xác định hàm lượng peptid như sau: lấy 2

ống nghiệm sạch 1 ống thí nghiệm và một ống
đối chứng. Ống thí nghiệm: hút chính xác 2ml
dung dịch lọc ở trên cộng với 2ml Trichloacetic
acid (TCA) 20% để 30 phút rồi lọc qua giấy
lọc thu dịch lọc. Lấy một ống nghiệm sạch cho
vào 1ml dịch lọc + 5ml dung dịch Na2CO3 0,4
M lắc đều, rồi cho vào 1ml Folin để 20 phút so
màu ở bước sóng 660 nm. Ống đối chứng: lấy

Số 2/2020
1ml dung dịch TCA 10% + 5ml Na2CO3 0,4
M + 1ml folin để 20 phút đem so màu. Tính
kết quả: dựa vào đường chuẩn để tính lượng
tysosin tương ứng.
Hàm lượng peptid được tính theo công thức:
2.2. Phương pháp định lượng chondroitin
sulfate (CS) bằng phương pháp so mầu theo
Farndale và cộng sự [8]
Nguyên lý: Dựa trên sự thay đổi trong
quang phổ hấp thụ của DMMB (1,9
Dimethylmethylene) khi tác dụng với
chondroitin sulfate (glycosaminoglycan sulfate)
ở bước sóng 525nm. Dựa vào đường chuẩn của
chondroitin sulfate A (gốc sulfate gắn ở vị trí
C-4 (chondroitin-4-sulfate), CS4) với DMMB
để xác định hàm lượng chondroitin sulfate.
Phương pháp này có độ nhạy cao, có thể định
tính và định lựợng hàm lượng CS ở mức μg.
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm để xác định nồng độ hỗn

hợp enzyme alcalase - papain thủy phân sụn cá
mập được trình bày ở hình 2.

Hình 2. Sơ đồ thí nghiệm xác định nồng độ hỗn hợp alcalase-papain thích hợp cho quá trình
thủy phân sụn cá mập.

12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Vi sụn cá mập đã xử lý, được rã đông, rửa,
xay nhỏ bằng máy xay và được sử dụng để làm
nguyên liệu nghiên cứu thủy phân bằng hỗn
hợp enzyme alcalase - papain. Tiến hành 5 mẫu
thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp
enzyme alcalase-papain với nồng độ của hỗn
hợp enzyme khác nhau: mẫu 1: 0,1%, mẫu 2:
0,2%, …, mẫu 5: 0,5%. Các mẫu thủy phân đều
sử dụng 2kg hỗn hợp sụn cá mập, tỷ lệ alcalase/
papain trong hỗn hợp 60/40, lượng nước bổ
sung là 2 lít, thủy phân ở pH tự nhiên của hỗn
hợp sụn cá mập (pH 6,8) và nhiệt độ thủy phân
50ºC. Sau các khoảng thời gian: 0h, 2h, 4h, 6h,
8h và 10 giờ thủy phân, tiến hành lấy mẫu dịch
thủy phân để đánh giá hàm lượng protein hòa
tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa, NNH3 và
hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành. Kết
quả đánh giá là cơ sở để lựa chọn nồng độ hỗn
hợp enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân
sụn cá mập.

2.4. Thiết bị và hóa chất
- Thiết bị: sử dụng các thiết bị hiện có tại
Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường
Đại học Nha Trang và Trường Đại học Công
nghiệp Thực phẩm - TP. HCM: Máy so mầu
UV-VIS DR6000 - Hach (Mỹ); Bể ổn nhiệt
MEMMERT WNB14 - Đức, Máy ly tâm lạnh

Số 2/2020
tốc độ cao HERMLE Z36HK - Đức, Hệ thống
phân tích hàm lượng nitơ/protein theo phương
pháp Dumas (Đức), Bồn nước điều nhiệt
Memmert WNB22 (Đức), nồi thủy phân dung
tích 30 lít (Việt Nam),…
- Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
đều là hoá chất tinh khiết do hãng Merck - Đức
cung cấp.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm đều tiến hành lặp lại 3 lần
độc lập và số liệu là kết quả trung bình của các
lần thí nghiệm. Kiểm tra sự khác biệt giữa các
số liệu thống kê bằng phần mềm Statgraphics
Centurion XVII trial.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO
LUẬN
1. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng
độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng
protein hòa tan
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn
cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain

với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h,
2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, tiến hành
lấy mẫu dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng
protein hòa tan. Kết quả được thể hiện trên
hình 3.

Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân
đến hàm lượng protein tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Từ kết quả phân tích ở hình 3 cho thấy theo
thời gian thủy phân hàm lượng protein hòa tan
tạo thành trong tất cả các mẫu thủy phân thủy
phân sụn cá mập bằng hỗn hợp alcalase-papain
đều tăng theo sự tăng nồng độ enzyme và thời
gian thủy phân nhưng mức độ tăng khác nhau
tùy thuộc vào nồng độ enzyme. Cụ thể, sau
2 giờ thủy phân, hàm lượng protein hòa tan
của dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp
enzyme alcalase-papain ở nồng độ enzyme
0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 4,45 g/kg,
5,37g/kg, 6,24g/kg, 6,34g/kg và 6,46g/kg, cao
gấp 2,23 lần, 2,69 lần, 3,12 lần, 3,17 lần và 3,23
lần so với ban đầu. Sau 10 giờ thủy phân, hàm
lượng protein hòa tan của dịch thủy phân sụn
cá mập với nồng độ hỗn hợp enzyme alcalasepapain sử dụng 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và
0,5% là 10,16 g/kg, 12,98g/kg, 14,12g/kg,

14,67g/kg và 14,89g/kg, cao gấp tương ứng so
với ban đầu là 5,08 lần, 6,49 lần, 7,06 lần, 7,34
lần và 7,45. Kết quả này cho thấy khi tăng nồng
độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain từ 0,1%
÷0,3% thì hàm lượng protein hòa tan tạo thành
trong dịch thủy phân tăng mạnh theo thời gian
và tăng mạnh theo chiều tăng nồng độ enzyme.
Tuy vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme
alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng protein
hòa tan tạo thành trong dịch thủy phân lại có
xu thế tăng chậm lại và không tương xứng với
mức độ tăng nồng độ enzyme. Mặt khác, kết
quả đánh giá cũng cho thấy sự khác biệt về
hàm lượng protein hòa tan tạo thành trong dịch
thủy phân ở các mẫu bổ sung 0,3%, 0,4% và
0,5% không đáng kể, không có ý nghĩa thống
kê. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme
alcalase - papain > 0,3% thì không làm tăng
đáng kể hàm lượng protein hòa tan trong dịch
thủy phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ dẫn tới
lãng phí enzyme.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng có
nét tương đồng với một số nghiên cứu đã công
bố trước đây. Cụ thể, năm 2004, Vũ Ngọc Bội
khi nghiên cứu về quá trình thủy phân protein
cá mối và cá cơm bằng enzyme protease từ B.
subtilis S5 cho thấy nồng độ enzyme protease
từ B. subtilis S5 thích hợp cho quá trình thủy

14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Số 2/2020
phân cơ thịt cá mối là 0,3% và nồng độ enzyme
protease từ B. subtilis S5 thích hợp cho quá
trình thủy phân cá cơm trong sản xuất nước
mắm là 0,2% [1]. Năm 2010, Trần Cảnh Đình
tiến hành thủy phân hỗn hợp sụn cá mập khô và
tươi bằng enzyme protease cho rằng nồng độ
enzyme protease thích hợp là 0,2% [3].
Từ những phân tích ở trên cho thấy khi xét
theo khía cạnh hàm lượng protein hòa tan thì
sử dụng hỗn hợp enzyme alcalase - papain với
nồng độ 0,3% là phù hợp cho quá trình thủy
phân sụn cá mập.
2. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng
độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng
peptid tạo thành
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn
cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain
với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h,
2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu
dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng peptid.
Kết quả được thể hiện trên hình 4.
Từ kết quả phân tích ở hình 4 cho thấy
cũng giống như hàm lượng protein, hàm
lượng peptid tạo thành trong tất cả các mẫu
thủy phân thủy phân sụn cá mập bằng hỗn
hợp enzyme alcalase-papain đều tăng theo

nồng độ enzyme và thời gian thủy phân nhưng
mức độ tăng khác nhau tùy thuộc vào nồng
độ hỗn hợp enzyme sử dụng. Cụ thể, ở thời
điểm sau 2 giờ thủy phân, hàm lượng peptid
tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập
bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain tương
ứng với nồng độ enzyme 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5% là 0,015146mg/mL, 0,01748
mg/mL, 0,020139mg/mL, 0,020561mg/mL
và 0,020773mg/mL, cao gấp tương ứng 2,16
lần, 2,50 lần, 2,88 lần, 2,94 lần và 2,97 lần
so với ban đầu. Ở thời điểm sau 10 giờ thủy
phân, hàm lượng peptid tạo thành trong dịch
thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme
alcalase-papain tương ứng với nồng độ enzyme
0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 0,019327
mg/mL, 0,02228mg/mL, 0,025735mg/mL,
0,026218mg/mL và 0,026564mg/mL, cao gấp
2,76 lần, 3,18 lần, 3,69 lần, 3,75 lần và 3,80
lần so với ban đầu. Kết quả này cho thấy khi


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian
thủy phân đến hàm lượng peptid tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập.

tăng nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain

từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng peptid tạo thành
trong dịch thủy phân cũng tăng mạnh theo
thời gian và tăng mạnh theo chiều tăng nồng
độ enzyme. Nhưng khi tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng
peptid tạo thành trong dịch thủy phân tăng rất
ít và không tương xứng với mức độ tăng nồng
độ enzyme. Mặt khác, kết quả đánh giá cũng
cho thấy sự khác biệt về hàm lượng peptid tạo
thành trong dịch thủy phân ở các mẫu bổ sung
0,3%, 0,4% và 0,5% không đáng kể, không có
ý nghĩa thống kê. Như vậy, khi tăng nồng độ
hỗn hợp enzyme alcalase - papain > 0,3% thì
không làm tăng hàm lượng peptid trong dịch
thủy phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ dẫn tới
lãng phí enzyme.
Từ các phân tích hàm lượng peptid ở trên
cho thấy nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn
cá mập là 0,3%.
3. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng độ
hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng Naa
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn
cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain
với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h,
2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu

dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng Naa.
Kết quả được thể hiện trên hình 5.

Kết quả phân tích trình bày ở hình 5 cho
thấy hàm lượng Naa tạo thành trong tất cả các
mẫu thủy phân thủy phân sụn cá mập bằng hỗn
hợp alcalase-papain đều tăng theo thời gian
thủy phân và nồng độ hỗn hợp enzyme nhưng
mức độ tăng của các mẫu thí nghiệm sử dụng
nồng độ enzyme khác nhau cũng khác nhau.
Cụ thể, sau 2 giờ thủy phân, hàm lượng Naa
của dịch thủy phân tương ứng với nồng độ
hỗn hợp enzyme 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và
0,5% là 5,21243g/lít, 5,21243g/lít, 7,00673g/
lít, 7,11911g/kg và 7,21414g/lít, cao gấp tương
ứng so với ban đầu là 4,24 lần, 4,98 lần, 5,70
lần, 5,79 lần và 5,87 lần. Ở thời điểm sau 10
giờ thủy phân, hàm lượng Naa của dịch thủy
phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain ở nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%
và 0,5% là 8,28690g/lít, 9,62671g/lít, 11,08536
g/lít, 11,36078g/kg và 11,56613g/lít, cao gấp
6,74 lần, 7,83 lần, 9,01 lần, 9,24 lần và 9,40 lần
so với ban đầu. Kết quả này cũng cho thấy khi
tăng nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain
từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng Naa tạo thành
trong dịch thủy phân sụn cá mập tăng mạnh
theo chiều tăng nồng độ enzyme và thời gian
thủy phân. Trái lại, khi tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian
thủy phân đến hàm lượng Naa tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập.

Naa tạo thành trong dịch thủy phân lại tăng rất
chậm, không đáp ứng được mức độ tăng nồng
độ enzyme. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% thì không làm
tăng đáng kể hàm lượng Naa trong dịch thủy
phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp enzyme
alcalase - papain > 0,3% có thể dẫn tới lãng phí
enzyme.
Từ những phân tích ở trên khi xét theo khía
cạnh hàm lượng nitơ acid amin thì sử dụng hỗn
hợp enzyme alcalase - papain để thủy phân sụn
cá mập với nồng độ enzyme 0,3% là phù hợp.
4. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng
độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng
chodroitin sulphate tạo thành
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn
cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain
với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h,
2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu dịch
thủy phân để đánh giá hàm lượng chondroitin
sulphate. Kết quả được thể hiện trên hình 6.
Kết quả phân tích trình bày ở hình 6 cho
thấy hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành

trong tất cả các mẫu thủy phân thủy phân
sụn cá mập bằng hỗn hợp alcalase-papain
đều tăng theo thời gian thủy phân và nồng
độ hỗn hợp enzyme nhưng mức độ tăng khác
nhau tùy thuộc vào nồng độ enzyme. Ở giai
16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

đoạn sau 2 giờ thủy phân sụn cá mập bằng
hỗn hợp enzyme alcalase-papain, hàm lượng
chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy
phân của các mẫu thí nghiệm sử dụng enzyme
với nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là
7,33062mg/mL, 9,11400mg/mL, 9,84540mg/
mL, 10,43168mg/mL và 10,54282mg/mL, cao
gấp tương ứng so với ban đầu là 18,85 lần,
23,43 lần, 25,31 lần, 26,82 lần và 27,10 lần. Ở
thời điểm sau 10 giờ thủy phân sụn cá mập bằng
hỗn hợp enzyme alcalase-papain, hàm lượng
chondroitin sulphate của dịch thủy phân tương
ứng với nồng độ enzyme đã sử dụng 0,1%,
0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 23,23486mg/
mL,
28,40800mg/mL,
32,44880mg/mL,
33,05696mg/mL và 33,09104mg/mL, cao gấp
tương ứng 59,73 lần, 73,03 lần, 83,42 lần,
84,98 lần và 85,07 lần so với ban đầu. Kết quả
này cho thấy khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme
alcalase - papain từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng
chondroitin sulphate tạo thành trong dịch

thủy phân tăng mạnh theo chiều tăng nồng độ
enzyme. Tuy vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng
chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy
phân có xu hướng tăng chậm lại và mức độ
tăng không tương xứng với mức độ tăng nồng
độ enzyme. Mặt khác, kết quả đánh giá cũng
cho thấy sự khác biệt về hàm lượng chondroitin


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân
đến hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập.

sulphate tạo thành trong dịch thủy phân của các
mẫu bổ sung enzyme với nồng độ 0,3%, 0,4%
và 0,5% không đáng kể, không có ý nghĩa
thống kê. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp
enzyme alcalase - papain > 0,3% thì không làm
tăng đáng kể hàm lượng chondroitin sulphate
trong dịch thủy phân dẫn tới khi tăng nồng độ
hỗn hợp enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ
dẫn tới lãng phí enzyme.
Từ những phân tích ở trên khi xét theo
khía cạnh hàm lượng chondroitin sulphate tạo
thành thì nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase -

papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn
cá mập là 0,3%.
5. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng
độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng
NNH3
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn
cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain
với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%,
0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h,
2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu
dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng NNH3.
Kết quả được thể hiện trên hình 7.

Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân
đến hàm lượng NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân vi sụn cá mập.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 17


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Từ kết quả phân tích ở hình 7 cho thấy hàm
lượng NNH3 tạo thành trong các mẫu thủy phân
sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalasepapain với nồng độ enzyme sử dụng khác nhau
đều tăng theo thời gian thủy phân nhưng mức
độ tăng chậm và khác nhau không đáng kể giữa
các mẫu thí nghiệm. Cụ thể, sau 10 giờ thủy
phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase
- papain, các mẫu thủy phân sử dụng enzyme
với nồng độ: 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5%
đều có hàm lượng NNH3 tăng trong khoảng từ
1,13-1,27 lần so với ban đầu và sự chênh lệch

về hàm lượng NNH3 giữa các mẫu thí nghiệm
không có ý nghĩa thống kê.
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép
rút ra kết luận:

Số 2/2020
1) Nồng độ hỗn hợp enzyme alcalasepapain và thời gian thủy phân có ảnh hưởng
mạnh đến hàm lượng protein hòa tan, peptid,
Naa, chondroitin sulphate và NNH3 tạo thành
trong dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp
enzyme alcalase-papain.
2) Nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain
thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập
là 0,3%. Sau 10h thủy phân sụn cá mập bằng
hỗn hợp enzyme alcalase-papain với nồng độ
enzyme 0,3%, nhiệt độ thủy phân 50ºC, thủy
phân ở pH tự nhiên (6,8), khối lượng mẫu 2kg
và tỷ lệ nước bổ sung 2 lít, dịch thủy phân
có hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa,
chondroitin sulphate và NNH3 cao gấp 7,06 lần,
3,68 lần, 9,01 lần, 83,42 lần và 1,27 lần so với
ban đầu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis, Luận
án tiến sĩ Sinh học chuyên ngành Hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh, Đại học
Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

2. Vũ Ngọc Bội, Lê Hương Thủy, Phạm Thị Hương, Đặng Thị Thu Hương (2015), “Nghiên cứu thủy phân moi
biển (Acetes sp) bằng hỗn hợp enzym alcalase - bromelin thô”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Số
4/2015, Trường Đại học Nha Trang, Trang 18-26.
3. Trần Cảnh Đình và cộng sự (2010), Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thử nghiệm chondroitin và glucosamin từ
nguyên liệu thủy sản, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học thuộc chương trình CNSH - thủy sản, Viện
Hải sản, Hải phòng.
4. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thuần Anh (2010), Phân tích kiểm nghiệm thực
phẩm thủy sản, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. Phạm Thị Khánh Vân & Vũ Thị Thái (2004), "Phím nước mắt và tác dụng của chondroitin sulphat". Tạp chí
Thuốc và Sức khỏe, Số 273(12).

Tiếng Anh
6. Antonilli L. and Paroli E. (1993), “Role of the oligosaccharide inner core in the inhibition of human leukocyte
elastase by chondroitin sulfates”, Int. J. Clin. Pharmacol. Res.;13 Suppl:11-7.
7. Bruyere O. & Reginster J. Y. (2007), "Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee
and hip osteoarthritis”, Drugs Aging, 24(7): p. 573-580.
8. Farndale W. R., Buttle D. J. & Barrett A. J. (1986), "Improved quantitation and discrimination of sulphated
glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue", Biochim. Biophys. Acta., 883: p. 173-177.
9. J. Jayaraman (1998), Laboratory manual in biochemistry, Wiley Eastern Limited.
10. Robert M. Lauder (2009), "Chondroitin sulphate: A complex molecule with potential impacts on a wide
range of biological systems", Complementary Therapies in Medicine, 17: p. 56-62.

18 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 2/2020

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC TINH SÀO CÁ KHẾ VẰN (Gnathanodon speciosus)

STUDY ON THE TESTIS BIOLOGY OF GOLDEN TREVALLY (Gnathanodon speciosus)
Hứa Thị Ngọc Dung1, Đào Thị Đoan Trang1, Phạm Quốc Hùng1
1
Trường Đại học Nha Trang
Tác giả liên hệ: Phạm Quốc Hùng (Email: )
Ngày nhận bài: 12/04/2020; Ngày phản biện thông qua: 13/05/2020; Ngày duyệt đăng: 12/06/2020

TÓM TẮT
Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về sinh học sinh sản cá khế vằn (Gnathanodon speciosus). Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm tinh sào cá khế vằn đực. Đàn cá thí nghiệm có khối lượng và chiều
dài lần lượt là 400-800 g và 30-44 cm. Đàn cá được nuôi trong lồng trên biển và cho ăn hàng ngày bằng cá tạp
với khẩu phần 3-5% khối lượng thân. Cá đực được thu mẫu ngẫu nhiên để thu thập tinh sào. Kết quả nghiên
cứu cho thấy hệ số thành thục (GSI) trung bình của cá khế vằn đực tăng cao từ tháng 6 và đạt giá trị cao nhất
vào tháng 9 (3,3% ± 0,6%). Tỷ lệ thành thục sinh dục ở cá đực đạt tỷ lệ cao giai đoạn từ tháng 5 đến tháng 9.
Đây là loài cá đẻ nhiều lần trong năm. Trong tinh sào thành thục có nhiều tinh bào ở các giai đoạn phát triển
khác nhau. Thành phần sinh hóa của tinh sào thay đổi theo giai đoạn phát triển. Hàm lượng protein và lipid ở
giai đoạn thành thục cao hơn so với giai đoạn chưa thành thục.
Từ khóa: tinh sào, cá khế vằn, Gnathanodon speciosus, thành phần sinh hóa, hệ số thành thục
ABSTRACT
This is for the first time in Viet Nam, a study on reproductive biology of golden trevally (Gnathanodon
speciosus) was conducted. The present study was focused on testis biology of the fish. The male broodstock
with body weith and total length were 400-800 g and 30-44 cm, respectively. Fish were kept in seacage
and daily fed with trashfish at 3-5% body weight. Testis were collected for biological parameters. The
results indicated that the GSI increased from June to September (3.3% ± 0.6%). Maturation of male fish
increased from May to September. Male golden trevally are multiple spawners. There are different stages
of germcell development in the testis at the same time. The biochemical composition changed based on
the stages of testis maturation. Protein and lipid contents in mature testis were found higher than that in
immature testis.
Keywords: Testis, golden trevally, Gnathanodon speciosus, GSI, biocehmical composition

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cá khế vằn, Gnathanodon speciosus, (tên
địa phương còn gọi là cá bè đưng, bè vàng,
bè nghệ) là loài cá biển có giá trị kinh tế,
sinh trưởng nhanh, dễ nuôi vì có tính ăn tạp,
nguồn thức ăn dễ tìm và nuôi được ở thủy vực
nước lợ [7; 12]. Hiện nay loài cá này đã được
nhân giống thành công trong điều kiện nuôi
nhốt và được nuôi thương phẩm ở một số địa
phương ven biển [7; 12]. Điều này đã tạo tiền
đề rất lớn trong việc mở rộng quy mô nghề
nuôi, góp phần đa dạng hóa đối tượng nuôi
cho ngành thủy sản. Trên thế giới cũng đã có
một số nghiên cứu về loài cá này, nhưng chủ
yếu tập trung vào sản xuất giống [11; 12]. Tuy

nhiên, cá khế vằn chưa được nghiên cứu đầy
đủ, chưa có quy trình sản xuất giống và hiệu
quả sản xuất không ổn định, chất lượng con
giống chưa cao cũng như khi xảy ra dịch bệnh
chưa có biện pháp quản lý và điều trị. Tại Việt
Nam hiện vẫn chưa có công trình nghiên cứu
nào về đặc điểm sinh học sinh sản của cá khế
vằn. Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình sản
xuất giống nhân tạo, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh sản,
tập trung vào đặc điểm tinh sào cá đực trong
chu kỳ sinh sản.
Nắm được quy luật phát triển của tinh sào và
những thay đổi về tổ chức học trong chu kỳ sinh
sản là một trong những thông tin rất cần thiết
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 19

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
cho biết hoặc có thể dự báo trạng thái thành thục
của cá đực, cũng như phục vụ cho công tác quản
lý đàn cá bố mẹ [4; 13; 14]. Nghiên cứu này tập
trung vào việc xác định đặc điểm phát triển tinh
sào trong chu kỳ sinh sản cá khế vằn, đặc điểm
hình thái ngoài, tiêu bản mô học các giai đoạn
phát triển tinh sào, hệ số thành thục và thành
phần sinh hóa của tinh sào trong chu kỳ sinh sản.
Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin hữu ích
về đặc điểm sinh học sinh sản, đóng góp cho
việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất
giống cá khế vằn sẽ mở ra nhiều tiềm năng và cơ
hội phát triển nghề nuôi cá biển, góp phần phát
triển ngành nuôi trồng thủy sản.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đàn cá thí nghiệm
Đàn cá bố mẹ thuộc Công ty TNHH Phượng
Hải Nha Trang được nuôi trong lồng trên biển
tại Đảo Trí Nguyên, Phường Vĩnh Nguyên, Nha
Trang (12°4′23.01″N, 109°2′51.97″E). Mật độ
nuôi bình quân 3 kg/m3 với tỷ lệ đực cái 1:1;
Nhiệt độ nước: 28 - 32oC; độ mặn: 29 - 34 ‰;
pH: 7,8 - 8,6 và oxy hòa tan: 4,5- 6,5 mg/l. Cá bố
mẹ được cho ăn cá tạp hàng ngày với khẩu phần
bằng 3 - 5% khối lượng thân. Cá đực có khối
lượng trung bình 400 - 800g, chiều dài trung

bình từ 30 - 44cm được bắt ngẫu nhiên để thu
mẫu tinh sào và đo kích thước. Thời gian thu
mẫu từ tháng 3/2018 đến tháng 4/2019.
2. Phương pháp làm tiêu bản tổ chức học
tinh sào
Mẫu tinh sào được đưa ra khỏi dung dịch
cố định, rửa và rút nước bằng cách ngâm
trong cồn tuyệt đối khoảng 4 - 8 giờ, tiếp theo,
ngâm trong methyl salicylate 12 - 24 giờ. Sau
cùng, mẫu được thấm trong parafin nóng chảy
ở 65o C trong thời gian ít nhất 6 giờ. Sử dụng
máy đổ parafin đã nóng chảy vào khuôn đã
chứa mẫu, để trên dàn lạnh khoảng 30 phút
cho mẫu parafin đông cứng lại. Dùng dao gọt
khối parafin chứa mẫu thành hình thang hoặc
hình chữ nhật để dễ cắt lớp. Gắn khối parafin
lên đế gỗ và dán nhãn. Gắn đế gỗ có mẫu vào
máy microtom, cắt lát có độ dày 5 - 7 micron.
Đưa lát cắt vào nước ấm (40 - 45oC) khoảng
1 - 2 phút để lát cắt giãn ra. Dùng lam sạch
20 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Số 2/2020
lấy lát cắt ra khỏi nước và sấy trên máy sấy ở
nhiệt độ 45 - 60oC trong 1 - 4 giờ.
Sau khi được sấy khô, tiếp theo, mẫu được
khử parafin bằng cách ngâm trong dung dịch
xilen và làm trương nước bằng cách nhúng
trong dung dịch ethanol ở các nồng độ khác
nhau khoảng 2 - 3 phút. Cuối cùng mẫu được

nhuộm trong dung dịch Hematoxylin - Mayer
(4 - 6 phút) và Eosin (2 phút) để khô và đậy
lamen bằng keo dán. Ghi nhãn lên lamen là
khâu cuối cùng của quy trình.
3. Xác định GSI và các giai đoạn phát triển
tinh sào
Tiêu bản tổ chức học được đọc trên kính
hiển vi Zeiss Axioskop 2-Plus light (Zeiss
Inc., Vienna, Austria) và chụp hình bằng máy
Nikon Camera Head DS-5M và Nikon Camera
Control Unit DS-L1. Bậc thang phân biệt các
giai đoạn phát triển tinh sào trong nghiên cứu
này dựa theo tiêu chuẩn của Nikolski (1963);
Sakun (1954) và Sakun & Butskaya (1968) [6;
8; 9]. Hệ số thành thục (GSI - Gonado Somatic
Index) là tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng tuyến
sinh dục và khối lượng toàn bộ cơ thể.
4. Xác định thành phần sinh hóa trong tinh
sào cá khế vằn
Thành phần sinh hóa tinh sào (các chỉ tiêu
ẩm, tro, protein và lipid) ở các giai đoạn phát
triển khác nhau được phân tích tại phòng thí
nghiệm Công nghệ cao, Trung tâm Thí nghiệm
Thực hành - Trường Đại học Nha Trang.
- Xác định hàm lượng ẩm và tro: Theo
phương pháp sấy khô ở 105oC (độ ẩm) và nung
ở 550oC (tro) đến khối lượng không đổi.
- Xác định hàm lượng protein bằng phương
pháp Dumas (TCVN 11604: 2016). Phương
pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô.

Quy trình dùng một thiết bị lò điện đun nóng
mẫu phân tích lên đến 600oC trong một lò phản
ứng được bịt kín với sự hiện diện của oxy. Hàm
lượng nitơ của khí đốt sau đó được đo bằng
cách dùng máy dò dẫn nhiệt.
- Xác định lipid bằng thiết bị chiết Soxhlet:
Dựa vào tính tan hoàn toàn của chất béo vào
dung môi hữu cơ. Dùng dung môi hữu cơ trích ly
chất béo có trong tuyến sinh dục cá. Sau đó làm
bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại, tính
ra hàm lượng chất béo có trong tuyến sinh dục cá.


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
5. Xử lý thống kê
Số liệu được trình bày dưới dạng TB ± SD.
Sự khác nhau về các đặc điểm sinh sản giữa các
tháng hay các giai đoạn phát triển của tuyến sinh
dục được phân tích bằng phương pháp phân tích
phương sai một nhân tố (One-way ANOVA)
với kiểm định Duncan’s multiple range test trên
phần mềm SPSS có ý nghĩa ở mức P <0,05.

Số 2/2020
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Biến động hệ số thành thục
Hệ số thành thục (GSI) biến động khá lớn
trong mùa vụ sinh sản (Hình 1). GSI đạt cao
nhất vào tháng 9 (3,2%). GSI đạt giá trị thấp
nhất vào tháng 4 (0,4%). Tuy nhiên quan sát sự

phát triển của tinh sào cho thấy cá đực ở tháng
4 có tỷ lệ thành thục khá cao.

Hình 1. Biến động giá trị GSI trung bình qua các tháng

Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị GSI
trung bình của cá đực qua 7 tháng thu mẫu có
sự dao động lớn từ 0,4 % ± 0,30% đến 3,2% ±
0,58%. Giá trị GSI ở tháng 3 và tháng 5 tương
đương nhau. Sang tháng 6, GSI bắt đầu tăng
và đạt giá trị cực đại vào tháng 9 khi toàn bộ

cá đực thu được đều có tinh sào ở giai đoạn IV,
giai đoạn tinh sào đạt kích thước tối đa. GSI đạt
giá trị cực đại (3,2%) sau đó giảm mạnh vào
tháng 12 rồi tăng nhẹ vào tháng 3 năm 2019 và
tiếp tục giảm và có giá trị nhỏ nhất vào tháng 4
năm 2019 (0,4%).

Hình 2: Hệ số thành thục ở các giai đoạn phát triển của tinh sào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 21


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Trong nghiên cứu này cho thấy cá khế vằn
đực có giá trị GSI thay đổi theo giai đoạn phát
triển của tinh sào, dao động từ 0, 4 - 1,9%. Khi
tinh sào ở giai đoạn II, III giá trị GSI nhỏ hơn
và sai khác có ý nghĩa thống kê với GSI khi

tinh sào ở giai đoạn IV, V (Hình 2). Điều này
đúng với thực tế, ở giai đoạn IV và V cá bước
sang giai thành thục sinh dục, buồng sẹ phát
triển, khối lượng buồng sẹ tăng dẫn đến giá trị
GSI cao.
GSI là một chỉ số quan trọng đánh giá mức
độ chín muồi của tuyến sinh dục. Vì vậy, khi
nghiên cứu quá trình phát triển của tuyến sinh
dục, người ta không thể không đề cập GSI.
Thông qua GSI, chúng ta có thể dự báo, theo
dõi quá trình phát triển và chín muồi của các tế
bào sinh dục [2; 5; 14]. Tuy nhiên GSI đôi khi
A

Số 2/2020
không phản ánh đầy đủ trạng thái thực của các
sản phẩm sinh dục, đặc biệt đối với các loài cá
đẻ nhiều lần trong năm [2; 5]. Tuy vậy GSI là
một phần bổ sung quan trọng cho sơ đồ chín
muồi sinh dục ở cá.
2. Các giai đoạn phát triển tinh sào
Về tổ chức học
Ở cá khế vằn đực, quá trình tạo tinh thể hiện
khá phức tạp. Trong tinh sào tồn tại nhiều giai
đoạn phát triển khác nhau của tinh bào. Qua
Hình 3 có thể thấy, ở giai đoạn thành thục sinh
dục, tinh sào cá tồn tại nhiều giai đoạn phát
triển khác nhau của tinh bào gồm tinh nguyên
bào; tinh bào đang phân chia; tinh bào cấp I, II;
tinh tử và tinh trùng. Điều này chứng tỏ đây là

loài cá thành thục liên tục hay nói cách khác là
loài sinh sản nhiều lần trong năm.
B
2

1
2
3

C

D

4
5

6

5
6

Hình 3: Tổ chức học tinh sào cá khế vằn ở các giai đoạn khác nhau
1: Tinh nguyên bào, 2: Tinh nguyên bào đang phân chia, 3: Tinh bào cấp I, 4: Tinh bào cấp II;
5: Tinh tử; 6: Tinh trùng; Scale bar: 100 µm

22 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản
Về hình thái học

Trong nghiên cứu này, đàn cá đực thu được
có tinh sào ở giai đoạn II, III, IV và V. Tinh sào
ở giai đoạn I và VI không bắt gặp trong quá trình
thu mẫu. Trên thực tế, ở giai đoạn I, nhìn bên
ngoài, tinh sào là những dải mỏng giống noãn
sào ở giai đoạn I, chính vì thế rất khó để phân biệt
đực cái. Giai đoạn VI là giai đoạn sau khi cá tham
gia sinh sản, tinh sào đã trở về giai đoạn II, III.
Giai đoạn II: Tinh sào có kích thước rất
nhỏ, hai phần của tinh sào còn dính nhau bởi
màng treo dài. Tinh sào có màu hồng là màu
của các mạch máu chạy dọc và có những tia
nhỏ chạy về các lườn bên (Hình 4A).
Giai đoạn III: Tinh sào tăng lên về mặt thể
tích, hai phần tinh sào đã tách ra. Tinh sào có màu
trắng, săn chắc và đàn hồi. Khi cắt ngang tinh sào,
các mép của nó không tròn mà lại sắc cạnh và
thấy xuất hiện sẹ có màu trắng trong (Hình 4B)

Số 2/2020
Giai đoạn IV: Kích thước tinh sào đạt tối đa,
màu trắng sữa, chứa đầy sẹ. Khi cắt ngang tinh
sào, các mép tròn lại ngay và chổ cắt có dịch
nhờn chảy ra. Ở giai đoạn này, tinh trùng chín
xuất hiện trong các bào nang và có xu hướng
đi ra khỏi bào nang. Các tinh nguyên bào lớn
đang phân chia giảm nhiễm. Ngoài ra, trong
tinh sào còn có các tinh bào sơ cấp, tinh bào thứ
cấp và các tinh tử nằm trên thành các ống sinh
tinh dự trữ cho lần phát dục tiếp theo (Hình 4C)

Giai đoạn V: Tinh sào đang ở thời kì sinh
sản. Tinh sào có màu trắng sữa. Bên trong ống
sinh tinh chứa đầy các tế bào tinh trùng chín
muồi (Hình 4D). Tuy nhiên, cá khế vằn không
như nhiều loài cá khác. Khi tinh sào ở giai đoạn
V, vuốt vào bụng cá không có hiện tượng tinh
dịch chảy ra. Vì thế, ở giai đoạn thành thục sinh
dục nhìn từ bên ngoài rất khó để phân biệt được
cá khế vằn đực và cá khế vằn cái.

C

Hình 4: Tinh sào cá khế vằn ở các giai đoạn phát triển
A: Giai đoạn II; B: Giai đoạn III; C: Giai đoạn IV; D: Giai đoạn V

Kết quả trên cho thấy quá trình phát triển,
thành thục, chín muồi và phóng thích tế bào sinh
dục đực trong chu kỳ sinh sản của cá khế vằn
khá tương đồng với các loài cá biển nhiệt đới nói
chung như cá chẽm mõm nhọn, cá dìa, cá bống
và cá Glossogobius giuris [2; 4; 14; 15]. Sự mô tả
chi tiết các giai đoạn phát triển của tinh sào cũng
như tổ chức học ở từng giai đoạn phát triển, làm
căn cứ hướng dẫn phân biệt các giai đoạn phát
triển của tinh sào cá biển nhiệt đới nói chung.

3. Thành phần sinh hóa của tinh sào
Thành phần sinh hóa của tinh sào như
protiein, lipid, tro và độ ẩm được xem là
các chỉ tiêu quan trọng, phản ánh mức độ

tích lũy dinh dưỡng trong tinh sào, từ đó có
thể dự báo được mức độ thành thục của cá
[10]. Thành phần sinh hóa còn là nguồn năng
lượng và chất dinh dưỡng cho quá trình tạo
tinh ở cá. Kết quả nghiên cứu được thể hiện
ở Bảng 1.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 23