Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu đánh giá một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên cây đậu tương tại Đồng Nai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA MÔI TRƯỜNG

Lưu Ngọc Hưng

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM CỘNG SINH VỚI RỄ CÂY ĐẬU TƯƠNG TẠI
ĐỒNG NAI

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành: Môi trường
(Chương trình đào tạo: Chuẩn)

Cán bộ hướng dẫn: TS.Phan Thị Hồng Thảo
PGS.TS. Nguyễn Kiều Băng Tâm

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Kiều Băng Tâm, TS. Phan Thị Hồng Thảo, người cô mẫu mực đã tận tụy
hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
cũng như luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống. Xin cảm ơn
nguồn kinh phí từ dự án KHCN trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH và CN Việt
Nam mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18 “Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ nano
trong nồng nghiệp” do PGS.TS. Nguyễn Hoài Châu làm chủ nhiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Môi trường
bộ đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn sinh thái, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành tâm huyết giảng dạy, truyền đạt kiến

thức cho chúng tôi trong suốt khóa học này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh, chị, em phòng Vi sinh vật
Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã
nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên
động viên, và chia sẻ khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện
khóa luận tốt nghiệp này.
Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Lưu Ngọc Hưng


MỤC LỤC


DANH MỤC HÌNH


DANH MỤC BẢNG


MỞ ĐẦU
Nitơ là một trong những dinh dưỡng thiết yếu đối với cây trồng được rễ
cây hấp thụ ở dạng NH4+, NO3-. Việc cung cấp nitơ cho cây trồng là vấn đề quan
trọng trong nền sản xuất nông nghiệp của tất cả các nước trên toàn thế giới. Dân
số thế giới đang ngày một tăng nhanh kéo theo nhu cầu lương thực cũng tăng cao
nền nông nghiệp hiện đại đang phải đối mặt với một thách thức lớn là mức độ sử
dụng phân bón ngày càng tăng với tốc độ chóng mặt.Tuy nhiên, việc lạm dụng
quá nhiều phân bón hóa học với liều lượng cao ở một số quốc gia có nền nông
nghiệp còn lạc hậu gây ra nhiều vấn đề về môi trường như mất cân bằng dinh

dưỡng đất, dư thừa NO3- trong đất, trong nước ngầm, giảm độ pH của đất, nước
ngầm,… trong khi vấn đề ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí đang trở
thành mối quan tâm cấp thiết của toàn thế giới đòi hỏi bảo vệ môi trường sống
của con người. Do đó, việc nghiên cứu sử dụng nguồn nitơ sinh học được xem là
giải pháp quan trọng trong việc cân bằng phát triển nông nghiệp và bảo vệ môi
trường. Trong các hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh giữa vi
khuẩn nốt sần (Rhizobium) và cây họ đậu là quan trọng nhất, ước tính đạt trên 80
triệu tấn mỗi năm, tương đương với lượng phân đạm vô cơ trên toàn thế giới sản
xuất năm 1990 [5]. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các nước nông nghiệp
có nền công nghiệp hóa học chưa phát triển như Việt Nam. Việt Nam là nước sản
xuất nông nghiệp, hằng năm sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học và thuốc
bảo vệ thực vật nhằm nâng cao năng suất cây trồng.
Đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng và phổ biến nhất để
cung cấp và dầu thực vật trên thế giới [23]. Đây là cây trồng có giá trị cao về mặt
dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong nhiều nền sản xuất nông nghiệp. Tại
Việt Nam, đậu tương là loại cây trồng đang được chính phủ ưu tiên phát triển
trong những năm gần đây để đáp ứng nhu cầu chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở một
số địa phương [2]. Mối quan hệ cộng sinh của rễ cây đậu tương và vi khuẩn nốt
sần Rhizobium là một đề tài được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm tại Việt Nam
nhờ vai trò cố định nitơ, bổ sung dinh dưỡng cho đất, hỗ trợ sự phát triển của cây


trồng, góp phần vào tính đa dạng của các chủng vi sinh vật đất,.. Sự hiểu biết về
các đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn nốt sần rất cần thiết làm tiền
đề cho các nghiên cứu tiếp theo về đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài
như hàm lượng dinh dưỡng, điều kiện môi trường… đến sự phát triển và khả
năng cố định đạm của các giống cây họ đậu cũng như các điều kiện sinh thái tối
ưu để vi khuẩn nốt sần thực hiện các chức năng của mình một cách tối ưu nhất.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu đánh giá một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium

trên cây đậu tương tại Đồng Nai ” nhằm đánh giá sự đa dạng của các loài vi sinh
vật cố định đạm cộng sinh với rễ cây đậu tương ở một trong các vùng trồng đậu
tương chính tại Việt Nam, tiến tới tạo các chế phẩm phân bón thích hợp cho từng
vùng đất trồng nông nghiệp.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
1.1.1.

Đối tượng nghiên cứu
Tổng quan chung về cây đậu tương

Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merr, thuộc bộ
Fabaceae, họ Fabaceae, chi Glycine, là cây bụi nhỏ, cao trung bình dưới 1m, có
lông toàn thân. Lá có 3 chét hình bầu dục. Chùm lông mọc ở nách lá, bông có
màu trắng hoặc tím. Trái dài 3 – 4 cm, rộng 0,8 cm, có nhiều lông vàng, mỗi trái
có từ 3 – 5 hạt. Cây đậu tương là cây ngắn ngày, phát triển tốt nhất ở vùng nhiệt
đới, ưa sáng và ưa nhiệt. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ
chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50 cm. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ
phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm 2 [6].
Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập
trung ở tầng đất 0 - 20cm, từ 20-30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít
hoặc không có. Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu
sắc của hoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng.
Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và
thời tiết khác nhau. Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra hoa và
giống chín muộn 45-50 ngày mới ra hoa. Thời gian ra hoa dài hay ngắn theo
giống và theo thời vụ. Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15 ngày.

Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày thứ
10 sau khi hoa bắt đầu nở. Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và sau
đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp[6].
Đậu tương còn gọi là đậu nành là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị
kinh tế cao. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc
nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Hạt đậu
tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trong 100g phần ăn là
34,0g khá cao so với một số thực phẩm thông thường khác (gạo tẻ giã 8,1g/100g
phần ăn, thịt gà ta 20,3g/100g phần ăn, thịt lợn nạc 19,0g/100g phần ăn…) [10].


1.1.2.

Tình hình sản xuất cây đậu tương trên thế giới.

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,
đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích ứng rộng
nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu
Mỹ trên 70%, tiếp đến là châu Á [6].
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới giai đoạn 2011-2016
Năm

Diện tích gieo
trồng (triệu ha)

Năng
suất
(kg/ha)

Tổng sản lượng

(triệu tấn)

2011

103,75

2519,7

261,43

2012

105,35

2289,4

241,18

2013

111,01

2499,9

277,53

2014

117,63

2604,4

306,37

2015

120,79

2675,7

323,20

2016

121,53

2755,6

334,89

Nguồn: (FAOSTAT Data crops, 2016)
Từ bảng số liệu cho thấy, diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương trên
thế giới tăng nhanh trong vòng 5 năm qua. Hàng năm trên thế giới trồng khoảng
hơn 100 triệu ha đã tạo ra một sản lượng đậu tương gấp gần 2 lần so với 15 năm
về trước (sản lượng đậu tương trên toàn thế giới vào năm 2001 khoảng 176,76
triệu tấn – FAOSTAT Data crops).
Vai trò và tình hình sản xuất của cây đậu tương trong nông nghiệp
Việt Nam.

1.1.3.

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như:
chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt
lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng
để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên
liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Đặc điểm


của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao: 120- 127; ngưng tụ ở nhiệt độ: -18
đến -15oC. Từ loại dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp
khác như: làm nến, xà phòng, ni lông v.v...
Trong cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1 ha trồng
đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N [Phạm
Gia Thiều, 2000]. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu
cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng
suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N. Thân lá đậu tương
dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm
0,05%, trong lá: 0,19% .
Ở Việt Nam, cây đậu tương đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây trồng
nông nghiệp đặc biệt là ở các tỉnh miền núi phía Bắc.Đến năm 2007, cả nước đã
hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam bộ có diện tích lớn nhất
(26,2% diện tích đậu tương cả nước), miền núi Bắc bộ 24,7%, đồng bằng sông
Hồng 17,5%, đồng bằng sông Cửu Long 12,4% [2]. Tổng diện tích 4 vùng này
chiếm 80% diện tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển
miền Trung và Tây Nguyên[6]. Do đậu tương là loại cây ngắn ngày và có khả
năng trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên rất thích hợp làm cây trồng luân
canh, xen canh, gối vụ với nhiều loại cây trồng khác nhau làm tăng hiệu quả sử
dụng đất trong nông nghiệp. Tuy nhiên, quy mô sản xuất đậu tương còn nhỏ lẻ và
chưa cạnh tranh được với các loại cây khác. Diện tích trồng đậu tương đã được
mở rộng từ năm 2011 nhưng năng suất và sản lượng còn thấp. Năm 2013, tổng

sản lượng đậu tương toàn quốc mới chỉ đạt 168,4 nghìn tấn đáp ứng khoảng 1/10
nhu cầu. Năng suất tiếp theo (2014 và 2015) vẫn ở mức thấp. Vì thiếu khả năng
cạnh tranh, tới năm 2016, diện tích gieo trồng đậu tương đã bị giảm còn 94 nghìn
ha, sản lượng đạt 147,5 nghìn tấn, năng suất tăng nhẹ 8,2% so với năm 2015. Để
bù đắp sự thiếu hụt về thực phẩm giàu protein trong nước, đồng thời đáp ứng nhu
cầu ngày càng tăng mạnh của nghành công nghiệp thức ăn chăn nuôi và nuôi
trồng thủy sản, Việt Nam phải nhập khẩu một lượng lớn bột đậu từ các nước
khác. Theo số liệu của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn 2017 Ước tính


khối lượng đậu tương nhập khẩu trong tháng 1/2017 đạt 31 nghìn tấn với giá trị
14 triệu USD, giảm 82,3% về khối lượng và giảm 79,7% về giá trị so với cùng
kỳ năm 2016 [1].
Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2011-2016
Năm

Diện tích gieo
trồng (nghìn ha)

Năng
suất
(tấn/ha)

Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

2011

181,1

1,47

266,9

2012

119,1

1,45

173,7

2013

117,8

1,43

168,4

2014

109,4

1,43

156,5

2015

100,8

1,45

146,4

2016

94,0

1,57

147,5

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO). Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn.
Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương rất cao, với hàm lượng
protein từ 38-40 %, lipit từ 15-20%, carbohydrat từ 15-16% và nhiều loại
vitamin và muối khoáng quan trọng cho sự sống [Phạm Văn Thiều, 2006]. Hạt
đậu tương là loại sản phẩm duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời
trên 2 thành phần là protein và lipit. Protein của hạt đậu tương không những có
hàm lượng cao mà còn có đầy đủ và cân đối các axit amin cần thiết. Lipit của
đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no (khoảng 60-70%), có hệ số
đồng hoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm 52-65%, axit oleic chiếm 2536%, axit lonolenoic chiếm 2-3%. Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn có nhiều
loại vitamin như vitamin PP, A, C, E, D, K, đặc biệt là vitamin B1 và B2 [Phạm
Văn Thiều, 2006].
Các yếu tố hạn chế đến sản xuất đậu tương ở Việt nam bao gồm 3 nhóm
yếu tố là: Nhóm yếu tố kinh tế - xã hội, nhóm yếu tố sinh học và nhóm yếu tố

phi sinh học. Yếu tố kinh tế - xã hội cơ bản hạn chế sản xuất đậu đỗ do chính
sách của nhà nước, thủy lợi, cung ứng giống, giá bán đậu tương và quan niệm
của người dân về trồng cây đậu tương [14]. Nhóm yếu tố sinh học hạn chế sản
xuất đậu tương ở Việt Nam là sâu bệnh hại và thiếu giống cho năng suất cao
thích hợp với từng vùng sinh thái Đậu tương. Tại Việt Nam đã phát hiện ra trên
70 loại sâu hại thuộc 34 họ, 8 bộ và 17 loại bệnh. Trong đó 12-13 loại sâu và 45 loại bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng. Đối với đậu tương, các loài sâu hại
nguy hiểm nhất là giòi đục thân, sâu xanh, sâu đục quả, bọ xít, bọ nhảy, bọ trĩ,
nhện [14].
Các loại bệnh phổ biến hại đậu tương là lở cổ rễ, gỉ sắt, sương mai, đốm
chấm vi khuẩn, virus hại lá. Trong các loại bệnh trên ở miền Bắc bệnh gỉ sắt
thường gây hại nặng trong vụ Xuân. Bệnh gỉ sắt đã được phát hiện, có mặt và
gây thiệt hại trên tất cả các vùng trồng đậu tương trong cả nước, bệnh gây hại
nặng làm năng suất đậu tương giảm tới 40 - 50% [3].
Nhóm các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sản xuất đậu tương ở nước
ta chủ yếu là đất đai và điều kiện khí hậu bất thuận [14]. .
Về yếu tố đất và dinh dưỡng: ở nước ta nông dân chưa thực sự coi cây
đậu tương là cây trồng chính, nên đậu tương thường được trồng trên đất bạc
màu phần lớn nghèo dinh dưỡng, đồng thời việc đầu tư thâm canh lại hạn chế
nên chưa phát huy hết tiềm năng sẵn có của cây. Có 16 nguyên tố cần thiết cho
sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương, trong đó, 3 nguyên tố Carbon (C),
Hydro (H) và Oxy (O) là thành phần chủ yếu trong chất khô và được hấp thụ
dưới dạng CO2, H2O và O2 tự do trong không khí. Những nguyên tố vi lượng
cần thiết khác cho sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương là N, P, K,
Ca, Mg, S, Fe, Mn, Mo, Cu, B, Zn và Cl. Bên cạnh đó Coban (Co) là nguyên
tố cần thiết cho việc cố định đạm (N) và cũng được coi là nguyên tố cần thiết
[14].
Trước đây, bón phân là biện pháp cần thiết để tăng năng suất cho cây đậu
tương. Ngày nay, việc sử dụng phân vô cơ nhiều và không hợp lý đã làm cho môi

trường đất ngày càng xấu đi, môi trường bị ô nhiễm, không hiệu quả về mặt kinh
tế. Khi bón đạm, cây chỉ sử dụng 40 – 60 %, phần còn lại nằm trong đất lâu ngày
tích tụ lai thành chất độc gây ô nhiễm đất. Các nhà nghiên cứu về dinh dưỡng
cây trồng thường nói đến những ảnh hưởng của hàm lượng nitrat quá cao trong
nông sản có thể gây ung thư. Việc bón thúc đạm sẽ làm cho hàm lượng nitrat tích
lũy trên mặt đất và làm giảm chất lượng nước. Khi bón đạm từ phân khoáng và
phân hữu cơ thì sẽ có một lượng khí thải được đưa vào không khí. Trước hết là
khí NH3 làm ô nhiễm môi trường không khí (có mùi khó chịu, gậy ngộ độc đối
với người và động vật), ngoài ra còn khí NO 2 làm ảnh hưởng đến tầng ozon,
thường số lượng khí N2O sản sinh ra từ phân bón là 15%. Trong phân chuồng,
phân bắc chưa hoại mục có chứa nhiều mầm bệnh cho người và gia súc và còn
có thể gây hại cho rễ cây, vì vậy bón phân chuồng khi chưa hoại mục sẽ phản tác
dụng.
Trong nghiên cứu và trong thực tế đã cho thấy nhu cầu dinh dưỡng vi
lượng của cây đậu tương dù rất nhỏ những ảnh hưởng của chúng tới sinh trưởng
và phát triển của đậu tương lại rất lớn, không kém các nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng. Các nguyên tố vi lượng giữ nhiều vai trò phức tạp trong dinh dưỡng của
thực vật, nhưng hầu hết đều thực hiện các chức năng của hệ thống enzyme, giữ
vai trò thiết yếu trong chuỗi phản ứng phức tạp của quang hợp và các quá trình
trao đổi chất. Sự thiếu vi lượng rất khó nhận biết do triệu chứng khác nhau, dễ
lẫn với triệu chứng do bệnh hại, đặc biệt là do virus. Nếu thiếu vi lượng, quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây bị ảnh hưởng lớn, gây tổn thương sinh lý
nghiêm trọng trong cây, sức nảy mầm kém, rễ phát triển yếu, lá non bị vàng mất
khả năng quang hợp, quả và hạt dễ bị biến dạng, kém chất lượng, nâng suất cây
trồng giảm, sâu bệnh phát triển nhiều… Nhiều năm gần đây, nhu cầu bón phân vi
lượng của nông dân trở thành thiết yếu đến mức có hàng ngàn sản phẩm phân
bón trên thị trường đều phối trộn các loại vi lượng, chưa kể đến rất nhiều các loại
phân bón vi lượng trong danh mục phân bón Việt Nam. Tuy vậy, những nghiên
cứu về phân bón vi lượng cho các loại cây trồng trên những loại đất khác nhau
còn rất ít. Vì vậy, khi bón nhiều phân vi lượng nhưng thiếu cơ sở khoa học không

chỉ tăng chi phí sản xuất mà còn có nguy cơ gây ngộ độc như tình trạng thừa Ze,
Fe, B, Mn trên cây lúa, thừa B trên khoai lang, dưa chuột, dứa… đã làm thiệt hại
lớn đến hiệu quả kinh tế và môi trường. Hiện nay, đã có nhiều biện pháp được áp
dụng để giải quyết những bài toán trên cho cây đậu tương như bón phân hợp lý,
luân canh, xen canh giữa các loại cây trồng để phòng trừ sâu bệnh. Tuy nhiên,
năng suất đậu tương vẫn còn thấp khiến cho giá thành chưa cạnh tranh trên thị
trường.
Vi khuẩn cố định nitơ

1.2.

Theo các nghiên cứu cho thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta,
cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ. Theo thống kê hàng năm các sản
phẩm nông nghiệp trên thế giới đã lấy đi khỏi đất 100 – 110 triệu tấn nitơ [5].
Trong đó khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần
lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp bởi một
quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ tự do vi sinh vật thực
hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp
chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng vào hai
nhóm lớn:
•

•

Nhóm vi khuẩn cố định N tự do gồm:
- Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp.
- Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium
Nhóm vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu

Rhizobium …
1.2.1. Nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do
1.2.1.1. Nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do hiếu khí
Azotobacter spp. là vi khuẩn hiếu khí sống tự do tìm thấy trong đất. Đây là
những vi khuẩn dị dưỡng có khả năng cố định trung bình 20 kgN/ha/năm. Bên
cạnh đó, những vi khuẩn này cũng tạo ra các chất thúc đẩy tăng trưởng và được
cho là có tính đối kháng tác nhân gây bệnh. Azotobacter spp. được tìm thấy trong
đất và vùng rễ của nhiều loài thực vật và số lượng vi khuẩn dao động không đáng
kể khoảng 104/g đất tùy thuộc vào hóa lý và vi sinh vật(tính tương tác của vi


khuẩn). Azotobacter chroococcum là loài phổ biến nhất được tìm thấy nhưng các
loài khác được mô tả bao gồmA.agilis, A.vinelandii, A. beijerinckii, A.insignis,
A. macrocytogenes và A. paspali. Trong đất, số lượng vi khuẩn Azotobacter spp
bị ảnh hưởng bởi tính chất hóa lý đất (ví dụ: chất hữu cơ, pH, nhiệt độ, độ sâu
của đất, độ ẩm của đất) và vi sinh vật (ví dụ: tương tác vi sinh vật) tính chất [22].
Nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do kỵ khí
Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả năng cố định nitơ không khí:
Cl. pastuerianum, Cl. acetobutylicum, Cl. felsineum. Chúng thuộc một nhóm
phân loại nhưng khác nhau về đặc điểm hình thái sinh học và sinh lý sinh hóa
học. Cl. pasteurianum có khả năng đồng hóa nitơ phân tử mạnh mẽ nhất. Tế bào
là loại trực khuẩn khá lớn, dài 1,5 – 8 µm và rộng 0,8 – 1,3 µm [15]. Đây là
nhóm dị dưỡng hóa năng lượng hữu cơ, các nguồn hữu cơ chúng sử dụng:
monosaccarit, disaccarit và một số polysaccarit nhiều rượu, các axit hữu cơ trong
đó bao gồm các hợp chất thơm.
1.2.2.

Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với rễ cây họ đậu và phân
loại

Trong các hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh giữa vi
khuẩn nốt sần (Rhizobium) và cây họ đậu là quan trọng nhất, ước tính đạt trên 80
triệu tấn mỗi năm, tương đương với lượng phân đạm vô cơ trên toàn thế giới sản
xuất năm 1990. Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, mỗi nốt sần là một nhà
máy phân đạm mini, trong đó cây chủ vừa là chỗ trú ngụ đồng thời cũng là
nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình cố định nitơ của vi khuẩn và nhận lại
lượng đạm từ quá trình cố định nitơ để cung cấp cho quá trình tổng hợp đạm
trong thân, lá, hoa quả [5].
Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút của
rễ cây họ đậu và tạo thành nốt sần nên còn được gọi là vi khuẩn nốt sần. Giữa
cây họ đậu và vi khuẩn nốt sần có mối quan hệ cộng sinh: là quan hệ mà cả hai
loài cần có nhau và dựa vào nhau để phát triển, trong đó vi khuẩn nốt sần cố định
đạm nitơ từ trong không khí cho cây và ngược lại cây trồng cung cấp dinh dưỡng


cần thiết để vi khuẩn nốt sần tồn tại và sinh trưởng [13]. Hình dáng, kích thước,
màu sắc và vị trí nốt sần trên cây rất khác nhau, phản ánh tình trạng liên kết giữa
vi khuẩn nốt sần và hiệu quả cố định nitơ. Căn cứ vào hiệu quả cố định nitơ, hai
loại nốt sần được phân biệt, đó là nốt sần hữu hiệu và nốt sần vô hiệu.Dựa vào số
lượng, kích thước và màu sắc thịt nốt sần, có thể đánh giá được hiệu quả của quá
trình cố định nitơ của cây đậu tương và chủng vi khuẩn tương ứng. Rễ cây có
mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn
nốt sần tốt.
Vi khuẩn Rhizobium có trong đất, có thể xâm nhiễm vào rễ cây họ đậu tạo
thành nốt sần cho nên còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn Rhizobium thuộc
loại vi khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, kích thước 0,5÷0,9 x 1,2÷3 micromet.
Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, không sinh bào tử, sinh sản
bằng cách phân bào.
Dựa vào tốc độ phát triển trên môi trường đặc nhân tạo, người ta chia vi

khuẩn nốt sần thành 2 loại:
+ Loại mọc nhanh như Rhizobium meliloti sống cộng sinh với cây linh
lăng, cây hồ lơ ba (R. legusminosarum) với cây cỏ chẽ ba, đậu xanh, đậu Hà
lan, đậu tằm… loại này có chu kỳ sinh trưởng 2 – 4 giờ. Trên môi trường
thạch đĩa tạo khuẩn lạc đường kính 2 – 4 mm sau 3 – 5 ngày nuôi cấy.
+ Loại mọc chậm như Bradyrhizobium japonicum sống cộng sinh với cây
đậu tương hay Bradyrhizobium sp. (lupines) trong cỏ lupin loại này có chu kỳ
sinh trưởng 6 – 8 giờ. Khuẩn lạc hình thành trên môi trường thạch đĩa sau 5 –
7 ngày nuôi cấy. Đường kính khuẩn lạc nhỏ không quá 1 mm.
Vi khuẩn nốt sần thuộc loại vi khuẩn gram âm, phát triển tốt ở nhiệt độ 28 –
30°C, pH 6,5 – 7,0. Trên môi trường đặc, Rhizobium thường tạo khuẩn lạc tròn,
lồi, mép nhãn, bóng, nhày, đục không màu. Chúng sử dụng nhiều nguồn đường
khác nhau, một vài axit hữu cơ, thậm chí cả polisacarit làm nguồn cung cấp năng
lượng. Vi khuẩn Rhizobium có thể phát triển trong môi trường nghèo đạm.
Nguồn đạm thường là pepton, axit amin …


Hiện nay ngoài dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa, các nhà
nghiên cứu dựa vào phân tích trình tự gen 16S - rDNA và các gen mã hóa cho
các enzym nitrogenase và một số gen mã hóa đặc biệt để phân biệt vi khuẩn cộng
sinh trên cây với các loài vi khuẩn khác. Thông qua đó nhiều loài vi khuẩn mới
đã được tìm ra và phân nhóm cũng cụ thể hơn. vi khuẩn cộng sinh với cây họ
đậu được mô tả thuộc ba phân lớp phát sinh loài chính: α, β và
γ- Proteobacteria. Hơn 98 loài được phân thành các nhóm trong 11 chi thuộc
phân lớp α-Proteobacteria và 2 chi thuộc về Burkholderiales trong phân lớp βProteobacteria, và cuối cùng, một chi thuộc về Pseudomonales trong phân lớp
γ- Proteobacteria [17].
Phân lớp alpha của Proteobacteria: Nhánh này được chia thành ba nhánh
phụ tương ứng với chi Rhizobium ensifer (trước đây là Sinorhizobium) [17].
Nhánh đầu tiên tương ứng với chi Rhizobium gồm ba mươi bốn loài, từ
các vật chủ khác nhau và bao gồm R. leguminosarum , R. tropici, R. etli, R.

gallicum, R. mongolense, R. undicola [Halima Berrada1 and Kawtar FikriBenbrahim, 2014] và các loài khác có tên trước đây là Agrobacterium . Các
thành viên của chi này là các vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, từ 0,5 đến 0,9
μm chiều rộng và chiều dài 1,2 đến 3 μm, thường có vùng không bị đổi màu do
sự hiện diện của polyme β-hydroxybutyrat (PHB). Những vi khuẩn này không
hình thành bào tử nhưng lại di chuyển phân cực hoặc bằng lông rung (4-6), hiếu
khí, di dưỡng. Chúng sẽ thay đổi hình thái khi ở trong điều kiện bất lợi. Có một
số loài ở chi này qua quan sát không tạo thành nốt sần, do đó, chúng không phù
hợp với định nghĩa chức năng của Rhizobia. Bao gồm các loài trước đây gọi
là Agrobacterium (ví dụ: R. larrymoorei, R. rubi , và R. vitis ). Tuy nhiên, gần
đây có nhiều bằng chứng cho thấy rằng một số loài Agrobacterium có thể cộng
sinh
cây
họ
đậu. Ví
dụ
một
số chủng R.
radiobacter,
Phaseolusvulgaris, Campylotropis spp, Cassia spp và Wisteria sinensis. Cả hai
nốt sần và các khối u được hình thành trên Phaseolus vulgaris bởi chủng R.
rhizogenes có chứa Symplasmid [17].


Nhánh thứ hai tương ứng với chi Ensifer (trước đây là Sinorhizobium) và
bao gồm loài E. fredii, E. meliloti, E. terangae và E. sahelense [17], E.
medicae, E. kostiense và E. arboris, E. xingianense, E. adhaerens, E.
kummerowiae, E. americanum, E. mexicanus và E. numidicus. Các vi khuẩn
thuộc chi này thường là trực khuẩn, 0,5 đến 0,9 μm chiều rộng và dài 1,2 đến 3
μm, di chuyển bằng roi, Gram âm, đa hình, hiếu khí và tích lũy PHB. Sinh
trưởng tối ưu ở 25-30°C (10-35°C), pH 6-8 (5-10,5) và độ muối NaCl 1% [17].

Trước đây, Sinorhizobium được tách ra khỏi Rhizobium và Bradyrhizobium và đề
xuất thành một chi mới của rhizobia cộng sinh đậu tương.
Chi phụ Mesorhizobium: Chi phụ của Mesorhizobium chứa gần 30 loài
như: M. loti, M. huakuii, M. ciceri, M. mediterraneum, M. tianshanense, M.
Plurifarium, M. amorphae, M. muleiense, M. qingshengii, M. robiniae và M.
tamadayense. Điểm đặc trưng của chi này là tốc độ tăng trưởng trung bình trong
họ rhizobia. Chúng là các trực khuẩn Gram âm, di chuyển bằng roi, hiếu khí, tích
tụ PHB. Chúng đồng hóa glucose, rhamnose và sucrose để tạo thành axit [17].
Chi phụ Azorhizobium: chi này gồm ba loài vi khuẩn cộng sinh Azorhizobium
caulinodans, A. dodereinereae và A. oxalatiphilum, Các loài thuộc chi này
thường ngắn tương tự như Rhizobium, có lông rung nhưng lại có khả năng tạo ra
một phản ứng kiềm với glucose như Bradyrhizobium . . Các chủng này phân hủy
axit béo, axit hữu cơ và rượu, là những chủng duy nhất có thể sử dụng rượu
trong Rhizobia. Tốc độ tăng trưởng trung bình của các loài thuộc chi
Azorhizobium từ 7-9 h. [17]
Chi Bradyrhizobium: Chi này đã được xác định bao gồm tất cả các chủng
Rhizobia phát triển chậm với thời gian sinh trưởng từ 10-12h. Đây là những trực
khuẩn đơn cực hoặc dưới cực. Khuẩn lạc thường có đường kính không vượt quá
1 mm trong môi trường YMA. Những vi khuẩn cộng sinh này sử dụng nhiều loại
đường và axit hữu cơ nhưng thích hợp nhất vẫn là các pentose, và thường sinh
chất nhầy có dạng polysaccharit [17].


Chi này bao gồm, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium elkanii,
Bradyrhizobium liaoningense . Gần đây, B. huanghuaihaiense được định nghĩa là
một loài mới được xếp vào với các chủng Rhizobium phân lập từ các nốt trên cây
đậu tương Glycine max L [17].
Phân lớp beta của Proteobacteria:
Chi phụ Burkholderia: Về đặc điểm hình thái chính, chúng là trực khuẩn,
Gram âm, di chuyển bằng một hoặc nhiều roi, hiếu khí nghiêm ngặt, catalase

dương tính, oxidase tùy thuộc vào loài, có thể phát triển bằng cách sử dụng như
nguồn carbon như:glucose, glycerol, inositol, galactose, sorbitol, mannose
(không giống như Ralstonia sp. không sử dụng đường này) và mannitol. Chi này
có 39 loài bao gồm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn gây bệnh cho người, cũng như
các vi khuẩn cố định đạm như Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia
kururiensis.
1.2.3.

Vai trò của vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ.

Khí nitơ chiếm khoảng 76% bầu không khí bao quanh chúng ta, trên mỗi
hecta đất trọng lượng của nó nặng tới 80.000 tấn. Khí nitơ thường xuyên được
hình thành và bổ sung vào không khí do quá trình phản nitrat hoá. Con người,
động vật, thực vật đều cần đạm, tuy nhiên đại đa số sinh vật đều không sử dụng
trực tiếp khí nitơ, chỉ có nhóm sinh vật cố định nitơ là có khả năng này. Hàng
năm, nhu cầu sử dụng nguồn nitơ của cây trồng trên toàn thế giới lên đến hàng
trăm triệu tấn, tuy nhiên, phân bón hoá học chỉ đáp ứng được khoảng 30%, lượng
còn lại là do quá trình cố định nitơ phân tử cung cấp. [11]. Quá trình này được
thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây
họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ
NH3 sẽ tổng hợp ra các chất chưa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời
làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh,
ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme
nitrogenase mới hoạt động).


Cơ chế của quá trình: Để phá vỡ được liên kết 3 bền vững trong phân tử
nitơ N ≡ N này bằng phương pháp hoá học cần phải tiến hành ở nhiệt độ và áp
suất rất cao. Ví dụ như muốn tạo thành xianamit canxi là một loại phân đạm hoá
học người ta phải tiến hành phản ứng giữa nitơ phân tử và cacbit canxi ở nhiệt độ

1000 – 1100oC [11].
CaC2 + N2 → CaCN2 + C
Nhóm vi khuẩn cố định nitơ có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở các
điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất. Quá trình cố định nitơ sinh học là
một quá trình khử N2 thành NH3 dưới tác dụng của men nitrogenaza sinh ra bởi
vi sinh vật [11].
N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O → 2NH4+ + 12 ADP + 12P + 4H+
Nitrogenaza đã được tách ra từ Azotobacter vinelandii – 1 loài vi khuẩn cố
định nitơ sống tự do trong đất. Nitrogenaza bao gồm hai thành phần khác nhau, 1
thành phần gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo. Electron của
các chất khử sẽ đi vào thành phần thứ 1 của nitrogenza (phần có chứa protein và
sắt) sau đó được chuyển sang thành phần thứ 2, qua đó electron được hoạt hoá có
thể phản ứng với N2. N2 cũng đi qua 2 thành phần của nitrogenase và được hoạt
hoá. Hydro được hoạt hoá nhờ các enzym của hệ thống hydrogenase [11]. Năng
lượng dùng trong quá trình này là ATP của tế bào. Cuối cùng NH 3 được hình
thành. Có thể tóm tắt trong sơ đồ sau:

Hình 1.1. Quá trình hình thành NH3 (Lê Xuân Phương, 2007)
Ở vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu, cơ chế cố định nitơ
có liên quan đến thực vật. Vai trò của thực vật ở đây chính là sự hình thành


Leghemoglobin, chất này đóng vai trò chuỗi chuyển điện tử từ quá trình quang
hợp của cây vào nitrogenase của vi khuẩn [11]. Enzym nitrogenase của vi khuẩn
nốt sần sống cộng sinh với cây đậu cũng có cấu trúc giống như nitrogenase của
vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất.
Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh
có thể biểu diễn bởi sơ đồ sau:

Hình 1.2. Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định

nitơ cộng sinh (Lê Xuân Phương, 2007)
1.3.

Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobia

Từ năm 1964 cố định nitơ sinh học được coi là một trong 2 vấn đề quan
trọng nhất của chương trình sinh học quốc tế (IBP) [12]. Khả năng của
Rhizobium để cố định nitơ làm giảm đáng kể việc sử dụng phân bón hóa học
trong nông nghiệp. Trong thực tế, nó đáp ứng gần 90% nhu cầu đạm của thực
vật, đất được là làm giàu với nitơ sẽ được các loại cây trồng sử dụng tiếp mà
không cần phải thêm phân bón hóa chất. Nói chung, sự cộng sinh này có một số
ưu điểm bao gồm cải thiện năng suất nông nghiệp, duy trì và phục hồi độ phì của
đất, giảm giá thành của phân bón và hạn chế ô nhiễm nước ngầm do nitrat.
Nghiên cứu về đa dạng Rhizobium là một nguồn tài nguyên sinh học có giá trị và
những nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi khuẩn với đặc điểm có lợi để tối đa hóa
năng suất nông nghiệp. Vì tầm quan trọng về sinh thái và kinh tế của họ, sự đa
dạng và phân loại của những vi sinh vật này đã được nghiên cứu rộng rãi trong
hai mươi năm qua. Từ một chi bao gồm bốn loài (năm 1981), đến nay đã có ít
nhất 14 chi bao gồm hơn 98 loài và con số này tiếp tục tăng [17].


Ở Việt Nam từ những năm đầu của thập kỷ 60 đã chú ý đến hướng nghiên
cứu về đánh giá các đặc điểm của vi khuẩn Rhizobium và quá trình cố định đạm
sinh học. Nhất là năm 1980 vấn đề này chính thức được đưa vào đề tài cấp nhà
nước với chủ đề “sinh học phục vụ nông nghiệp” nay là “công nghệ sinh học”.
Vào những năm 1993 vấn đề nghiên cứu về quá trình cố định nitơ cộng sinh đã
thu được kết quả, chủ yếu tập trung ở đậu tương và cây lạc [12]. Tuy nhiên
những nghiên cứu này chưa đi sâu về các loài vi khuẩn cố định đạm cộng sinh
với cây đậu tương và đánh giá về phân loại di truyền mà chủ yếu chỉ tách thành
hai nhóm sinh trưởng nhanh và chậm về mặt sinh hóa và hình thái. Kể từ khi

phát hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và trình tự DNA, bộ gen của một số
vi khuẩn đã được giải trình tựgần như là hoàn toàn. So sánh các trình tự gen của
các loài vi khuẩn cho thấy gen RNA ribosomal (rRNA) 16S được bảo tồn cao
trong loài và giữa các loài thuộc cùng một chi, và do đó có thể được sử dụng như
là tiêu chuẩn mới cho việc xác định vi khuẩn. Sử dụng tiêu chuẩn mới này, vi
khuẩn được phân loại và phân loại lại thành các chi mới. Có thể hữu ích trong
việc làm sáng tỏ mối quan hệ của các loài vi khuẩn chưa biết với loài đã biết và
các loài vi khuẩn mới [24].


Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu.
Các nội dung nghiên cứu của đề tài:
-

Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên nốt sần rễ cây đậu
tương tại Đồng Nai Việt Nam.
Định danh và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học những chủng vi khuẩn cố
định đạm Rhizobium đã phân lập.

2.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật cố định đạm cộng sinh với rễ
cây đậu tương tại Đồng Nai.
2.3. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
2.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nốt sần rễ cây đậu tương được thu nhận từ Đồng Nai.
2.3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm vi sinh vật đất. Viện Công nghệ Sinh học. Viện Hàn lâm Khoa
học Công nghệ Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ tháng 11/2017 đến tháng 6/2018
2.3.3 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Các hóa chất: Glucose (Merk, Đức), Manitol (Bio Basic, Canada), Cao nấm men
(Merk, Đức) và các hoá chất thông dụng khác (Trung Quốc)…
Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu:
+ Đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, que cấy,…
+ Box cấy vô trùng
+ Nồi khử trùng
+ Máy lắc
-


+ Máy quang phổ và một số thiết bị phòng thí nghiệm khác.
2.3.4. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường YEMA-CR: 10g/l Mannitơl, 0.5g/l K 2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.1g/l
NaCl, 0.5g/l yeast extract, 20g/l Agar, 2,5ml/l Congo red
- Môi trường YEMA-BTB: 10g/l Mannitol, 0.5g/l K 2HPO4, 0.2g/l MgSO4,
0.1g/l NaCl, 0.5g/l yeast extract, 5ml/l brothymol blue
- Môi trường GPA: 10g/l Glucose, 20g/l pepton, 5g/l Nacl, 20g/l Agarose
- Môi trường Keto-lactose: 10g/l Lactose, 0.5g/l K 2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.2g/l
NaCl, 1g/l Yeast Extract, 20/l Agar, pH 6.8-7.
- Môi trường nitrate: 5g/l Peptone, 3g/l Yeast Extract, 1g/l KNO3, pH 7.0.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp phân lập
2.4.1.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Tại thời điểm cây đậu tương ra hoa rộ, tiến hành thu thập mẫu: có 7 mẫu
(7 hốc) mỗi mẫu gồm 3 – 5 cây ngẫu nhiên, kí hiệu riêng cho từng mẫu thu thập.
2.4.1.12. Phần lập vi khuẩn nốt sần
Rễ cây đậu tương thu nhận được rửa sạch dưới vòi nước. Tách nốt rễ và
khử trùng bằng cồn 70o trong 5 phút, rửa với dung dịch NaClO nồng độ 1%, lắc

30 giây, bỏ dịch, rửa lại sạch bằng nước cất khử trùng (lặp lại 3 lần).
Nghiền mẫu và tiến hành phân lập . Mẫu được pha loãng đến nồng độ
thích hợp. Trang mẫu trên đĩa môi trường YEMA-CR có bổ sung kháng sinh
vancomycin 50mg/ml để loại bỏ các vi khuẩn gram dương và kháng sinh
nystatin để loại bỏ nấm. . Các đĩa phân lập được nuôiở nhiệt độ 28°C. Sau 2 đến
7 ngày quan sát mẫu, các khuẩn lạc phát triển trên môi trường được làm sạch và
giữ trên môi trường YEMA-CR cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học


Kiểm tra khả năng sinh trưởng nhanh hay chậm bằng thử nghiệm
Bromothymol Blue [20]. Nuôi các chủng vi khuẩn trong môi trường lỏng YMABTB trong 3 ngày. Môi trường có màu xanh lá do có phản ứng kiềm thường là
sản phẩm của Bradyrhizobium sp phát triển chậm. Môi trường có màu vàng do
axit thường là sản phẩm của Rhizobium spp và các loài phát triển nhanh.
Phản ứng nhuộm Gram: được thực hiện theo Somasegaran và Hoben
(1984) [20]. Chủng Rhizobium được nuôi trên môi trường YEMA-CR. Sau 2-7
ngày khuẩn lạc bắt đầu mọc trên đĩa. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối
từ đĩa thạch đưa vào một giọt nước cất giữa lam kính. Cố định vết bôi trên ngọn
lửa đèn cồn. Nhỏ dung dịch tím kết tinh vào vết cố định giữ trong 30 giây, rửa lại
với nước cất và làm khô bề mặt. Nhỏ dung dịch lugol vào vết bôi giữ ở 1 phút,
rửa lại với nước và để khô. Nhỏ dung dịch cồn và giữ trong 30 giây cho mất màu
thuốc nhuộm sau đó rửa lại với nước, để khô. Nhuộm bổ sung Safranin O trong
một phút rồi rửa sạch bằng nước và để khô. Soi kính hiển vi Và quan sát hình
thái các chủng vi khuẩn trên kính hiển vi quang học. Vi khuẩn gram âm sẽ bắt
màu hồng của thuốc nhuộm phụ safranin, vi khuẩn Gram (+) bắt mầu tím.
Thử nghiệm GPA: Là thí nghiệm để phân biệt Rhizobium với vi khuẩn
Agrobacterium [19]
Thử nghiệm Keto-lactose: là thí nghiệm được sử dụng rộng rãi để phân
biệt Rhizobia với các vi khuẩn khác. Các chủng vi khuẩn đã phân lập được nuôi
trên môi trường Keto-lactose ở 28oC trong 3-4 ngày. Dùng thuốc thử Benedict

giữ ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ để xác định khảng năng chuyển hóa của các
chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn Rhizobium không làm thay đổi màu sắc của
dung dịch Benedict (từ xanh sang vàng ở môi trường xung quanh khuẩn lạc)
[16].
Kiểm tra khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite: Các chủng vi sinh vật
đã được chọn lọc qua các bước trên được nuôi trong môi trường nitrate ở 30ºC,
lắc 200 vòng/phút, sau 48 giờ, thử khả năng chuyển hóa bằng thuốc thử (acid
Sulfanilic và Alpha-Naphthylamine). Các chủng Rhizobiacó khả năng chuyển