Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số dòng ngô việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ
PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH
CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số : 94202001

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội – Năm 2020

i


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nông Văn Hải
2. TS. Bùi Mạnh Cường
Phản biện 1: ..........................................................
Phản biện 2: ..........................................................

Phản biện 3: ..........................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp
Viện họp tại:
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi ... h ngày ... tháng ... năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư Viện Quốc gia
2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. Thư Viện Viện Nghiên cứu Ngô

ii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở
các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp
ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ... Ngoài những tác động trực tiếp lên quá
trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản xuất nông nghiệp. Việt
Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về
nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có
ngô. Hạn là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn nhất tới năng suất trên phạm
vi rộng lớn, có tính chất toàn cầu, cây ngô cũng không nằm ngoài tác động của hạn,
nhất là những vùng trồng ngô nhờ nước trời. Có nhiều biện pháp tác động đến sự
phát triển ngô trong điều kiện hạn như kỹ thuật canh tác, chọn tạo giống.
Để giải quyết vấn đề trên thì chọn tạo giống ngô chịu hạn là một trong những
giải pháp được các nhà khoa học đặt lên hàng đầu và có tính khả thi cao. Cho đến
nay chọn giống cây trồng chịu hạn nói chung và cây ngô nói riêng được thực hiện

theo 3 hướng chủ yếu: 1) Chọc lọc trực tiếp trên đồng ruộng; 2) Chọn lọc truyền
thống phối hợp chỉ thị phân tử; 3) Chuyển gen chịu hạn.
Ở Việt Nam, chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào cây ngô đã được tập
trung nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, những nghiên cứu về biểu
hiện gen trong các cây chuyển gen chịu hạn còn ít được đề cập đến. Xuất phát từ
những lý do trên đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã
ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số dòng ngô Việt Nam” được
thực hiện.
2. Mục tiêu của đề tài
(1) Tạo được dòng ngô chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A;
(2) Xác định sự có mặt, sự ổn định qua các thế hệ và biểu hiện của gen
ZmDREB2A trên các vật liệu được chuyển gen ở mức phân tử;
(3) Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây ngô chuyển gen mang cấu trúc
gen ZmDREB2A ở điều kiện hạn nhân tạo.
3. Đóng góp mới của luận án
(1) Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ biến nạp cấu trúc vector chứa
gen ZmDREB2A vào ba dòng ngô K1, K3, K7 đến đánh giá biểu hiện gen
ZmDREB2A liên quan đến tính chịu hạn cây ngô Việt Nam;
(2) Ứng dụng kỹ thuật PCR, RT-PCR, southern blot, đánh giá hạn nhân tạo, phân
tích sinh lý, sinh hoá…đã đánh giá được sự có mặt, tính ổn định và biểu hiện
của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng ngô chuyển
gen mang gen ZmDREB2A;
(3) Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận
nghiên cứu tạo dòng ngô chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
4.1. Về mặt khoa học
1


(1) Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện

đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc tăng cường
protein tái tổ hợp ZmDREB2A và biểu hiện chức năng sinh học của gen
chuyển ZmDREB2A trên cây ngô.
(2) Kết quả tạo cây ngô chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật
chuyển gen trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây ngô ở Việt Nam.
4.2. Về mặt thực tiễn
(3) Việc tạo ra các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với
dòng đối chứng đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen
đối với các loại cây trồng khác nhau nhằm nâng cao tính chịu hạn.
(4) Các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn là nguồn vật liệu khởi đầu
cho việc tạo các giống ngô chuyển gen chịu hạn trong nước.
(5) Bố cục của luận án
Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng quan tài
liệu (44 trang); Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả
nghiên cứu và thảo luận (77 trang); Kết luận và đề nghị (02 trang); Các công
trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham
khảo (16 trang): 193 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (23) và tiếng Anh
(170); Phụ lục (13 trang); luận án có 33 bảng, 59 hình.
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1.1. Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô
Trong điều kiện hạn, phản ứng của cây ngô có một số thay đổi như: i) nảy
mầm chậm và tỷ lệ mọc thấp; ii) giảm kích thước cây, một số bộ phận phát triển
không đầy đủ; iii) khí khổng đóng, quá trình quang hợp giảm, thậm trí ngừng trệ
do hệ thống enzyme bị phá huỷ; iv) giảm quá trình đồng hoá dinh dưỡng, kéo dài
thời gian chênh lệch tung phấn phun râu, ngô con phát triển nhưng vô hiệu, giảm
năng suất; v) trong điều kiện hạn nhẹ sẽ tăng tỷ lệ rễ/chồi, trong điều kiện hạn
nặng, hệ rễ kém phát triển, quá trình hấp thụ dinh dưỡng trở nên khó khăn, quá
trình vận chuyển ở thân bị ngừng trệ, tích luỹ dinh dưỡng ở hạt kém.
1.6. Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về nhóm gen mã hóa yếu

tố phiên mã Dreb2A trong phản ứng chịu hạn ở cây trồng
Nghiên cứu hoạt động của các gen nhóm nhân tố phiên mã DREB2 đã khẳng
định rằng, cơ chế thúc đẩy biểu hiện chỉ xảy ra dưới điều kiện bất thuận của môi
trường.
Phân tích cấu trúc của các protein DREB2A cho thấy tồn tại một vùng điều
hòa âm tính ức chế hoạt động của DREB2A. Khi vùng này được cắt bỏ, DREB2ACA được hình thành và có khả năng hoạt động như một nhân tố phiên mã [138].
Tiến hành biểu hiện DREB2A-CA ở Arabidopsis giúp cải thiện khả năng chịu hạn
nhưng lại gây hiện tượng cây còi cọc và không cải thiện khả năng chịu lạnh. Sử
dụng promoter cảm ứng stress RD29A để biểu hiện gen DREB2A-CA giúp duy
trì khả năng chống chịu tốt hơn nhưng vẫn có hiện tượng cây còi cọC. Phân tích
sự khác biệt ở hai nhóm nhân tố phiên mã DREB1A và DREB2A cho thấy sự
2


khác biệt ở vùng trình tự liên kết với ADN điều này dẫn đến việc có sự đáp ứng
khác nhau với các điều kiện stress hạn và khác biệt trong việc các gen chống chịu
được điều hòa biểu hiện bởi hai gen này.
Việc biểu hiện gen DREB2A-CA trên Arabidopsis ngoài điều hòa biểu hiện
các gen chống chịu hạn và mặn mà còn có các gen liên quan đến chống chịu sốc
nhiệt đó là nhóm Heat shock protein (HSP)C. Điều này cho thấy việc biểu hiện
gen DREB2A có khả năng nâng cao tính chống chịu của thực vật với nhiều stress
khác nhau. Vì vậy DREB2A đang được các nhà khoa học quan tâm trong vai trò
cải thiện chống chịu hạn và nhiệt độ cao. Phân tích Microarray xác định các gen
chống chịu nhiệt độ cao được điều hòa bởi DREB2A cho thấy các gen HSP70,
HSFA3. Nhân tố phiên mã DREB2A có khả năng gắn với trình tự DRE trên
promoter gen AtHSFA3 và hoạt hóa biểu hiện của nó.
Ở ngô, năm 2007, nhóm nghiên cứu của Qiu đã phân lập được cDNA
ZmDREB2A từ ngô. ZmDREB2A mã hoá phân tử protein gồm 318 amino acid
chứa vùng gắn với ADNERP/AP2 đặc trưng cho DREB. ZmDREB2Atồn tại hai
dạng cấu trúc mRNA là ZmDREB2A-L và ZmDREB2A-S. Dạng ZmDREB2AL có chiều dài 1336 bp, mã hóa cho đoạn peptide có chiều dài 89 acid amin, chuỗi

peptide không có domain ERF/AP2 gắn với ADN và dẫn đến hình thành dạng
không có chức năng. ZmDREB2A-S có chiều dài 1283bp, mã hóa cho protein
gồm 318 acid amin có các domain ERF/AP2 điển hình của các loại DREB nên là
dạng có chức năng. Dạng S ngắn hơn dạng L 53 bp. Khi có stress thì mRNA
ZmDREB2A-L bị cắt đi 53bp để thành dạng ZmDREB2A-S có hoạt tính và khi
bình thường thì đa phần mRNA ZmDREB2A không bị cắt 53bp và ở dạng
ZmDREB2A-L [128]. Thông qua thí nghiệm biểu hiện trong Arabidopsis, protein
ZmDREB2A đã được chứng minh có khả năng tăng cường sức chống chịu với
điều kiện hạn cho cây.
1.7.3. Nghiên cứu và sản xuất ngô biến đổi gen ở Việt Nam
Vấn đề nghiên cứu và ứng dụng cây trồng chuyển gen ở Việt Nam đang được
đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây. Mặc dù còn nhiều ý kiến khác nhau,
song Việt Nam đã đánh giá cao vai trò và tầm quan trọng của cây trồng biến
chuyển gen trong việc cải tiến năng suất cây trồng, từ đó đã đặt kế hoạch phát
triển lĩnh vực công nghệ gen đến năm 2020 đồng thời ban hành một số thông tư
chính sách về cây trồng chuyển gen nhằm khuyến khích công tác nghiên cứu phát
triển và ứng dụng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam. Đó là các quy định về an
toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của
sinh vật biến đổi gen; quy định về việc xác nhận sản phẩm biến đổi gen đủ điều
kiện sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, cũng như quy định khảo nghiệm
đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của cây trồng biến đổi
gen... Những nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn các gen quý, thiết kế vector…
hiện đang được thúc đẩy. Tuy nhiên các nghiên cứu trên lĩnh vực này mới chỉ là
khởi đầu và hầu hết sản phẩm nghiên cứu đang được đánh giá, phân tích và duy
trì trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính, nhà lưới.
3


Cho đến nay, Việt Nam chưa tạo được giống cây trồng biến đổi gen ở cấp độ
được chấp nhận cho sản xuất và thương mại hóa. Một số nghiên cứu trong lĩnh

vực chuyển gen mới chỉ được tiến hành trong phạm vi phòng thí nghiệm, nhà
kính/nhà lưới tại một số viện nghiên cứu. Một số gen như chịu hạn, chịu lạnh,
kháng sâu bệnh đã được phân lập, tách chiết và thiết kế vector hiệu quả trong việc
chuyển nạp vào cây trồng bằng những phương pháp chuyển gen khác nhau.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
20 dòng ngô gồm: V64, K2, K5, C502N, C88N, M67, C433, K10, K1, K3,
K7, 952-TG1, 2224-TG1, N3-TG1, K4, K8, K9, K17, 1257-TG1, N18-TG13 do
Viện Nghiên cứu Ngô chọn tạo được dung làm vật liệu đánh giá khả năng tái sinh;
trong đó có 03 dòng ngô K1, K3, K7 được dùng làm vật liệu nhận gen. Các dòng
ngô này có khả năng tái sinh cao và có tính trạng nông sinh học tốt.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ Viện nghiên
cứu Hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: vi khuẩn
E.coli chủng DH5α; vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA4404.
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Vector tách dòng pUC57 mang gen ZmDREB2A được tổng hợp từ hãng
Genscript. Vector pRTRA7/3 do GS.TS. Udo Conrad - Phòng thí nghiệm Kháng
thể thực vật thuộc Viện Di truyền thực vật và Nghiên cứu cây trồng (IPK)
Gatersleben, Cộng hòa Liên bang Đức cung cấp. Vector pBY do Trường Đại học
Michigan (Mỹ) cung cấp. Vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300 do Trung tâm
ứng dụng sinh học phân tử vào Nông nghiệp Quốc tế (CAMBIA) Australia cung
cấp/gửi tặng.
Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.1) sử dụng làm mồi cho PCR và mà mẫu dò
cho thí nghiệm lai ADN được thiết kế dựa trên các trình tự đã được công bố trên
GenBank và được đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Đánh giá khả năng tái sinh và đặc điểm nông sinh học của một số

dòng ngô;
Nội dung 2. Thiết kế và biến nạp vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A
thông qua vi khuẩn A.tumefaciens vào một số dòng ngô Việt Nam;
Nội dung 3. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen
ZmDREB2A ở thế hệ T1, T2, T3;
Nội dung 4. Xác định hàm lượng chlorophyll, proline, cacbonhydrate và đánh giá
khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định dòng ngô có khả năng tái sinh cao (Armstrong, 1985)
4


2.3.2. Phương pháp theo dõi đặc điểm nông sinh học, chọn tạo dòng làm vật liệu
chuyển gen. Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm tiến hành theo QCVN
01-56: 2011/BNNPTNT
2.3.3. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen ZmDREB2A (Sambrook, 2001)
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens (Frame, và
cs (2002, 2006, 2011) và Ishida Yuji và cs (2003,2007).
2.3.5. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A
bằng kỹ thuật PCR (Sambrook, 2001).
2.3.6. Đánh giá sự biểu hiện của gen thông qua RT-PCR, lai Western (Joyce,
(2002) và (Sambrook, 2001).
2.3.7. Xác định hàm lượng Chlorophyll (Porra, 2006), proline (Bates và cs, 1973),
cacbonhydrate (Zheng, 2010) trong cây chuyển gen.
2.3.8. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen (Camacho, 1994 và Zaidi, 2002).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng tái sinh và đặc điểm nông học của một số vật liệu
3.1.1. Đánh giá khả năng tái sinh của một số vật liệu nghiên cứu
Nhằm xác định vật liệu có khả năng tái sinh cao, 20 dòng ngô đã được trồng,

thu bắp non sau khi thụ phấn 12 ngày. Áp dụng quy trình tái sinh cây ngô từ phôi
non đã xây dựng được để đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây cho các
nguồn vật liệu. Kết quả khả năng tái sinh của các nguồn vật liệu được thể hiện ở
bảng 3.1: khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh phụ thuộc vào
kiểu gen. Dòng K5 có khả năng tạo mô sẹo lớn nhất (73,5%) tiếp đến dòng K8
(68,7%). Dòng C88N có khả năng tạo mô sẹo thấp nhất (3,2%). Các dòng còn lại
có tỷ lệ tạo mô sẹo từ 13,3% - 63,2%. Khả năng tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh:
Dòng K3 mặc dù có tỷ lệ tái sinh cao nhất (48,7%), cao hơn dòng K2 (29,5%)
song lại có tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh thấp hơn nguồn K2 (68,5%). Các dòng có tỷ
lệ tái sinh cao là: K3 (48,7%) và tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh cao (45,9%); Dòng K7
(35,8%; 45,7%). K1 (36,8%; 52,8%); 1257 –TG1 (45,7%; 44,8%)… Dòng C88N
không có khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây và tạo cây hoàn thiện. Dòng C433 mặc
dù có tỷ lệ tái sinh không thấp (21,0%) nhưng tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh thấp (5,3%).
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo cây tái sinh từ phôi non của mô ̣t số dòng ngô Việt Nam
Tỷ lệ tạo
Số cây tạo
Số cây
Số phôi cấy mô sẹo phôi
cây hoàn
TT
Tên dòng
tái sinh (%)
hoá (%)
thiện (%)
V64
1800
23,1
12,4
21,5
1

2
K2
2550
63,2
29,5
68,5
3
K5
3700
73,5
22,4
33,3
C502N
1800
23,4
12,1
13,3
4
C88N
2500
3,2
5
5


6
7
8
9

M67
C433
K10
K1

1300
690
1000
600

24,4
29,8
13,3
76,4

31,3
21,0
21,4
36,8

13,2
5,3
15,4
52,8

10
11
12
13
14

15
16
17
18
19
20

K3
952-TG1
2224-TG1
N3-TG1
K4
K7
K8
K9
K17
1257-TG1
N18-TG1

600
300
300
300
600
600
600
600
600
300
300

75,9
68,9
61,9
60,8
48,9
77,5
68,7
34,6
32,9
55,8
56,9

48,7
34.1
33.6
28.7
38,9
35,8
31,5
12,8
23,9
45,7
41,5

45,9
37.3
44.8
34.8
44,8

45,7
40,4
24,6
25,8
44,8
38,5

Tóm lại, qua kết quả đánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh và tạo cây hoàn
chỉnh, xác định được 12 dòng có khả năng tái sinh cao là K2, K5, K1, K3, 952TG1, 2224-TG1, N3-TG1, K4, K7, K8, 1257-TG1, N18-TG1. Bên cạnh các dòng
này có tỷ lệ tái sinh cao, các dòng được đánh giá đặc điểm hình thái, khả năng
sinh trưởng và phát triển, khả năng kết hợp của các dòng nhằm mục đích lựa chọn
nguồn vật liệu ưu tú nhận gen cho các thí nghiệm chuyển gen sau này.
3.1.2. Đặc điểm nông, sinh học của các dòng có tỷ lệ tái sinh cao
Kết quả đánh giá về thời gian sinh trưởng, đặc điểm hình thái, khả năng chống
chịu và năng suất của các dòng cho thấy: Các dòng có thời gian sinh trưởng từ
ngắn đến trung bin
̀ h, có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh hại, năng suất
ổn định giữa 2 vụ.
Bảng 3.6. Hình thái bắp, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất
thực thu của các dòng thí nghiệm năm 2014
T
T

Dòng

Số hàng
hạt/bắp
X
T

Số hạt/hàng
X

T

Khối lượng
1000 hạt (gram)
X
T

1

K1

13,3

14

26,5

25,7

235,5

227,8

2

K2

12,0

12,0

25,4

25,4

241,3

234,6

3

K3

10,0

10,6

28,7

27,2

242,5

241,5

4

K4

12,7

12,0

28,3

26,4

235,4

238,4

5

952TG1

12,0

12,0

27,6

26,5

225,6

231,4

6

Tỉ lệ hạt/bắp
(%)
X
T
69,
71,2
7
67,
68,5
5
68,
68,1
5
65,
66,6
5
66,
67,4
5

Năng suất
(tạ/ha)
X
T
25,5

24,8

25,3

23,6

27,2

25,4

27,1

25,3

25,6

22,3


6

2224
-TG1

12,0

12,4

24,5

25,4

235,5

241,3

7

K7

12,0

12,0

27,5

26,5

241,5

237,6

8

K8

14,7

14

26,3

27,3

224,6

231,5

9

N3TG1

10,0

10,8

26,4

26,5

234,2

242,3

K5

12,7

12

27,1

26,7

243,5

245,2

13,3

14

26,3

25,6

237,6

241,4

12,0

12,7

25,6

26,3

234,5

236,5

10
11
12

1257
-TG1
N18TG1

CV%
LSD 0.05
Ghi chú: X: vụ xuân; T: vụ Thu

67,
8
71,
2
69,
5
65,
4
68,
7
66,
6
67,
2

66,9

25,4

23,4

70,5

27,5

26,1

70,1

26,5

24,5

67,8

26,1

23,4

70,2

25,2

22,5

68,7

24,1

21,7

66,5

22,8

21,5

7,32

6,58

3,55

4,05

Qua theo dõi, số hàng hạt/bắp của các vật liệu vụ Xuân dao động từ 10,0 14,7 hàng và Thu từ 10,6 - 14 hàng. Các dòng có số hàng hạt/bắp cao trong cả vụ
Xuân và Hè thu gồm K1, K8 và 1257-TG (13,3 - 14,7 hàng/bắp).
Đối với tính trạng số hạt/hàng, nhìn chung các dòng có chiều dài bắp dài thì
có số hạt/hàng nhiều hơn, tuy nhiên còn phụ thuộc vào dạng hạt của từng dòng.
Số hạt/hàng của các dòng dao động từ 24,5- 28,7 hạt/hàng trong vụ Xuân và từ
25,4 – 27,3 hạt/hàng trong vụ Hè thu. Nhìn chung, số hạt/hàng của các dòng trong
vụ Xuân cao hơn so với vụ Thu (Bảng 3.6).
Khối lượng 1000 hạt trong vụ Xuân dao động từ 224,6 - 243,5 gam, vụ Thu
từ 227,8 - 245,2 gam. Trong đó, dòng có khối lượng 1000 hạt cao nhất K5 (243,5
– 245,2 gam). Tỷ lệ hạt/bắp giữa các dòng có sự khác nhau đáng kể, dao động từ
65,4 – 71,2% vụ Xuân và 66,6 – 71,2% vụ Thu (Bảng 3.6).
Năng suất luôn được xem là chỉ tiêu quan trọng hạng đầu khi đánh giá vật
liệu, có thể dự đoán tiềm năng năng suất của dòng/giống.Tính trạng năng suất do

đa gen quy định và bị tác động rất nhiều bởi yếu tố môi trường và điều kiện canh
tác. Đặc biệt, năng suất bị ảnh hưởng rõ rệt bởi các yếu tố bất thuận như hạn, úng,
hay sâu bệnh hại. Kết quả tính toán năng suất lý thuyết của các nguồn vật liệu ở
bảng 3.6 cho thấy: Trong vụ Xuân, có sự biến động về năng suất của nguồn vật
liệu khác nhau với giá trị độ biến động CV% =7,32%, đạt yêu cầu về độ biến động
đối với thí nghiệm đồng ruộng. Các dòng có năng suất lý thuyết vụ Xuân dao động
từ 22,8- 27,2 tạ/ha và vụ Thu từ 21,5 - 26,1tạ/ha. Năng suất các dòng trong vụ Thu
có xu hướng thấp hơn vụ Xuân, điều này có thể được lý giải do thời tiết lạnh và
thiếu ánh sáng ở cuối vụ Thu tác động đến quá trình quang hợp và vận chuyển
dinh dưỡng vào hạt của các dòng.
Ngoài những đặt tính tốt về khả năng chống chịu sâu bệnh hại và cho năng
suất ổn định, 12 dòng ngô thuần trên đã được duy trì và lai tạo trong nhiều năm
qua tại Viện Nghiên cứu Ngô. Nhìn chung chúng đã và đang cho khả năng kết
hợp tốt, các dòng đang là bố hoặc mẹ của một số tổ hợp lai triển vọng…
7


Căn cứ kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh của 20 nguồn vật liệu và kết quả
theo dõi thí nghiệm đồng ruộng của 12 nguồn vật liệu trong 2 vụ Xuân và Thu năm
2014, đồng thời dựa vào đánh giá khả năng kết hợp của các dòng, chúng tôi đã lựa
chọn các dòng K1, K3, K7 dùng làm vật liệu chuyển gen.
3.2. Thiết kế và biến nạp vector biểu hiện thực vật mang gen Zm Dreb2A
vào vi khuẩn agrobacterium tumefaciens
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A
Ở cây ngô, tồn tại hai dạng mARN là ZmDREB2A-L và ZmDREB2A-S. Dạng
ZmDREB2A-L có chiều dài 1.336 bp, chỉ mã hóa cho đoạn peptide có chiều dài
89 axit amin, chuỗi peptide không có domain ERF/AP2 gắn với ADN và dẫn đến
hình thành dạng không có chức năng. ZmDREB2A-S có chiều dài 1.283 bp, mã
hóa cho protein gồm 318 axit amin có các domain ERF/AP2 điển hình của các
loại DREB nên là dạng có chức năng. Dạng S ngắn hơn dạng L 53 bp, khi cây gặp

điều kiện bất thuận thì xảy ra quá trình xử lý sau phiên mã mARN dạng
ZmDREB2A-L bị cắt đi 53 bp để thành dạng ZmDREB2A-S có hoạt tính và khi
bình thường thì đa phần mARN ZmDREB2A không bị cắt 53 bp và ở dạng
ZmDREB2A-L [128]. Do vậy, dạng ZmDREB2A-S mới có vai trò trong việc chống
chịu hạn cho cây ngô và chỉ được xuất hiện khi điều kiện môi trường hạn hán. Tuy
nhiên, trong điều kiện hạn hán sự xuất hiện và duy trì của mARN ZmDREB2A
dạng S diễn ra rất nhanh nên việc phân lập đoạn gen này trên các mẫu bị hạn gặp
nhiều khó khăn, do vậy, việc tổng hợp nhân tạo đoạn gen ZmDREB2A dạng S sẽ
khắc phục được khó khăn trên. Do đó, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạo
tại hãng Genscript đoạn gen ZmDREB2A-S và đưa vào vector tách dòng pUC57.
Gen ZmDREB2A dạng S đã được gắn vào trong cấu trúc có ubiquitin promoter
và 35S terminator trong vùng T-ADN của vector pCAMBIA1300, vector chứa
gen chỉ thị chọn lọc thực vật là hygromycin. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1300
ubi:: ZmDREB2A-S:: 35S.
3.2.2. Kết quả biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A-S vào một số
dòng ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Ba dòng ngô K1, K3, K7 đã được dùng làm vật liệu chuyển gen. Chúng là
các dòng ưu tú, có đặc điểm sinh học tốt và đặc biệt chúng có tỷ lệ tái sinh cao so
với các nguồn vật liệu khác mà đã được nghiên cứu trong một số thí nghiệm trước
đây. Trong thí nghiệm này, phôi non sau thụ phấn 12 ngày được tách ra và sử dụng
làm mô đích để lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector mang gen.
Bảng 3.8. Sự hình thành chồi tái sinh của các dòng ngô thí nghiệm
Đồng nuôi cấy
Tái sinh 1
N
(CCM)
(TS1)
Nguồn
Số phôi
Số mẫu %

S

T
T

Tái sinh 2 tạo chồi
(TS2)
Số mẫu
%

Cây
tái
sinh

Tỷ lệ
(%)

1

K1

8430

2400

28,47

1995

23,67

291

3,45

2

K3

2670

810

30,34

690

25,84

64

2,40

4

K7

5310

735

13,84

675

12,71

92

1,73

8


Sự hình thành mô sẹo qua hai lần chọn lọc là tương đối cao, tuy nhiên chỉ một
phần nhỏ các phôi này có khả năng tái sinh chồi. Tỷ lệ chồi tái sinh chỉ chiếm từ
12,71% đến 23,67% (Bảng 3.8). Nguồn K3 cho chồi tái sinh và tỷ lệ chồi tái sinh
cao nhất, trung bình các lần thí nghiệm chồi tái sinh đạt tỉ lệ 25,84%, tiếp theo là
dòng K1, chồi tái sinh chiếm tỷ lệ 23,67%. Dòng K7 có khả năng tái sinh chồi
thấp nhất, tỷ lệ tái sinh chồi chỉ đạt 12,71%.
Đánh giá tỷ lệ cây sống khi ra đất: Kết quả bảng 3.9 cho thấy trong 3 dòng
thí nghiệm, số cây sống được trên đất trong nhà lưới ở dòng K1 là nhiều nhất (152
cây) do nguồn phôi đưa vào với số lượng nhiều gần 2 hoặc 3 lần số nguồn còn lại,
tuy nhiên tỉ lệ chỉ đạt 52,23 %. Điều này có thể các đợt ra ngôi của nguồn K1 gặp
đúng đợt lạnh kéo dài, đúng đợt ra ngôi nên số cây bị chết nhiều. Đối với 2 dòng
còn lại K3 và K7 tỷ lệ cây sống sót tương đương nhau 67,18% và 78,26 % so với
tổng số phôi được lây nhiễm.
Bảng 3.9. Sự hình thành cây hoàn chỉnh của các dòng ngô thí nghiệm
Đồng nuôi
cấy (CCM)

STT

Nguồn
Số phôi

Số cây
số ng
khi
đưa ra
đấ t

Tỷ
lệ
(%)

Cây
sống
được
trên
đất

Tỷ lệ %
cây ra
đất so
với cây
tái sinh

Tỷ lệ
(%) cây
ra đất

so với
số phôi

1

K1

8430

291

3,45

152

52,23

1,80

2

K3

2670

64

2,40

43

67,18

1,61

3

K7

5310

92

1,73

72

78,26

1,36

Hình 3.13. Mô sẹo nguồn Hình 3.14. Mô sẹo phôi Hình 3.15. Cây ngô chuyển gen
K7 phôi hoá trên môi
hoá nguồn K1 trên môi nguồn K3 trên môi trường ra
trường tái sinh
trường tái sinh 2
rễ

Hình 3.16. Cây chuyển gen T0 đươ ̣c ra ngôi trên
giá thể dinh dưỡng

Hình 3.17. Cây chuyển gen T0
được trồng ra đất

3.2.2.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR đối với
các cây chuyển gen ở thế hệ T0
Các cây ngô chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 4 tuần tiến
9


hành thu mẫu lá để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện
gen bằng PCR với các mồi đặc hiệu. Kết quả thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy, sự có
mặt của các gen khác nhau với cùng một nguồn vật liệu. Đối với nguồn K1, 67
cây mang gen đích ZmDREB2A và 45 cây mang trình tự nối Ubi-Zm, các cây
mang đầy đủ cả 2 trình tự chỉ có 34 cây, chiếm tỉ lệ 22,37 %. Tương tự với các
nguồn K3, K7 còn lại sự có mặt của các gen khác nhau đối với dòng khác nhau:
nguồn K3 có 16 cây, nguồn K7 có 37 cây mang cả 2 gen. Tỷ lệ cây mang gen
nguồn K7:37/72 = 51,39 %; K3: 15/43 = 34,89 %.
Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra sự có mặt của các gen chuyển và khả
năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0
Đồng
nuôi
cấy

STT Nguồn

Số phôi

Cây
sống

được
trên
đất

UbiZm

ZmDreb2A

Cây mang gen
chuyển

Cây
mang
2 gen

Tỷ lệ
cây
mang
2 gen

1

K1

8430

152

45

67

34

22,37

2

K3

2670

43

21

16

15

34,89

3

K7

5310

72

41

47

37

51,39

3.2.2.4. Đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0
Quá trình chuyển DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào thực vật có thể gây ra
một số xáo trộn trong hệ thống điều hoà hoạt động gen của tế bào, làm ảnh hưởng
đến sinh trưởng của cây chủ. Khi đánh giá khả năng hữu thụ của các cây ngô
chuyển gen, hiện tượng thường gặp phải là các cây chuyển gen bị bất thụ do rối
loạn về sự phân hoá cơ quan sinh sản của cây ngô dẫn đến thời gian chênh lệch
tung phấn – phun râu; râu trên cờ; không thấy bắp hoặc không thấy cờ (Hình 3.22).
Chính vì vậy, số cây chuyển gen hữu thụ của các dòng thu được tương đối thấp.
Số cây mang gen hữu thụ lại còn thấp hơn rất nhiều, đây cũng là một trở ngại lớn
trong các nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô.
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0
CCM
S
T
T

Nguồn

Số
phôi

Cây

sống
được
trên
đất

Râu
trên
cờ

Cây đột biến
Không Lệch
có bắp, phấn,
không phun
cờ
râu

Dạng
khác

Cây
hữu
thụ

Cây
mang
gen
hữu
thụ

Hiệu

suất
chuyển
gen

(%)

1

K1

8430

152

36

28

23

12

53

15

0,18

2

K3

2670

43

5

3

6

-

29

13

0,49

3

K7

5310

72

8

5

3

2

54

18

0,34

Từ bảng số liệu 3.11 cho thấy, hiệu suất chuyển gen đối với dòng K1 rất thấp,
10


chỉ đạt 0,18%. Trong quá trình theo dõi và đánh giá cho thấy, các cây bị đột biến
rất nhiều, xuất hiện râu trên cờ, nhiều cây có cờ nhưng không có bắp và ngược lại.
Một số cây không phân nhánh thân, chỉ có lá hoặc bắp có ngay ở đốt đầu tiên của
cây, các cây này bị chết sớm trong quá trình sinh trưởng. Một số cây ra bắp trước
khi ra cờ nên khi râu rất dài phấn vẫn chưa có, những bắp này chúng tôi đã cứu
bằng cách lấy phấn của cây K1 không chuyển gen (dòng nền) thụ vào. Bên cạnh
đó, hai dòng K3, K7 có tỉ lệ cây đột biến ít hơn, dẫn đến hiệu suất chuyển gen cao
hơn hẳn, đạt 0,49 % đối với nguồn K3 và 0,34% đối với nguồn K7.

B
C
Hình 3.22. Một số dạng cây đột biến
A. Đột biến râu trên cờ; B. Đột biến hạt ngô được thụ trên cờ; C.Đột biến cây không có bắp
Các cây T0 hữu thụ mang gen này được chuyển ra trồng trong đất và tiếp tục

cho sinh trưởng trong điều kiện nhà lưới để thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích
cây T1.
3.3. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDreb2A ở
các thế hệ T1, T2, T3
3.3.1. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen
thế hệ T1 bằng phương pháp PCR
Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt gen chuyển ZmDREB2A trong các cây
chuyển gen thế hệ T1 từ 10 cây T0 thuộc 3 nguồn chuyển gen K1, K3 và K7 được
thể hiện qua bảng 3.12. Trong đó, nguồn K1 có 71 cây có gen, nguồn K3 và K7
có 123 và 128 cây mang gen. Kích thước đoạn gen đích ZmDREB2A trong cây
chuyển không bị thay đổi so với thiết kế ban đầu (948 bp, Hình 3.23) đảm bảo cho
việc đoạn gen đích không có đột biến chèn đoạn hay mất đoạn.
A

1
2
3
4

Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T1
Số cây
Tỉ lệ
Chi
Số cây có
Tỷ lệ %
Tên
có kết
phân ly
square
kết quả

cây mang
dòng T1
quả
của gen
value
PCR (-)
gen
(χ2)
PCR (+)
chuyển
Dòng K1
K1-1
4
16
1:4
20
K1-2
2
18
10
K1-3
5
15
1:3
25
K1-4
6
14
1:2
30

11


5
6
7
8
9
10

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10

K1-5
K1-6
K1-7
K1-8
K1-9
K1-10
Tổng số
Dòng K3
K3-1
K3-2
K3-3
K3-4
K3-5
K3-6
K3-7
K3-8
K3-9
K3-10
Tổng số
Dòng K7
K7-1
K7-2
K7-3
K7-4
K7-5
K7-6
K7-7
K7-8

K7-9
K7-10
Tổng số

8
8
10
11
9
8
71

12
12
10
9
11
12
129

2:3
2:3
1:1
1:1
1:1
1:1

40
40
50

55
45
40
35,5

0,0
0,20
0,20
0,80

10
12
15
16
18
9
10
11
9
13
123

10
8
5
4
2
11
10
9

11
7
77

1:1
3:2
3:1
3:1
15:1
1:1
1:1
1:1
1:1
3:1

50
60
75
80
90
45
50
55
45
65
61,5

0,00
0,00
0,26

0,054
0,20
0,00
0,20
0,20
1,06

12
7
15
16
13
9
18
14
9
15

8
13
5
4
7
11
2
6
11
5

3:2

1:3
3:1
3:1
3:1
1:1
15:1
3:1
1:1
3:1

60
35
75
80
65
45
90
70
45

0,00
0,26
1,06
0,20
0,054
0,26
0,2
0,00

128

72

75
64

Hình 3.23. Một số kết quả điện
di sản phẩm PCR nhân gen
ZmDReb2A ( 948bp) của dòng
K3 thế hệ T1 trên gel agarose
1%
L: thang ADN 1kb,(+): đối
chứng dương (PCR từ plasmid),
(-): đối chứng âm (PCR không có
ADN khuôn); wt: PCR từ cây
không mang gen, 1- 74: PCR từ
cây đã chuyển gen thế hệ T1

12


3.3.2. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển
gen thế hệ T2, T3 bằng phương pháp PCR
Thế hệ T2, hai nguồn K3 và K7 có 7 dòng được đánh giá, trong đó 4 cây phân
ly theo tỉ lệ 3:1 là: K3-3.1, K3-4.18, K7-5.5 và K7-8.10. Một dòng K7-4.12 có
100% cây T2 mang gen (Bảng 3.13). Các cây T2 có gen của các cây T1 này được
lựa chọn để tự thụ và thu bắp, kết hợp với các đặc điểm nông học để tiến hành
gieo và đánh giá tại thế hệ T3.
Bảng 3.13. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T2

STT

1
2
3

1
2
3
4

Tên dòng
T2

Dòng K3
K3-3.1
K3-4.18
K3-10.10
Tổng số
Dòng K7
K7-3.3
K7-4.12
K7-5.5
K7-8.10
Tổng số

Số cây có
kết quả
PCR (+)

Số cây
có kết
quả
PCR
(-)

65
75
82
222

27
31
14
103

3:1
3:1
-

70,7
70,8
85,4
68,3

92
108
81
67
348

14
0
21
21
56

100
3:1
3:1

86,8
100,0
79,4
76,1
86,1

Tỉ lệ
phân ly
của gen
chuyển

Tỷ lệ %
cây
mang
gen

Kiểm
định
chi

bình
phương
(χ2;3:1)
0.93
1,11

0,00
1,05
0,06

Tỉ lệ phân ly của gen chuyển ZmDREB2A tại thế hệ T3 tiếp tục được tính
toán, Ở nguồn K3, dòng K3-3.1.96 có tỉ lệ phân ly gen chuyển tại T3 là 3:1, với
chỉ số χ2 là 0.21, tuân theo định luật phân ly độc lập của Mendel với 1 bản copy
gen chuyển. Dòng K3-4.18 có tỉ lệ 100% cây có gen ở thế hệ T3, có thể giả thuyết
là dòng K3-4.18.32 đã có kiểu gen đồng hợp tử gen chuyển ZmDREB2A, tuy
nhiên để khẳng định chính xác cần thực hiện thí nghiệm lai Souhthern Blot để
kiểm tra. Với hai dòng K3-3.1.96 và K3-4.18.32 cùng phân ly theo quy luật
Mendel thế hệ T1 và T2 và T3 có thể giả thuyết rằng hai dòng này có tồn tại 1 bản
copy gen chuyển ZmDREB2A. Hai dòng này của nguồn K3 được lựa chọn thực
hiển phản ứng Southern Blot, sinh lý sinh hóa và đánh giá chịu hạn nhân tạo.
Nguồn K7 có 3 bắp T2 được chọn để gieo thế hệ T3, dòng K7-4.12.25 tiếp
tục có tỉ lệ phân ly là 100% ở thế hệ T3, tương tự ở thế hệ T2, điều nay thể hiện
cây đã đồng hợp tử gen chuyển. Tuy nhiên cần thực hiện thí nghiệm tiếp theo để
có kết quả chính xác. Dòng K7-5.5.19 có tỉ lệ phân ly là 3:1, theo định luật Mendel
với 1 bản copy gen chuyển, đây là thế hệ thứ 3 dòng K7-5 phân ly theo tỉ lệ 3:1.
Cây K7-8.10.65 có tỉ lệ phân li là 9:1, không tuân theo bất kì quy luật phân li nào,
13


dù ở hai thế hệ trước dòng K7-8 đã phân li theo tỉ lệ Mendel, điều này có thể do

việc gen chuyển tồn tại không ổn định trong genome cây ngô chuyển gen [194],
có thể do vị trí gen chuyển xuất hiện trao đổi chéo làm thay đổi tỉ lệ gen chuyển
qua các thế hệ sau, hoặc do sự di truyền yếu của các gen này.
Qua đánh giá kết quả PCR và kết quả đánh giá tỉ lệ phân ly qua 3 thế hệ,
chúng tôi thấy nguồn K3 có hai dòng K3-3 và K3-4, nguồn K7 có hai dòng K7-4
và K7-5 có chứa gen chuyển và có sự phân ly gen chuyển ZmDREB2A theo định
luật phân ly độc lập của Mendel qua 3 thế hệ. Kích thước gen chuyển qua các thế
hệ không thay đổi so với thiết kế ban đầu. Các cây có gen của các dòng này sẽ
được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo (Bảng 3.15).
Bảng 3.15. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T3
STT

1
2

1
2
3

Tên dòng
T3

Dòng K3
K3-3.1.96
K3-4.18.32
Tổng số
Dòng K7
K7-4.12.25
K7-5.5.19
K7-8.10.65

Tổng số

Số cây
có kết
quả
PCR
(+)

Số cây
có kết
quả
PCR
(-)

Tỉ lệ
phân ly
của gen
chuyển

Tỷ lệ %
cây
mang
gen

Kiểm
định chi
bình
phương
(χ2 ;3:1)

77
99
176

22
0
22

3:1
100

77,8
100

0.21
0.00

100
71
92
263

0
29
8
37

100
3:1
9:1

100
71,0
92,0

0.00
0.05
-

3.3.5. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDREB2A bằng kỹ thuật lai
Southern
Kết quả xác định tín hiệu lai Southern đối với cây ngô chuyển gen
ZmDREB2A thuộc thế hệ T3 được thể hiện như hình 3.37c. Đối chứng dương
(plasmid mang gen ZmDREB2A) cho một băng tín hiệu rõ ràng. Trong số cây
chuyển gen ZmDREB2A, 5 cây chuyển gen của cả hai nguồn K3 (2 cây: K3-3.1.96,
K3-4.18.32) và K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) đều dương tính
với lai Southern. Tất cả nguồn K3 (2 cây: K3-3.1.96, K3-4.18.32), K7 (3cây: K74.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) chỉ cho một băng tín hiệu lai và không có bất cứ
tín hiệu lai nào khác. Đối với lai Southern, số lượng băng tín hiệu lai cũng chính
là số lượng bản sao của đoạn gen quan tâm trong hệ gen. Như vậy, gen
ZmDREB2A đã được tích hợp một bản sao vào hệ gen của cả 5 cây từ nguồn K3(2
cây: K3-3.1.96, K3-4.18.32) và K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65).
Trên thế giới, các giống cây trồng biến đổi gen đều phải được đánh giá số bản
sao của gen chuyển, đảm bảo số lượng đó là ít nhất, trước khi được cho phép phân
14


phối trên thị trường [93]. Cá thể có nhiều bản sao của cùng một gen chuyển sẽ rất
phức tạp để đánh giá, xác định tác động của các đoạn chèn khác nhau trong hệ
gen. Đó cũng chính là lý do mà phương pháp biến nạp bằng vi khuẩn
Agrobacterium được ưu tiên sử dụng hơn so với súng bắn gen.

Hình 3.37a. Kết quả Hình 3.37b. Điện di Hình 3.37c. Kết quả Lai
điện di kiểm tra sản ADN tổng số sau khi Southern với các nguồn
phẩm PCR gen đích xử lý với enzyme giới dòng
chuyển
gen
ZmDREB2A
hạn
ZmDREB2A sử dụng mồi
M: marker 1Kb;(-): cây (+): plasmid mang probe đặc hiệu PCR
không
chuyển
gen gen ZmDREB2A;
đoạn
gen
đích
ZmDREB2A (wild-type); 1,5: cây chuyển gen ZmDREB2A
(+): Đối chứng dương ZmDREB2A từ nguồn (+): plasmid mang gen
(PCR từ plasmid); 1-2: K3 (2 cây: K3-3.1.96, ZmDREB2A;
1,5:cây
cây
chuyển
gen K3-4.18.32)
chuyển gen ZmDREB2A từ
ZmDREB2A từ nguồn 2,3,4: cây chuyển gen nguồn K3 (2 cây: K3K3(2 cây: K3-3.1.96, K3- ZmDREB2A từ nguồn 3.1.96,
K34.18.32);3-5: cây chuyển K7 (3cây: K7-4.12.25, 4.18.32);2,3,4:cây chuyển
gen ZmDREB2A từ K7-5.5.19,
K7- gen ZmDREB2A từ nguồn
nguồn K7 (3cây: K7- 8.10.65)
K 7 (3 cây: K7-4.12.25,

4.12.25, K7-5.5.19, K7K7-5.5.19, K7-8.10.65)
8.10.65)
Kết quả lai Southern đối với cây chuyển gen ZmDREB2A đã chứng tỏ quá
trình biến nạp thành công ở các cây thuộc nguồn K3(2 cây: K3-3.1.96, K34.18.32), K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65). Đây là cơ sở để tiếp tục
chọn lọc, duy trì và phát triển các nguồn vật liệu mang gen ZmDREB2A trong quá
trình tạo giống.
3.3.6. Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển ZmDREB2A trên
cây ngô chuyển gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Như vậy, kết quả phân tích RT-PCR đã nhân được đoạn gen ZmDREB2A từ
cDNA của cây ngô chuyển gen của các mẫu thí nghiệm M1, M4, M5, M6, M7
nguồn K3-4.18.32 tương đương với giếng số 5, 11, 13, 15, 17 (Hình 3.37A). Tương
ứng với kích thước của đối chứng dương (giếng 1: sản phẩm PCR từ plasmid chứa
vector chuyển gen Ubi-ZmDEB2A). Như vậy, có 5 cây ngô chuyển gen từ nguồn
ban đầu K3 mang gen ZmDREB2A và biểu hiện ở mức độ phiên mã.
Ở hình 3.37B, các giếng số 5, 7, 11,15, 17, 19 tương đương với các mẫu thí
nghiệm M9, M10, M12, M14, M15, M16 của dòng K7-4.12.25 chứng tỏ sự có mặt
15


của cảc gen chuyển trong các cây ngô chuyển gen và bước đầu các gen này đã hoạt
động thông qua sự phiên mã tổng hợp các mRNA. Kích thước băng DNA xuất hiện
tương đương với đối chứng dương (giếng 1). Điều này chứng tỏ, 6 cây ngô chuyển
gen từ nguồn K7 bước đầu đã hoạt động thông qua sự phiên mã tổng hợp mRNA.

Hình 3.37A. Ảnh điện di RT-PCR
mồi ZmDREB2A nguồn K3-4.18.32
M: Maker chuẩn 1kb; Giếng 1: ĐC dương
(PCR từ plasmid); giếng 2: đối chứng âm
(PCR không có ADN khuôn); giếng 3:
wildtype (PCR cây không chuyển gen);

giếng 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 sản phẩm
PCR từ ARN. Giếng 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19:
là sản phẩm PCR từ cDNA dòng K3-4.18.32
(Giếng 4,5: PCR mẫu M1; 6,7: PCR mẫu
M2; 8,9: PCR mẫu M3; 10, 11: PCR mẫu
M4; 12, 13: PCR mẫu M5; 14, 15: PCR
mẫu M6; 16, 17: PCR mẫu M7; 18, 19:
PCR mẫu M8)

Hình 3.37B. Ảnh điện di RT-PCR
mồi ZmDREB2A nguồn K74.12.25
M Maker chuẩn 1kb; Giếng 1: ĐC dương
(PCR từ plasmid); giếng 2: đối chứng âm
(PCR không có ADN khuôn); giếng 3:
wildtype (PCR cây không chuyển gen);
giếng 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 sản phẩm
PCR từ ARN. Giếng 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19:
là sản phẩm PCR từ cDNA dòng K7-4.12.25
(Giếng 4,5: PCR mẫu M9; 6,7: PCR mẫu
M10; 8,9: PCR mẫu M11; 10, 11: PCR mẫu
M12; 12,13: PCR mẫu M13; 14, 15: PCR mẫu
M14; 16, 17: PCR mẫu M15; 18, 19: PCR mẫu
16)

Các giếng còn lại là sản phẩm PCR từ các mẫu RNA tương ứng, kết qủa điện
di trên agarose 1% cho ta thấy, không thấy đoạn gen nào được nhân lên, điều đó
chứng tỏ, RNA đã tách chiết không bị lẫn tạp DNA.
Các cặp sản phẩm PCR từ RNA và cDNA còn lại (6-7) (8-9) (18-19) của dòng
K3-4.18.32 (Hình 3.37A) và các cặp (8-9) (12-13) của dòng K7-4.12.25 (Hình
3.37B) không thấy đoạn gen nào được nhân lên. Điều này chứng tỏ mặc dù các

cây ngô này đã được PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các cây
ngô chuyển gen nhưng sự biểu hiện của gen không có.

3.3.7. Kiểm tra protein ZmDREB2A bằng thẩm tách miễn dịch (Western Blot)
Kết quả lai Western (Hình 3.38) cho thấy, 2 cây ngô chuyển gen ở giếng 3, 4
của dòng ngô K3 và 2 cây ngô chuyển gen dòng ngô K7 (giếng 6,7) trên màng lai
nitrocellulose đều xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 37 kDa.
Điều đó chứng tỏ, cả 4 cây ngô chuyển gen đều có protein ngoại lai nên xảy ra
phản ứng tạo màu của enzym trên kháng thể với cơ chất. Giếng điện di protein
cây ngô không chuyển gen và cây ngô chuyển gen nhưng không mang gen (giếng
1,2,5) do không có protein gắn nên không xảy ra phản ứng tạo màu. Kết quả này,
tương ứng với kích thước protein ZmDREB2A tái tổ hợp của các nghiên cứu trước
16


đây [128][95]. Như vậy có thể thấy, gen ZmDREB2A đã hoạt động biểu hiện tổng
hợp protein tương ứng trên cây ngô của 2 dòng K3, K7 mang gen.

Hình 3.38. Kết quả lai Western blot các cây ngô chuyển gen ZmDREB2A thế hệ T3
(M): thang chuẩn protein; (1): protein cây ngô không chuyển gen; (2): Proten cây ngô chuyển
gen K3 không mang gen ZmDRB2A ở thế hệ T3; (3,4): Protein cây ngô chuyển gen K3 mang
gen ZmDRB2A ở thế hệ T3; (5): Protein cây ngô chuyển gen K7 không mang gen ZmDRB2A
ở thế hệ T3; (6,7) Protein cây ngô chuyển gen K7 mang gen ZmDRB2A ở thế hệ T3)

3.4. Xác định hàm lượng Chlorophyll, Proline, Cacbonhydrate trong cây
chuyển gen và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen
3.4.1. Xác định hàm lượng chlorophyll ở cây chuyển gen ZmDREB2A

Hình 3.39. Hàm lượng
chlorophyll a ở các cây

thí nghiệm trong điều
kiện thường và điều kiện
hạn nhân tạo

Hình 3.40. Hàm lượng
chlorophyll b ở các cây
thí nghiệm trong điều
kiện thường và điều
kiện hạn nhân tạo

Hình
3.41.
Tỉ
lệ
chlorophylla/chlorophyllb
ở các cây thí nghiệm trong
điều kiện thường và điều
kiện hạn nhân tạo

Từ giá trị hàm lượng chlorophyll a (Hình 3.39) và chlorophyll b (Hình 3.40),
tương quan giữa hai loại sắc tố này được phân tích như ở hình 3.41. Tỉ lệ Chl a/Chl
b trong điều kiện hạn cao hơn so với điều kiện bình thường. Cụ thể, tỉ lệ Chl a/Chl
b đối với các mẫu K3, K3-CG là khoảng 4 trong điều kiện thường nhưng tăng lên
5,4 trong điều kiện hạn. Tỉ lệ Chl a/Chl b của mẫu K7, K7-CG tăng từ 3,4 ở điều
kiện thường lên lần lượt 5,3 và 5,9 trong điều kiện hạn. Điều này cho thấy khi cây
ngô phải đối mặt với điều kiện hạn, hàm lượng chlorophyll b giảm mạnh hơn so
với chlorophyll a.
Các kết quả trên có sự tương đồng với những nghiên cứu khác về sinh lý cây
trồng trong điều kiện hạn. Hàm lượng chl nói chung giảm xuống và tỉ lệ Chl a/Chl
b tăng cũng là những hiện tượng mà các nhóm nghiên cứu khác quan sát được khi

gây hạn nhân tạo đối với cây ngô bằng sorbitol trong điều kiện in vitro [83].
3.4.2. Xác định hàm lượng proline, carbohydrate ở cây chuyển gen ZmDREB2A
17


Kết quả phân tích hàm lượng proline đối với các cây chuyển gen ZmDREB2A
được thể hiện trên hình 3.42. Ở điều kiện được tưới nước đầy đủ, hàm lượng
proline tự do ở các mẫu đều đạt xấp xỉ 0,2 μg/mg. Tuy nhiên, khi cây được xử lý
hạn nhân tạo, hàm lượng proline tự do tăng 2,5 - 4,5 lần so với điều kiện thường.
Cụ thể, mẫu K3 và K3-CG trong điều kiện hạn có hàm lượng proline tăng lần lượt
2,5 lần và 4 lần so với điều kiện tưới đầy đủ, cây chuyển gen cao hơn 37% trong
điều kiện hạn. Mẫu K7 và K7-CG trong điều kiện hạn có hàm lượng proline cao
gấp 3,55 lần và 4,5 lần so với điều kiện thường, cây chuyển gen cao hơn 20% so
với điều kiện hạn.
Kết quả phân tích hàm lượng cacbohydrate không cấu trúc đối với cây ngô
chuyển gen ZmDREB2A được thể hiện như trên hình 3.43. Ở điều kiên tưới nước
đầy đủ, hàm lượng NSC ở mẫu chuyển gen và không chuyển gen không có khác
biệt đáng kể, đạt khoảng 3,6 μg/mg. Khi xử lý hạn nhân tạo, hàm lượng NSC ở
mẫu K3 và K3-CG lần lượt đạt 5,27 μg/mg và 6,76 μg/mg. Hàm lượng NSC ở
mẫu K7 và K7-CG trong điều kiện hạn lần lượt là 5,6 μg/mg và 7,55 μg/mg. So
sánh với cây không chuyển gen trong điều kiện hạn nhân tạo, cây chuyển gen
ZmDREB2A có hàm lượng NSC cao hơn 1,49 μg/mg tương đương 28,3% ở nguồn
K3 và 1,95 μg/mg tương đương 34,8% ở nguồn K7.

0

K7-CG…

K7 Hạn

K7

μg/m Hàm lượng NSC
g 10
K7-CG

K3-CG…

K3 Hạn

K3

0

K3-CG

μg/m Hàm lượng proline
g 1

Hình 3.42. Hàm lượng proline của các
cây chuyển gen ZmDREB2A và cây
không chuyển gen ở điều kiện thường
và điều kiện hạn nhân tạo

Hình 3.43. Hàm lượng carbohydrate
không cấu trúc của các nhóm cây thí
nghiệm

Kết quả phân tích các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa cho thấy cây chuyển gen
ZmDREB2A có các chỉ tiêu sinh lý liên quan đến chống chịu tốt hơn so với đối

chứng. Trong hai nguồn dòng thí nghiệm, mẫu thuộc dòng K7 có biểu hiện chống
chịu, thể hiện qua đặc điểm sinh lý tốt hơn so với mẫu thuộc dòng K3. Các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa được phân tích sẽ là cơ sở để kết hợp với đánh giá kiểu
hình, từ đó chọn ra được dòng ngô có khả năng chống chịu tốt và ổn định, phục
vụ cho công tác phát triển giống.
3.4.4. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng gây
hạn nhân tạo
3.4.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn nhân tạo của
các dòng đã được chuyển gen ZmDREB2A thời kỳ cây con
Thí nghiệm trong công thức xử lý hạn tiến hành ngừng tưới 14 ngày, đồng
thời công thức tưới nước vẫn cung cấp nước đầy đủ. Theo dõi đặc điểm độ cuộn
18


lá ngô thấy rằng, tại giai đoạn 9 ngày sau khi xử lý hạn, cây ngô ở công thức tưới
nước đẩy đủ phát triển bình thường trong khi ở công thức xử lý hạn đã có biểu
hiện cuộn lá với mức độ khác nhau giữa dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A và
dòng ngô nền. Đồng thời cây ngô sinh trưởng chậm lại so với cây ngô đối chứng.
Ở giai đoạn 14 ngày sau khi xử lý hạn, có sự khác biệt rõ ràng về đặc điểm lá ngô.
Đánh giá độ cuộn lá của hai dòng ngô chuyển gen và dòng ngô nền đều cho điểm
5 và lá ngô bắt đầu có biểu hiện lá chết khô ở tầng lá dưới và đỉnh lá (Hình 3.45).

Hình 3.45. Giai đoạn trước phục hồi
(A): K3: Dòng K3 không chuyển gen; K3-CG: Dòng K3 đã chuyển gen ZmDREB2A
(B): K7: Dòng K7 không chuyển gen; K7-CG: Dòng K7 đã chuyển gen ZmDREB2A
Ghi chú: trong 1 chậu: 3 cây bên trái là dòng chuyển gen;3 cây bên phải dòng nền tương
ứng; CT1: công thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn.

Sau khi tiến hành gây hạn nhân tạo 14 ngày, ngô thí nghiệm được tưới nước
phục hồi và bón phân. Sau 7 ngày phục hồi, tỷ lệ cây sống sau phục hồi được theo

dõi: dòng K7-ZmDREB2A có tỷ lệ sống 86.6% tương đương 13/15 cây sống cao
hơn dòng nền K7 33.3% tương đương 5/15 cây sống. Dòng K3-ZmDREB2A có
tỷ lệ cây sống 66.6% tương đương 10/15 cây sống, dòng K3 có tỷ lệ cây sống
26.6% tương đương 4/15 cây sống. Công thức tưới nước đầy đủ, dòng ngô chuyển
gen và các dòng nền sinh trưởng bình thường, không có sự khác biệt, tỷ lệ cây
sống là 100%. Ở công thức xử lý hạn, hai dòng ngô mang gen chuyển
ZmDREB2A có khả năng phục hồi sinh trưởng sau khi xử lý hạn tốt hơn, do đó
có tỷ lệ cây sống cao hơn so với dòng ngô nền, tuy nhiên do trải qua thời kỳ hạn
nên cây sinh trưởng chậm, cây thấp hơn so với cây ngô đối chứng ở công thức
tưới nước đẩy đủ (Hình 3.46).

Hình 3.46. Giai đoạn sau phục hồi
(A): K3: Dòng K3 không chuyển gen; K3-CG: Dòng K3 đã chuyển gen ZmDREB2A
(B): K7: Dòng K7 không chuyển gen; K7-CG: Dòng K7 đã chuyển gen ZmDREB2A
Ghi chú: trong 1 chậu: 3 cây bên trái là dòng chuyển gen;3 cây bên phải dòng nền tương
ứng; CT1: công thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn.

19


Ngoài ra, các chỉ tiêu theo dõi tiếp theo ở giai đoạn này gồm: Chiều dài
thân lá, chiều dài rễ, thể tích rễ, khối lượng thân tươi, khối lượng rễ tươi, khối
lượng thân khô, khối lượng rễ khô kết quả được thể hiện trong bảng 3.20.
Chiều dài thân lá và chiều dài rễ, thể tích rễ:
Khi hạn xảy ra ở giai đoạn cây con, cây ngô sẽ bị ảnh hưởng đến khả năng
kéo dài của lóng. Tình trạng cây ngô giảm chiều cao khi trải qua thời kỳ hạn đã
được báo cáo trong nhiều nghiên cứu trước đây. Ngược lại với sự phát triển của
chiều cao cây, trong điều kiện hạn rễ ngô phát triển theo hướng tăng chiều dài rễ
nhằm tăng khả năng lấy nước đồng thời giảm sự phát triển các rễ nhánh nếu hạn
nặng xảy ra. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chiều dài thân lá và chiều dài rễ cho ở bảng

3.20 cho thấy ở công thức tưới nước đầy đủ, chiều dài thân lá, chiều dài rễ và thể
tích rễ của hai dòng ngô chuyển gen K7-ZmDREB2A và K3-ZmDREB2A có sự
khác nhau so với dòng ngô nền tương ứng nhưng không có ý nghĩa thống kê với
độ tin cậy 95%.
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu thân lá, rễ của các dòng ngô thí nghiệm trong trong chậu
Chiều
Công
dài
Chiều
thức
thân dài rễ
thí
lá
(cm)
nghiệm
(cm)

Vật
liệu

Khối
Thể lượng
tích rễ thân
(mm3) tươi
(g)

Khối
lượng
rễ
tươi

(g)

Khối
Khối
lượng
lượng
thân
rễ khô
khô
(g)
(g)

Tổng
sinh
khối
khô
(g)

K7ZmDR
EB2A

CT2

63,2

23,6

2,09

7,359

0,888

1,72

0,22

1,94

CT1

78,8

26,2

4,65

11,96

1,963

5,779

0,598

6,377

Dòng
nền K7

CT2

56,7

19,5

1,13

2,06

0,344

0,74

0,14

0,88

CT1

77,8

26,26

4,636

11,97

1,964

5,762

0,589

6,351

K3ZmDR
EB2A

CT2

56,5

20,6

1,91

7,038

0,842

1,53

0,16

1,69

CT1

73,5

23,2

4,534

11,86

1,943

5,629

0,548

6,177

Dòng
nền K3

CT2

51,7

16,08

1,01

1,968

0,324

0,588

0,091

0,68

CT1

72,8
4,2
1,99

23,2
5,7
0,92

4,518
0,9
0,013

11,87
2,8
0,168

1,944 5,622
2,2
0,8
0,02 0,019

0,537

4,7
0,0124

6,169
1
0,0279

CV%
LSD

CT1 CT2 CT2 CT1

CT1 CT2 CT2 CT1

Hình 3.47. Rễ của các dòng ngô sau khi xử lý phục hồi 7 ngày
A: nguồn K3; B: nguyền K7
Chú thích: CT1: công thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn

20


Ở công thức xử lý hạn, chiều dài thân lá, chiều dài rễ, thể tích rễ của hai dòng
ngô chuyển gen K7-ZmDREB2A và K3-ZmDREB2A có sự khác nhau so với
dòng ngô nền tương ứng K7, K3 có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Chiều
dài thân lá của dòng ngô K7-ZmDREB2A là 63,2 cm và dòng ngô nền K7 là 56,7
cm. Chiều dài rễ của dòng ngô K7-ZmDREB2A là 23,6 cm và dòng K7 là 19,5
cm (Hình 3.47, bảng 3.20). Thể tích rễ của dòng ngô K7-ZmDREB2A 2,09 mm3
và dòng K7 là 1,13 mm3. Chiều dài thân lá của dòng ngô K3-ZmDREB2A là 56,5
cm và dòng ngô nền K3 là 51.7 cm. Chiều dài rễ của dòng ngô K3-ZmDREB2A
là 20.6 cm và dòng K3 là 16,08 cm (Hình 3.47, Bảng 3.20). Thể tích rễ của dòng

ngô K3-ZmDREB2A 1,91 mm3 và dòng K3 là 1,01mm3 .
Bộ rễ phát triển tốt cho phép cây ngô hút được nhiều nước hơn trong điều
kiện khô hạn. Kết quả này phù hợp kết luận của [46], [13] đó là trong điều kiện
hạn nhẹ tỷ lệ rễ/thân lá có xu hướng tăng.
Khối lượng thân tươi và khối lượng rễ tươi:
Khi cây ngô trải qua giai đoạn hạn nghiêm trọng, tế bào bị tổn thương, chết
và không phục hồi được. Vì vậy sau giai đoạn xử lý phục hồi, ở những nguồn gen
chống chịu tốt với điều kiện hạn, hoạt động của các tế bào khôi phục lại trạng thái
bình thường. Tế bào trong thời kỳ hạn đang trong trạng thái mất nước, giảm sức
trương quay lại trạng thái no nước vì vậy khối lượng thân tươi và khối lượng rễ
tươi của cây tăng lên đáng kể. Khối lượng thân tươi và khối lượng rễ tươi của các
dòng ngô thí nghiệm thể hiện bảng 3.20.
Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy khối lượng thân tươi và khối lượng rễ tươi của
hai dòng ngô K7-ZmDREB2A và K3-ZmDREB2A khác biệt không có ý nghĩa
thống kê so với dòng ngô nền K7, K3 tương ứng ở độ tin cậy 95% trong công
thức tưới nước đầy đủ. Ngược lại có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê với độ tin
cậy 95% về khối lượng thân tươi và khối lượng rễ tươi của dòng ngô K7ZmDREB2A và K3-ZmDREB2A khi so sánh với dòng ngô nền trong công thức
xử lý hạn. Điều này là do sau xử lý phục hồi các tế bào có khả năng sống, sinh
trưởng bình thường trở lại của dòng nền kém hơn so với dòng chuyển gen hoặc
cây bị chết. Trong công thức xử lý hạn, khối lượng thân tươi của dòng K7ZmDREB2A là 7,395g và dòng ngô nền K7 là 2,06g. Khối lượng rễ tươi của dòng
K7-ZmDREB2A là 0,888g và dòng ngô nền K7 là 0,344g. Khối lượng thân tươi
của dòng K3-ZmDREB2A là 7,308g và dòng ngô nền K3 là 1,968g. Khối lượng
rễ tươi của dòng K3-ZmDREB2A là 0,842g và dòng ngô nền K3 là 0,324g.
Khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô, tổng sinh khối khô:
Khối lượng khô phản ánh hoạt động sinh trưởng phát triển của cây, cây sinh
trưởng phát triển tốt, quá trình quang hợp diễn ra mạnh thì lượng vật chất khô tích
lũy trong cây càng lớn. Số liệu khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô và tổng
sinh khối khô của các dòng ngô thí nghiệm cho ở bảng 3.20:
Số liệu tại bảng 3.20 cho thấy trong công thức tưới nước đầy đủ khối lượng
21

thân khô, khối lượng rễ khô, tổng sinh khối khô của hai dòng ngô chuyển gen K7ZmDREB2A, K3-ZmDREB2A khác nhau không có ý nghĩa thống kê với độ tin
cậy 95% so với khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô và tổng sinh khối khố của
dòng ngô nền. Trong công thức xử lý hạn khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô,
tổng sinh khối khô của hai dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A khác có ý nghĩa so
với dòng ngô nền tương ứng với độ tin cậy 95%. Khối lượng thân khô của dòng
ngô K7-ZmDREB2A là 1,72g cao hơn 0,98g so với dòng ngô nền K7 là 0,74g.
Khối lượng rễ khô của dòng ngô K7-ZmDREB2A là 0,22g cao hơn 0,08 so với
với dòng ngô nền K7 là 0,14g. Khối lượng thân khô của dòng ngô K3ZmDREB2A là 1,53g cao hơn 0,942g so với dòng ngô nền K3 là 0,588g. Khối
lượng rễ khô của dòng ngô K3-ZmDREB2A là cao hơn 0,069g so với với dòng
ngô nền K3 là 0,091g.
Tổng sinh khối khô: Đối với hoạt động sống của thực vật nói chung tổng
sinh khối khô là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá sự sinh trưởng. Cây ngô
trong sinh trưởng trong điều kiện thuận lợi có quá trình quang hợp diễn ra mạnh,
vật chất khô sẽ được tích lũy nhiều hơn khi sinh trưởng trong điều kiện không
thuận lợi như (thiếu nước, lạnh, sâu bệnh...). Trong điều kiện xử lý hạn nhân tạo
tổng sinh khối khô của của dòng ngô K7-ZmDREB2A và K3-ZmDREB2A cao
hơn có ý nghĩa thống kê so với dòng ngô nền K7 và K3 với độ tin cậy 95%. Tổng
sinh khối của dòng ngô K7-ZmDREB2A là 1.94g cao hơn 1.06g so với tổng sinh
khối khố của dòng ngô nền K7, tương đương 16,6% so với tổng sinh khối khô
của dòng ngô K7-ZmDREB2A trong công thức tưới nước đầy đủ. Tổng sinh khối
của dòng ngô K3-ZmDREB2A là 1,69g cao hơn 1,01g so với tổng sinh khối khố
của dòng ngô nền K3 là 0,68g, tương đương 16,3% so với tổng sinh khối khô của
dòng ngô K3-ZmDREB2A trong công thức tưới nước đầy đủ.
Các tác giả nghiên cứu khả năng chịu hạn của ngô trong giai đoạn cây
con ở Việt Nam [13],[14] và trên thế giới [46],[59],[190] đều kết luận về tầm quan
trọng của sinh trưởng bộ rễ trong điều kiện hạn, tức là giống cây trồng nào có bộ
rễ phát triển tốt khi thiếu nước ở thời kỳ cây con, thì dòng/giống đó có khả năng
tận dụng nước dưới sâu hơn – có khả năng chịu hạn tốt hơn. Do vậy, trong giai

đoạn cây con hai dòng K3 và K7 chuyển gen ZmDREB2A có khả năng chịu hạn
tương đối tốt hơn so với dòng nền tương ứng.
3.4.4.2. Đánh giá các dòng chuyển gen và dòng nền tương ứng ở các giai đoạn
sinh trưởng khác nhau về khả năng chịu hạn nhân tạo
Thí nghiệm được thực hiện với 2 công thức: Công thức 1 (Tưới đủ); Công
thức 2 (Gây hạn); Trong công thức 2, hạn được được bố trí 4 công thức nhỏ để
đánh giá, các công thức nhỏ được ký hiện như sau: I – Gây hạn ở thời kỳ ngô chín
sữa đến thu hoạch; II – Gây hạn ở thời kỹ ngô trỗ cờ, thụ phấn đến thu hoạch; III
– Gây hạn trước trỗ 7 ngày (Xoáy nõn đến sau thụ phấn 10 ngày); IV – Gây hạn
từ thời điểm ngô 10 lá đến sau thụ phấn 10 ngày[189].
22


Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của dòng
Các yếu tố cấu thành năng suất dòng gồm chiều dài bắp, đường kính bắp, số
hàng hạt, số hạt/hàng, tỷ lệ khối lượng hạt/bắp, khối lượng hạt. Năng suất là kết
quả của cộng gộp các yếu tố cấu thành năng suất. Dòng ngô có chỉ số của các yếu
tố cấu thành năng suất cao sẽ có tiềm năng năng suất dòng cao.
Bảng 3.26. So sánh năng suất cá thể của các dòng ngô chuyển gen
ZmDREB2A ở các thời kỳ hạn khác nhau trong nhà lưới
Dòng
K7-ZmDREB2A
K7
K3-ZmDREB2A
K3
CV%
LSD0,05

CT
TN

CT2
CT1
CT2
CT1
CT2
CT1
CT2
CT1

I
87,5
86,2
90,4
86,4
4,5
8,9

Năng suất cá thể (g/cây)
II
III
67,4
27,6
95,5
62,4
23,4
92,4
78,5
26,6
93,2
86,0

23,5
90,1
6,7
4,7
6,6
4,4

IV
20,6
15,6
16,4
16,0
6,5
4,5

CT2: công thức xử lý hạn, CT1: công thức tưới nước đầy đủ. I, II, III, IV: thời điểm gây hạn

Do điều kiện thí nghiệm trong chậu, nhà lưới nên chỉ có thể tính được tỷ lệ
hạt/bắp của các cây trong công thức thí nghiệm và khối lượng 100 hạt. Kết quả
yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ngô thí nghiệm tại bảng 3.26 cho thấy:
Tỷ lệ hạt/bắp có tương quan chặt chẽ đến năng suất ngô. Khi hạn nặng vào giai
đoạn 10 lá - xoắn nõn - sau trỗ (tương ứng với thời điểm gây hạn IV, III, II) gây
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, chênh lệch thời
gian tung phấn - phun râu kéo dài, làm giảm khả năng kết hạt, do đó giảm tỷ lệ
hạt/bắp dẫn đến năng suất ngô bị giảm nghiêm trọng. Trong quá trình gây hạn ở
4 thời điểm, hạn trong thời kỳ cây 10 lá (thời điểm IV) cây bị giảm năng suất
mạnh nhất do tỷ lệ hạt/bắp giảm mạnh, trung bình mỗi bắp ngô chỉ còn 5-9
hạt/hàng. Khối lượng trăm hạt của các vật liệu thí nghiệm giảm dần theo thứ tự
từ thời điểm I - II - IV–III.
Các dòng chuyển gen K3-ZmDREB2A và K7-ZmDREB2A đã thể hiện được

khả năng chịu hạn khi đánh giá năng suất cá thể do có tỷ lệ giảm về chỉ tiêu yếu
tố cấu thành năng suất so với điều kiện hạn nhân tạo thấp hơn các vật liệu nền
tương ứng. Tuy nhiên, chỉ có dòng K7 – ZmDREB2A có sự khác biệt có ý nghĩa
với độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó cây ngô chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt
hơn dòng ngô nền tương ứng K7, K3 trong điều kiện hạn, quá trình phát triển bắp
và tích lũy vật chất khô trong hạt cao hơn. Kết quả bảng 3.26 cho thấy, năng suất
của các vật liệu khác nhau giữa 2 môi trường đủ nước và hạn. Kết quả này phù
hợp với kết luận trong nghiên cứu của Zaidi (2002) và Lê Quý Kha (2005): hạn
gây thiệt hại nặng đến năng suất vì thời gian chín của hạt bị rút ngắn, giảm tuổi
thọ và tăng tốc độ già hoá bộ lá, giảm tổng lượng chất đồng hoá, giảm tích luỹ
chất khô về hạt; đồng thời làm giảm diện tích quang hợp, giảm khả năng sử dụng
bức xạ mặt trời và giảm chỉ số thu hoạch[13],[189].
23