Tạo dòng vi khuẩn escherichia coli biểu hiện protein dung hợp ecotinminiproinsulin dạng tan trong chu chất_báo cáo nghiên cứu khoa học giáo viên

MỤC LỤC
Trang
I. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài ...............................................................2
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................2
1.2. Nội dung thực hiện ................................................................................4
1.3. Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp .............................................4
1.4. Kết quả, biện luận .................................................................................9
1.5. Kết luận, đề nghị .................................................................................21
II. Phụ lục
Tài liệu tham khảo


2

I. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1.1. Mục tiêu của việc thực hiện đề tài [1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 14]
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường
glucose trong máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, cơ thể bị nhiễm độc keto
axit, kèm theo triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh… Bệnh xảy
ra do hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hoặc insulin đủ nhưng hoạt động kém
hiệu quả. ĐTĐ có thể gây biến chứng cấp như nhiễm trùng, nhiễm toan, hôn mê,
tăng thẩm thấu hoặc biến chứng mãn tính như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ
tim, mù lòa, suy thận, rối loạn tiêu hóa, niệu sinh dục, loét bàn chân, bị cắt cụt tứ
chi…
Trong sản xuất protein tái tổ hợp, mục tiêu hàng đầu là tạo ra số lượng lớn
nhưng đồng thời protein mục tiêu phải tồn tại ở cấu hình có hoạt tính tức phải có sự
gấp cuộn chính xác. Vi khuẩn Gram âm E. coli là một trong những ưu tiên chọn lựa
làm tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp do khả năng sinh sản nhanh, đạt mật
độ cao trong những môi trường nuôi cấy rẻ tiền đồng thời bộ gen của E. coli đơn
giản và đã được giải trình tự. Thông thường, khi sử dụng E. coli làm tế bào chủ để

sản xuất protein tái tổ hợp thì những protein này được định vị trong tế bào chất. Đây
là môi trường khử nên những protein mục tiêu biểu hiện vượt mức thường có xu
hướng kết tụ, hình thành một dạng không tan (thể vùi) và protein không có hoạt tính
do cấu hình không chính xác. Để phục hồi hoạt tính mong muốn của protein mục
tiêu, đầu tiên thể vùi (protein mục tiêu) phải được tách chiết từ tế bào chất, hòa tan
thể vùi và phải được tái gấp cuộn để có cấu hình chính xác. Tuy nhiên, hiệu suất của
quá trình tái gấp cuộn còn tùy thuộc rất nhiều yếu tố, một trong những yếu tố quan
trọng nhất chính là protein mục tiêu. Nếu phân tử protein mục tiêu ở dạng tự nhiên
càng có nhiều cầu nối disulfide, thì quá trình tái gấp cuộn càng có hiệu quả thấp.
Trong phân tử insulin tự nhiên có 3 cầu nối disulfit, trong đó hai cầu nối disulfide
tại vị trí amino acid A7-B7, A20-B19 hình thành ở vùng A và B, một cầu nối


3

disulfide giữa amino acid A6-A11 bên trong chuỗi A. Sự hiện diện của 3 cầu nối
này làm cho hiệu suất tái gấp cuộn MPI không cao khi biểu hiện vượt mức trong tế
bào chất của E. coli.
Trong khi đó, vùng chu chất của E. coli là một môi trường có tính oxi hóa và
chứa nhiều nhân tố xúc tác hình thành cầu nối disulfide như họ protein Dsb
(disulfide bond) nên thuận lợi cho tái gấp cuộn cho protein mục tiêu. Một ưu điểm
khác khi biểu hiện protein mục tiêu trong chu chất là số lượng và chủng loại protein
của tế bào chủ hiện diện không nhiều trong chu chất (khoảng 100 loại) so với tế bào
chất (trên 3000 loại) nên quá trình tinh chế protein mục tiêu sẽ thuận lợi hơn và hiệu
quả hơn khi protein mục tiêu được biểu hiện trong tế bào chất.
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng Ecotin, protein ức chế trypsin
ở E. coli được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một trình tự tiết nằm ở đầu N của
Ecotin. Bằng cách dung hợp trình tự tiết và trình tự mã hóa Ecotin vào đầu N của
proinsulin thì proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất và sự tái gấp cuộn của
proinsulin có hiệu quả cao so với việc dung hợp với các peptide tín hiệu của các gen

pelB, dsbA, hay ompT. Trong nghiên cứu này, trình tự tiết và trình tự mã hóa
Ecotinđược sử dụng để dung hợp với đầu N của MPI để cấu trúc dòng vi khuẩn E.
colicó khả năng biểu hiện Ecotin-miniproinsulin dạng tan trong chu chất có cấu
hình gấp cuộn tự nhiên. Dòng tái tổ hợp này sẽ sử dụng như là nguồn giống để tạo
insulin tái tổ hợp có hoạt tính dùng trong sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ.
1.1.2. Sự cần thiết của nghiên cứu đề tài [6, 7, 8, 9]
Số lượng bệnh nhân TĐ ngày càng gia tăng tạo ra nhu cầu rất lớn về insulin.
Quy trình sản xuất insulin thương phẩm dùng trong điều trị TĐ được bắt đầu bằng
việc chiết xuất insulin từ tụy của bò và heo. Tuy nhiên, nguồn insulin ly trích từ
động vật không đủ, có nhiều rủi ro và giá thành cao. Năm 1955, Frederick Sanger
đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin người, tạo cơ sở cho các nhà khoa học tổng
hợp được gen mã hóa cho insulin người và dùng công nghệ gen để sản xuất số
lượng lớn insulin người tái tổ hợp với hiệu quả cao và giá thành rẻ hơn nhiều lần


4

[9]. Vào năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E.
coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người
tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food
& Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép
lưu hành. Đến năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức
hết hiệu lực, mở ra một cơ hội lớn cho các nước đang phát triển tiếp cận và sản xuất
loại thuốc này.
Con số điều tra không đầy đủ nhưng đã cho thấy rằng Việt Nam cũng nằm
trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở mức cao, vì vậy nhu
cầu insulin là rất lớn. Tuy nhiên, việc phụ thuộc lâu dài vào nguồn insulin ở nước
ngoài với giá thành cao rõ ràng không phải là con đường tối ưu nền kinh tế Việt
Nam. Trước tình hình như trên và với điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị

cũng như về nhân lực của PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, thuộc Trường ĐH
Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu công
nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ trong điều trị bệnh tiểu đường với giá thành
phù hợp với mức chi tiêu của người dân là một định hướng nghiên cứu thiết thực và
cần thiết. Mục tiêu và nội dung của đề tài này cũng nằm trong định hướng nghiên
cứu trên và cũng là hướng nghiên cứu mới.
1.2. NỘI DUNG THỰC HIỆN
Khuếch đại đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin từ
bộ gen E. coli W3110 bằng phản ứng PCR và phân lập; cấu trúc plasmid dòng hóa
pGEM-T Easy mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa Ecotin;
cấu trúc plasmid biểu hiện pET-43a mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và
vùng mã hóa Ecotin dung hợp với gen mã hóa miniproinsulin (MPI) người; biến
nạp plasmid này vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli B834(DE3); khẳng định tính
chính xác của protein tái tổ hợp ecotin-miniproinsulin (EMPI) bằng phương pháp
Western-blot; khảo sát nồng độ cảm ứng của IPTG và chất hỗ trợ (ethanol) để tối ưu


5

sự biểu hiện EMPI dạng tan trong chu chất; tối ưu hóa điều kiện chiết tách phân
đoạn chu chất.
1.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
1.3.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng chủ E. coli DH5[F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-,
mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] được dùng để dòng hóa các gen và tạo
lượng lớn các plasmid tái tổ hợp.
- Chủngchủ E. coli B834(DE3) [F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm met (DE3)]
được dùng để nghiên cứu sự biểu hiện gen trong plasmid pET43EMPI.
- Chủng chủ E. coli W3110 [F-λ- rph-1 INV(rrnD, rrnE)] dùng để tách bộ
gen.

- Chủng chủ E. coli DH5/pET43Ins mang plasmid chứa gen mã hóa cho
mini-proinsulin
1.3.2. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường được sử dụng là môi trường LB (Luria-Bertani) có thành phần
trong 1 lít như sau: Bacto-Tryptone 10g, cao nấm men 5g và 10g NaCl.
1.3.3. Hóa chất
Các hóa chất phân tích dùng trong thí nghiệm phân tử được mua từ các hãng
Merck, Fermentas, …, và cách thức thực hiện theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.
1.3.4. Phƣơng pháp
1.3.4.1. Cấu trúc gen mpi để đƣợc biểu hiện dạng tan trong chu chất E.
coli [5]
Nhằm biểu hiện MPI ở dạng tan trong chu chất của E. coli, chúng tôi chọn
phương án dung hợp trình tự mã hóa MPI với trình tự mã hóa ecotin và thẻ 6xHis ở
đầu N. Trình tự tín hiệu (ss) và gen mã hóa ecotin giúp cho MPI được biểu hiện


6

trong chu chất E. coli. Thẻ 6xHis giúp cho bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí
ái lực với cột Ni-NTA. (GS)6 (trình tự lặp lại 6 lần của Gly-Ser) giúp tạo ecotin ở
dạng dimer đồng hóa trị. Ngoài ra, một vị trí cắt của TEV protease (ENLYFQG) đã
được chèn vào cấu trúc này giữa ecotin và 6xHis có vai trò giúp loại bỏ ecotin ra
khỏi protein dung hợp 6xHis-MPI. Một gốc methionine (R) được chèn giữa thẻ
6xHis và MPI giúp việc loại bỏ thẻ 6xHis khỏi MPI bằng CNBr. Do đó, chỉ bằng
một bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực với cột Ni-NTA và xử lý bằng
cặp enzyme trypsin/ carboxypeptidease B, chúng tôi dự kiến có thể thu nhận được
insulin hoàn chỉnh giống với cấu trúc tự nhiên. Cấu trúc gen để biểu hiện MPI dung
hợp với ecotin và 6xHis trong chu chất E. coli để thu nhận insulin được minh họa ở
Hình 1. Cấu trúc này được tạo thành bằng cách: (i) Nhân bản gen mã hóa ecotin
cùng với trình tự peptide tín hiệu bằng phản ứng PCR dùng khuôn DNA bộ gen của

E. coli và tạo dòng trong plasmid pGEM thành plasmid pGEco; (ii) Tổng hợp trình
tự linker chứa đoạn (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG)
bằng phản ứng PCR tái tổ hợp; nối trình tự linker này vào đầu C của ecotin trong
plasmid pGEco tạo thành plasmid pGEcolin chứa gen mã hóa ecotin và trình tự
linker; (iii) Thu nhận gen mã hóa ecotin và trình tự linker từ plasmid pGEcolin và
nối vào trình tự mã hóa 6xHis-MPI trong plasmid pET43-Ins tại vị trí tương ứng với
đầu N của 6xHis-MPI để có được plasmid pET43EMPI biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp với ecotin (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ mô tả cấu trúc trình tự mã hóa protein dung hợp ecotin-MPI
được dòng hóa trong pET43EMPI. Đoạn gen mã hóa ecotin gồm trình tự tín
hiệu (ss) và gen cấu trúc được dung hợp ở đầu N của MPI. Đoạn linker gồm
trình tự lặp lại của 6 Gly-Ser và một vị trí cắt của TEV protease. Thẻ 6His và
gốc methionine (R) giúp loại bỏ thẻ 6His và MPI bằng CNBr. Vị trí cắt
protease được chỉ bằng mũi tên.


7

1.3.4.2. Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI trong các chủng E. coli
a. Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI
Cấy một khuẩn lạc của dòng E. coli/ pET43EMPIvào bình nuôi cấy chứa
5ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml. Nuôi cấy qua đêm, 37oC. Hút dịch
huyền phù tế bào chuyển vào bình nuôi cấy mới chứa 10ml LB lỏng có bổ sung
ampicillin 100µg/ml. Nuôi cấy lắc ở 37oC đến khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt đến
0,8. Bổ sung IPTG sao cho nồng độ cuối đạt 0,5mM và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 25 oC,
trong 24 giờ. Ly tâm thu sinh khối ở thời điểm OD 600 = 2,5 với tốc độ 10.000
vòng/phút, 5phút, nhiệt độ phòng. Rửa sinh khối tế bào 2 lần với nước cất.Ly tâm
10.000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ hết phần dịch.Hòa sinh khối trong 100µl dH 2O.
Bổ sung tiếp 25µl dung dịch nạp mẫu điện di protein 5X. Vortex đều, đun sôi

100oC, trong 10 phút.Ủ ngay vào đá lạnh trong 15 phút để biến tính protein. Ly tâm
thu dịch nổi 10.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC và phân tích bằng điện di SDS-PAGE.
b. Tạo shock thẩm thấu và kiểm tra khả năng tiết của ecotin-MPI trong chu
chất
Thu 1,5ml dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng IPTG vào eppendorf.Ly tâm
10.000 vòng, 5 phút.Sinh khối được huyền phù trong 200µl dung dịch chứa sucrose
25%, Tris-HCl 0,3M, MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, pH 8.Để eppendorf ở nhiệt độ
phòng 30 phút.Ly tâm 13.000 vòng, 5 phút, 4oC. Dịch nổi được loại bỏ và cặn được
làm tan trong 100µl dung dịch đã làm lạnh chứa MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, TrisHCl 10mM, pH 8, để trong đá 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 15 phút, 4oC. Dịch nổi
(phân đoạn chu chất) được thu nhận. Cặn tủa (phân đoạn tế bào chất) được huyền
phù trong nước. Phân tích sự hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất và trong tế
bào chất bằng điện di SDS-PAGE.
c. Phân tích sự biểu hiện ecotin-MPI bằng điện di SDS-PAGE
Nạp mẫu vào mỗi giếng của gel gom trong bản gel polyacrylamide 12,5%.
Điện di với điện thế 160V, 2mA/giếng cho đến khi phẩm màu xanh tiếp cận đầu
dưới của gel. Dừng điện di và nhuộm gel trong dung dịch nhuộm khoảng 1 giờ. Giải
nhuộm cho đến khi nền gel trong suốt không màu.


8

d. Xác nhận protein dung hợp ecotin-MPI bằng Western blot
* Chuyển màng
- Điện di SDS-PAGE các mẫu và thang phân tử lượng protein đã nhuộm sẵn.
Sau khi điện di cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích. Ngâm và lắc gel trong dung
dịch chuyển màng (Towbin) 10 phút.
- Chuẩn bị một màng lai nitrocellulose, hai tấm giấy thấm có kích thước phù
hợp với kích thước của gel. Ngâm trong dung dịch chuyển màng ít nhất 10 phút.
- Điện chuyển thẩm: làm ướt tất cả các miếng xốp bằng dung dịch chuyển
màng, sau đó xếp theo thứ tự cực âm, miếng xốp, giấy lọc, gel, màng lai, giấy lọc,

miếng xốp, cực dương. Khóa bộ điện chuyển màng lại, thêm dung dịch chuyển
màng ngập các miếng xốp.
- Lắp vào bồn điện di, chuyển với dòng điện 25V, 350mA trong 1 giờ.
- Lấy màng lai ra, đánh dấu mặt trên.
* Khóa màng
- Chuyển màng lai vào hộp chứa dung dịch khóa màng.
- Lắc nhẹ trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng.
* Phát hiện protein bắt đặc hiệu với kháng thể
- Rửa màng lai 3 lần, với 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần.
- Bổ sung 15ml dung dịch chứa kháng thể kháng HUI-18. Lắc nhẹ ở nhiệt độ
phòng trong 1 giờ.
- Rửa màng lai 5 lần, 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần.
* Hiện phim
- Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bề mặt của màng bằng 1ml hỗn
hợp reagent 1 và 2 (bộ Kit HyperfilmTM ECL). Đậy màng lai lại bằng nylon.
- Chuyển vào phòng tối, áp sát mặt phim lên phía trên, đúng với vị trí của
màng lai, giữ cố định 5-10 phút.
- Nhúng phim vào dung dịch developer đến khi vạch protein xuất hiện.
- Nhanh chóng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến khi nền phim
trong suốt.


9

- Rửa phim lại bằng nước, mang ra khỏi phòng tối, phơi khô.
1.3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy và cảm ứng đến biểu
hiện ecotin-MPI trong chu chất
a. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG
Chủng được nuôi cấy ở 250C và cảm ứng trong 24 giờ bằng các nồng độ
IPTG khác nhau là 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM và 1,0mM để phân tích mức độ biểu

hiện ecotin-MPI trong chu chất.
Ứng với mỗi điều kiện, thu sinh khối từ 1,5ml dịch nuôi cấy và thu nhận
phân đoạn chu chất để kiểm tra mức độ hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất
bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%.
b. Ảnh hưởng của ethanol
Chủng được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, 4% hoặc
5% ethanol với các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng và phân tích tương tự như mục a.
1.3.6. Các phƣơng pháp ly trích EMPI dạng tan từ chu chất [3, 5, 13]
1. 3.6.1. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [1]
Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút. Sinh khối được huyền phù
trong 500ul dung dịch chứa 25% sucrose, 0.3M Tris–HCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM
EDTA, pH 8.0, để ở nhiệt độ phòng 30 phút sau đó ly tâm 13000 vòng, 5 phút, 4oC.
Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 500ul dung dịch đã làm lạnh chứa
0.5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0, để trong đá 30 phút. Ly
tâm 13000 vòng, 15 phút, 4oC. Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận
chứa EMPI.
1.3.6.2. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [2]
Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 13000 vòng, 2 phút, 4oC. Rửa bằng dung dịch
PBS lạnh (8g NaCl, 0.2g KCl; 1.15g Na2HPO4.7H2O; 0.2g KH2PO4 trong 1 lít nước
cất), pH 7.3, vortex kỹ, lặp lại hai lần. Huyền phù sinh khối bằng dung dịch 20%
sucrose (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 10mM pH 7.5; giữ lạnh 4oC),
vortex, thêm 0,5M EDTA, pH 8.0. Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 5


10

phút, lấy phần tủa. Thêm nước cất lạnh, vortex, để yên trong đá trong 10 phút, ly
tâm 13.000 vòng, 5 phút. Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa
EMPI.
1. 3.6.3. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [3]

Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút. Sinh khối được rửa 2 lần
trong dung dịch chứa 10mM Tris-HCl, pH 8, 30mM NaCl. Cặn được tái huyền phù
trong dung dịch sucrose 20% (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 30mM),
1mM EDTA, pH 8. Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13000 vòng, 5 phút. Tái huyền
phù cặn trong nước cất. Để yên trong đá 10 phút ly tâm 13.000 vòng, 5 phút. Dịch
nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI.
1.4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
1.4.1. Tạo plasmid pET43EMPI biểu hiện ecotin-miniproinsulin trong chu
chất E. coli
1.4.1.1. Thu nhận gen mã hóa cho ecotin
Đoạn gen ecotin mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin được thu
nhận bằng phương pháp PCR từ DNA bộ gen của E. coli W3110 với cặp mồi
Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR và Pfu DNA polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước
khoảng 500bp khi phân tích trên gel agarose 1% đúng như dự đoán (Hình 2). Sản
phẩm này được tinh chế và dòng hóa vào plasmid pGEM.


11

bp
2 3

500

ecotin

100

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen ecotin từ E. coli W3110
bằng cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 1, DNA bộ gen; 2, Thang DNA 100 bp; 3, Sản

phẩm PCR.

Như vậy, gen ecotin đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR
và có mang vị trí cắt giới hạn của hai enzyme NdeI và EcoRI ở hai đầu.Sản phẩm
PCR sau đó được xử lý bằng hai enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế để chuẩn bị cho
bước tạo dòng hóa vào plasmid pGEM.
1.4.1.2. Tạo dòng gen mã hóa ecotin vào plasmid pGEM
a. Tạo plasmid pGEM mang gen ecotin (pGEco)
Plasmid pGEM được tách chiết bằng phương pháp SDS kiềm xử lý bằng hai
enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế. Gen ecotin đã được xử lý bằng NdeI/EcoRI được
nối với plasmid pGEM bằng T4 ligase. Sản phẩm nối được biến nạp vào vi khuẩn
E. coli DH5 và trải trên môi trường LB-Amp có bổ sung X-gal. Chúng tôi thu
được các khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng (kết quả không trình bày). Các
khuẩn lạc trắng được chọn làm các dòng dự tuyển cho các bước sàng lọc phía sau.


12

b. Sàng lọc thể biến nạp (E. coli DH5) chứa plasmid pGEco
Thể biến nạp E. coli DH5 mang plasmid pGEco được tuyển chọn và kiểm
chứng từ các khuẩn lạc trắng bằng phương pháp cắt giới hạn với enzyme NdeI và
EcoRI.Sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với
kích thước của plasmid pGEM) và 500bp (tương ứng với kích thước của gen ecotin)
(Hình 3, giếng 2). Như vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công gen ecotin vào
plasmid pGEM.
Plasmid pGEco thu được đã được giải trình tự với cặp mồi T7/ SP6 để thu
nhận thông tin của trình tự gen ecotin chèn vào. Kết quả so sánh mức độ tương
đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin chính xác 100% (Hình 4).
Plasmid pGEco này được dùng làm nguồn gen ecotin cho các bước tiếp theo.

Hình 3. Kết quả kiểm tra E. coli DH5 / pGEco bằng phương pháp cắt giới
hạn. 1, Thang DNA 1kb; 2, pGEM/EcoRI; 3, pGEco/EcoRI; 4, pGEco/NdeIEcoRI; 5, Thang DNA 100bp


13

Hình 4. Kết quả giải trình tự pGEco và kiểm tra trình tự gen ecotin

1.4.1.3. Tạo dòng gen mã hóa ecotin dung hợp với trình tự nhận biết bởi
TEV protease
Trình tự linker mã hóa đoạn peptide gồm vùng 6 lần lặp lại của dipeptide
Gly-Ser (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG) được tổng hợp
bằng phương pháp PCR tái tổ hợp với cặp mồi A1F/A2R và Pfu DNA polymerase.
Sản phẩm PCR có kích thước 81bp khi được phân tích trên gel agarose 1% đúng
như dự đoán trên lý thuyết (Hình 5giếng 2). Sản phẩm PCR này được tinh chế và
dòng hóa vào plasmid pGEco.
Trình tự linker thu nhận ở trên được xử lý với cặp enzyme EcoRI-NcoI và
được nối vào plasmid pGEco đã được mở vòng cũng bằng hai enzyme trên để tạo
plasmid tái tổ hợp được đặt tên là pGEcolin. Tiếp theo, sản phẩm nối được hóa biến
nạp vào chủng E. coli DH5. Thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được sàng lọc
dựa vào khả năng kháng ampicillin. Trên đĩa môi trường LB-Agar-Amp, chỉ những
tế bào mang plasmid mới có khả năng sống sót và hình thành khuẩn lạc đơn. Đây là
các khuẩn lạc E. coli DH5/pGEcolin dự tuyển.


14

Hình5. Khuếch đại đoạn linker bằng mồi tổng hợp. 1, Thang DNA
100bp. 2, Sản phẩm khuếch đại

Một số khuẩn lạc được chọn để kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt giới
hạn. Plasmid tách chiết từ các khuẩn lac được chọn sẽ được phân tích bằng phương
pháp PCR với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR và Ec_NdeIF/A2R. Kết quả PCR
plasmid được điện di trên gel agarose 1% cho thấy với cặp

mồi

Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR có vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước
đoạn gen ecotin khoảng 500bp (Hình 6, giếng 2) và với cặp mồi Ec_NdeIF/A2R có
vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker khoảng
581bp (Hình 6, giếng 3) đúng như dự đoán lý thuyết. Khi plasmid pGEcolin được
cắt bằng NdeI, sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương
ứng với kích thước của plasmid pGEM) và 581bp (tương ứng với kích thước của
gen ecotin-linker) (Hình 7, giếng 2).
Plasmid pGEcolin thu nhận được giải trình tự với cặp mồi SP6pro/T7ter để
thu nhận thông tin của trình tự gen ecotin-linker chèn vào. Kết quả so sánh mức độ
tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin-linker chính xác 100%
(Hình 8).


15

Hình 6. Kiểm tra plasmid pGEcolin bằng
phương pháp PCR
1, Thang DNA100 bp; 2, Cặp mồi
Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 3, Cặp mồi
Ec_NdeIF/A2R

Hình 7. Kiểm tra thể plasmid pGEcoLin bằng
enzyme cắt giới hạn

1, Thang DNA 1kb; 2, Sản phẩm cắt với NdeI

Hình 8. Kết quả giải trình tự pGEcolin và kiểm tra trên trình tự gen ecotin-linker

Các kết quả trình bày ở trên cho phép kết luận rằng chúng tôi đã tạo dòng
thành công gen ecotin-linker vào pGEM tạo thành plasmid pGEcolin. Plasmid này
được dùng làm nguyên liệu cung cấp gen ecotin-linker để dung hợp với gen mã hóa
MPI.


16

1.4.1.4. Tái tạo dòng gen mã hóa ecotin-MPI trongplasmid biểu hiện
pET43.1.a
Plasmid pET43.1.a biểu hiện ecotin-MPIđược đặt tên là pET43EMPI được
tạo thành từ pGEcolin (mang gen mã hóa ecotin + linker) và pET43Ins (mang gen
và biểu hiện MPI trong E. coli) (Hình 9).

Hình 9. Quy trình thiết lập plasmid pET43EMPI biểu hiện MPI dung hợp với ecotin
dạng tan trong chu chất


17

Plasmid pET43Ins được tách chiết từ dòng tế bào E. coli DH5/pET43Ins và
được cắt mở vòng bằng NdeI. Gen ecotin-linkerđược thu nhận từ plasmid pGEcolin
bằng enzyme NdeI cho ra sản phẩm có kích thước khoảng 581bp (Hình 10, giếng
2). Gen ecotin-linker được nối vào plasmid pET43Ins đã được mở vòng bằng NdeI.
Biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối vào E. coli DH5 và trải trên môi trường LBAmp.Các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB-Amp là thể biến nạp chứa plasmid tái
tổ hợp pET43EMPI.Plasmid tái tổ hợp pET43EMPI được tách chiết và được kiểm

tra bằng phương pháp PCR và phương pháp cắt giới hạn.
Kết quả PCR plasmid trên gel agarose 1% với cặp mồi chuyên biệt
Ec_NdeIF/ A2R cho thấy có vạch DNA đậm mang kích thước tương ứng với kích
thước đoạn gen ecotin-linker khoảng 581bp (Hình 10, giếng 2). Đồng thời khi PCR
plasmid pET43EMPI với cặp mồi T7P/A2R để kiểm tra chiều thì được vạch có kích
thước tương đương với vạch khoảng 631bp (như dự đoán) (Hình 10, giếng 3).
Plasmid pET43EMPI được cắt bằng NdeI đã cho ra 2 vạch: vạch lớn có kích
thước 5.740bp (Hình 11, giếng 3) tương ứng với vạch của pET43Ins khi cắt bằng
XhoI (Hình 11, giếng 2) và vạch bên dưới nhạt hơn có kích thước khoảng 581bp
(Hình 11, giếng 4) tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker.

Hình 10. Kiểm tra pET43EMPI bằng
PCR. 1, Thang 100bp; 2, Cặp mồi
Ec_NdeIF/A2R; 3, Cặp mồi T7P/A2R

Hình 11. Kiểm tra pET43EMPI bằng enzyme
cắt giới hạn. 1, Thang 1kb; 2, pET43Ins/XhoI;
3, pET43EMPI/XhoI; 4, pET43EMPI/NdeI


18

Plasmid pET43EMPI sau khi được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt
giới hạn được giải trình tự. Kết quả (Hình 12) cho thấy gen ecotin-linker được chèn
vào đồng khung với plasmid pET43Ins.

Hình 12. Kết quả giải trình tự pET43EMPI và kiểm tra sự đồng khung của gen mã
hóa ecotin-MPI

Như vậy, chúng tôi đã tạo dòng thành công gen mã hóa ecotin-MPI vào

plasmid biểu hiện pET43.1a cho phép biểu hiện MPI dung hợp với ecotin dạng tan
trong chu chất.
1.4.2. BIỂU HIỆN ECOTIN-MPI DẠNG TAN TRONG CHU CHẤT
1.4.2.1.

Biểu

hiện

ecotin-MPI

trong

chu

chất

E.

coli

B834(DE3)/pET43EMPI
Để đánh giá khả năng tạo protein tái tổ hợp ecotin-MPI trong chu chất của
chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI, mẫu sinh khối sau cảm ứng được thu nhận
và tiến hành ly trích lấy phân đoạn protein trong chu chất bằng phương pháp shock
thẩm thấu. Đồng thời tiến hành thu mẫu protein tổng số và phân đoạn tế bào chất.
Các kết quả thu nhận được phân tích kiểm tra bằng SDS-PAGE và khẳng định bằng
phương pháp Western blot.

19

Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy phân đoạn chu chất của chủng E. coli
B834(DE3)/pET43EMPI được cảm ứng bằng IPTG xuất hiện rõ nét một vạch
protein ecotin-MPI có kích thước khoảng 30kDA (Hình 11 A, giếng 5).
Khi thực hiện lai Western blot với kháng thể kháng thẻ kháng insulin HUI18 cũng thu được kết quả dương tính trên bản phim tương ứng với vị trí protein cần
khẳng định trên gel SDS-PAGE. Như vậy, protein tái tổ hợp ecotin-MPI đã được
biểu hiện thành công ở dạng tan trong chu chất của E. coli như mong đợi.
Bên cạnh đó, protein ecotin-MPI hầu như không được tìm thấy trong phân
đoạn tế bào chất khi sử dụng phương pháp shock thẩm thấu để thu nhận phân đoạn
chu chất. Kết quả này cho thấy dòng tế bào E. coli B834(DE3) mang plasmid
pET43EMPI có khả năng biểu hiện ecotin-MPI một cách vượt mức trong phân đoạn
chu chất. Do đó, có thể khẳng định ecotin đã đưa và biểu hiện protein dung hợp với
nó, ecotin-MPI vào trong chu chất một cách triệt để.

Hình 11. Kết quả khảo sát sự biểu hiện của MPI dung hợp ecotin trong chu chất. (A) Điện di
SDS-PAGE; (B) Lai Western-Blot với kháng thể kháng Insulin HUI18. 1, Thang phân tử lượng
A
B
protein; 2, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG; 3, B834(DE3)/pET43EMPI
được
cảm ứng IPTG; 4, Protein ở phân đoạn tế bào chất; 5, Protein ở phân đoạn chu chất.

Vậy

chúng

tôi

đã

thành

công

trong

việc

tạo

dòng

tế

bào

B834(DE3)/pET43EMPI có khả năng biểu hiện MPI ở dạng dung hợp với ecotin
trong chu chất khi được cảm ứng bởi IPTG đồng thời chứng minh được sự biểu hiện
vượt mức protein trong phân đoạn này bằng SDS-PAGE và Western Blot.


20

1.4.3. TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ NÂNG CAO BIỂU
HIỆN MPI DUNG HỢP VỚI ECOTIN TRONG CHU CHẤT E. coli
Nhằm cải thiện hiệu quả tổng hợp MPI trong chu chất E. coli, chúng tôi
khảo sát các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng nhằm tìm ra các thông số thích hợp nhất
cho quá trình lên men B834(DE3)/pET43EMPI để tổng hợp eccotin-MPI.
1.4.3.1. Ảnh hƣởng của IPTG

IPTG là chất cảm ứng đối với T7 promoter trong đó promoter này điều khiển
trực tiếp quá trình sinh tổng hợp ecotin-MPI.Vì thế nghiên cứu ảnh hưởng của dãy
nồng độ IPTG khác nhau là điều rất cần thiết. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu
hiện ecotin-MPI tái tổ hợp trên chủng biểu hiện B834(DE3)/pET43EMPI khi được
cảm ứng bằng theo các nồng độ IPTG khác nhau là 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM và
1mM.
Kết quả khảo sát trên Hình 12 chỉ ra rằng lượng ecotin-MPI trong chu chất
tăng lên nhưng không nhiều khi bổ sung nồng độ IPTG từ 0,25mM lên đến 0,5mM
và giảm xuống không đáng kể khi tiếp tục tăng nồng độ IPTG lên 0,75mM và 1mM.
Vạch protein ecotin-MPI đậm nhất ứng với 0,5mM IPTG (Hình 12, giếng 3).

Hình 12. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất. 1,
Thang protein chuẩn; 2, 0,25mM; 3, 0,5mM; 4, 0,75mM; 5, 1mM; 6,
B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG


21

Như vậy, có thể kết luận nồng độ IPTG tối ưu để cảm ứng biểu hiện ecotinMPI trong chu chất của chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI là 0,5mM IPTG.
1.4.3.2. Ảnh hƣởng của sự bổ sung ethanol vào môi trƣờng nuôi cấy
Việc thêm ethanol vào môi trường nuôi cấy E. coli cảm ứng đáp ứng sốc
nhiệt và sản xuất các chaperone phân tử và dẫn đến làm tăng sản xuất protein tái tổ
hợp ở E. coli (Kusano và cộng sự, 1999; Van Dyk và cộng sự, 1995). Thêm vào đó,
tương tự quá trình gấp cuộn IGFI, ethanol ảnh hưởng đến sự gấp cuộn của
proinsulin trong chu chất (Hejnaes và cộng sự, 1992). Dựa trên các công bố này,
chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của sự bổ sung ethanol trong môi trường nuôi cấy đến
sự biểu hiện ecotin-MPI.
Kết quả điện di protein trên Hình 13 cho thấy khi bổ sung ethanol với nồng
độ 1% - 2% thì lượng protein tái tổ hợp ecotin-MPI biểu hiện trong chu chất tăng
lên đáng kể thể hiện bằng đậm độ của vạch ở kích thước 30 kDa (Hình 13, giếng 3,

giếng 4). Tuy nhiên, ở nồng độ ethanol cao hơn (3%) lượng ecotin-MPI bị giảm và
sự biểu hiện của protein này bị ức chế hoàn toàn ở 4% - 5% ethanol. Như vậy, việc
bổ sung ethanol 1% đến 2% (v/v) sẽ làm tăng năng suất biểu hiện protein ecotinMPI trong chu chất.

Hình 13. Ảnh hưởng của ethanol (%) trong môi trường nuôi cấy lên sự
biểu hiện ecotin-MPI ở E. coli B834(DE3)/pET43EMPI. 1, Thang protein
chuẩn; 2, 0%; 3, 1%; 4, 2%; 5, 3%; 6, 4%; 7, 5%.


22

1.4.4. Biểu hiện protein dung hợp EMPI dạng tan trong chu chất theo các
phƣơng pháp shock thẩm thấu khác nhau
Việc kiểm chứng sự biểu hiện dạng tan của protein tái tổ hợp trong chu chất
được thực hiện bằng phương pháp SDS-PAGE với việc chuẩn bị mẫu được thực
hiện như trong mục 1.3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy xuất hiện một
vạch protein có kích thước khoảng 30kDa được tìm thấy khi sử dụng 3 phương
pháp shock thẩm thấu khác nhau để ly trích protein ở phân đoạn chu chất (Hình 14,
giếng 2, 3, 4) khi dòng E. coli B834DE3)/pET43EMPI được cảm ứng với IPTG.
Mẫu đối chứng (Hình 14, giếng 5) không xuất hiện vạch protein này. Kết quả cho
thấy phương pháp ly trích protein trong phân đoạn chu chất bằng phương pháp
shock thẩm thấu [1] cho lượng protein dung hợp nhiều hơn so với phương pháp ly
trích protein trong phân đoạn chu chất bằng phương pháp shock thẩm thấu [2], [3].
Ở phương pháp [2] và [3], protein dung hợp ly trích trong chu chất bằng phương
pháp shock thẩm thấu cho lượng tương đương nhau.
Với các kết quả đạt được ở trên, có thể kết luận phương pháp shock thẩm
thấu [1] dùng để ly trích protein mục tiêu dạng tan trong chu chất của E. coli là
phương pháp hiệu quả giúp ly trích lượng protein dung hợp nhiều nhất.

23

kDa

1

2

3

4

5

94
67
43

EMPI

30
20.1
14.1
Hình 14. Kết quả biểu hiện protein EMPI trong chu chất bằng các phương pháp
shock thẩm thấu khác nhau bằng điện di SDS-PAGE. 1, thang phân tử lượng
protein; 2, phân đoạn chu chất được thu nhận bằng phương pháp shock thẩm thấu
[1]. 3, phân đoạn chu chất được thu nhận bằng phương pháp shock thẩm thấu [2].
4, phân đoạn chu chất được thu nhận bằng phương pháp shock thẩm thấu [3]. 5,
phân đoạn chu chất của chủng B834(DE3)/pET43EMPI không được cảm ứng bằng
IPTG.

1.5. KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ
1.5.1. Kết luận
- Đã thiết lập được plasmid biểu hiện pET43EMPI dựa trên sự dung hợp gen mã
hóa ecotin từ E. coli, trình tự linker mã hóa peptide chứa trình tự nhận biết của TEV
protease và gen mã hóa 6xHis-MPI.
- Đã tạo dòng thành công chủng E. coliB834(DE3) mang plasmid tái tổ hợp
pET43EMPI có khả năng biểu hiện MPI dung hợp với ecotin tiết trong chu chất.
- Đã xác định được các điều kiệnnuôi cấy và cảm ứng biểu hiện gen cũng như
phương pháp ly trích phân đoạn chu chất tối ưu nhằm tăng cường sự biểu hiện ecotinMPI trong chu chất.


24

1.5.2. Đề nghị
Đã hoàn thành các nội dung theo yêu cầu của đề tài, đề nghị nghiệm thu đề
tài.

II. PHỤ LỤC
1. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
[1]. Bộ môn Sinh lý học, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (2000)
Sinh lý học Y khoa.
[2.] Gleslie R.D. (1994), Y học thường thức bệnh đái tháo đường. Nhà xuất bản
Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
[3]. Ajamaluddin Malik, Marco Jenzsch, Andreas Lubbert, Rainer Rudolph. (2007)
Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to Escherichia
coli ecotin. Protein expression and purification 55, p: 100-111
[4]. A.Mc. Cormack, A. McElduff (2004), An update on insulin therapy,
Pharmacist, 23, 521-526R.J.Y. Ho, M. Gibaldi (2003), Biotechnology and
Biopharmaceuticals: transforming proteins and genes into drugs, Wiley-Liss.

[5]. Chung, C. H., Ives, H. E., Almeda, S., and Goldberg, A. L. (1983), Purification
from Escherichia coli of a periplasmic protein that. is a potent inhibitor of
pancreatic proteases. J. Biol. Chem. 258, 11032–11038
[6]. F. Sanger, E.O.P. Thompson, R. Kitai (1955), The amide groups of insulin,
Biochem. J., 59, 509-518
[7]. H. Berg, M. Walter, L. Mauch, J. Seissler, W. Northemann (1993),
Recombinant human preproinsulin. Expression, purification and reaction with
insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes
mellitus. J. Immunol. Methods, 164, 221-31


25

[8]. J.Q. Chen, H.T. Zhang, M.H. Hu, J.G. Tang (1995), Production of human
insulin in an E. coli system with Met-Lys-human proinsulin as the expressed
precursor,Appl. Biochem. Biotechnology 55, 5-15
[9]. Nilsson J, Staahl S, Lundeberg J, Uhlen M, & Nygren PA. (1997). Affinity
Fusion Strategies for Detection, Purification, and Immobilization of Recombinant
Proteins.Protein expression and purification.11 (1), 1-16
[10]. S.G. Chang, D.Y. Kim, K.D. Choi, J.M. Shin, H.C. Shin (1998), Human
insulin production from a novel mini-proinsulin which has high receptor-binding
activity, Biochem. J. 329, 631-635
[11]. S.Zimmerman, H. Scheraga (1977), Local interactions in bends of proteins,
Proc. Nat. Acad. Sciences USA, 74, 4126-4129
[12]. W. Kemmler, J.D. Peterson, D.F. Steiner (1971), Studies on the conversion of
proinsulin to insulin, J. Biol. Chemistry, 246, 6786-6791
[13]. Winter J., Neubauer P., Lockshuber R.G., Rudolph R. (2000), Increased
production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by
fusion to dsbA. Journal of Biotechnology 84, 175-185.
[14]. Zhang Y., Olsen R.D., Nguyen B.K.Y., Olson P.S., Rhodes T.E., Mascarenhas

D. (1998) Expression of Eukaryotic proteins in solube form in Escherichia coli.
Protein expression and purification 12, 159-165.