báo cáo thực tập chuyên ngành cnsh y dược

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH
CNSH Y DƯỢC

1


PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I. Đặt vấn đề

II. Tổng quan

III. Vât liệu – phương pháp

IV. Kết quả- giải thích

V. Kết luận – Kiến nghị

VI. Tài liệu tham khảo
2


I. ĐẶT VẤN ĐỀ

•

Kĩ thuật nuôi cấy tế bào là một công cụ cần thiết mở đường cho những nghiên cứu về ung thư,

phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định
sự tương hợp mô trong cấy ghép…

•

Vì vậy việc nắm vững các thao tác cơ bản của kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật là nền tảng thiết
yếu cho tất cả những nghiên cứu trên tế bào.

3


II. TỔNG QUAN

1.

Tủy xương: chứa các loại tế bào : tế bào gốc trung mô
MSC, tế bào gốc tạo máu HSC, tế bào máu trưởng
thành

2.
•.

Tế bào gốc trung mô (MSC)
Có khả năng bám vào bề mặt giá thể khi nuôi cấy in vitro
và có hình dạng giống nguyên bào sợi

•.

Có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau
như xương, mỡ, sụn

Hình 1. Tủy xương

4


III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Vật liệu
•. Mẫu vật: chuột nhắt trắng Swiss Albino.
•. Hóa chất:
-. Cồn 70o
-. Dung dịch PBS (dung dịch kháng sinh 5X, 2X, 1X)
-. Trypan blue
-. Trypsin/EDTA (0.25%/1%)
-. Môi trường DMEM/F12 FBS 10%
-. Môi trường đông lạnh
-. Môi trường giải đông

5


•
-

Dụng cụ:

Erlen

- Buồng đếm hồng cầu

Becher

- Bình flask

Falcon

- Cryotube

Kẹp cong, kẹp thẳng

- Kim tiêm

Kéo thẳng

- Đĩa petri

Ống bóp

- Khay rác

6


2. Phương pháp
NUÔI CẤY SƠ CẤP

Thu nhận xương đùi và
xương cẳng chân chuột

Cắt đầu xương và dội rửa

Loại bỏ mô

thu tuỷ xương

Buồng đếm hồng
n
Bì

Nuôi sơ cấp

ou
hR

x

cầu

Xác định mật độ tế bào

7


THAY MÔI TRƯỜNG

Bổ sung môi trường
Hút bỏ môi trường cũ

Rửa PBS

mới

8


CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

Hút bỏ môi trường cũ

Thêm trypsin

Rửa PBS

Ủ
Thêm môi trường mới

Cấy chuyền
0,5ml
Cho lại vào bình Roux

Thêm môi trường

Ly tâm thu cặn

Thêm môi trường
đông lạnh

0
Đông lạnh ở 4 C (30’)

Đô
n

gl

ạn
h0
, 5m

l

Thêm môi trường nuôi

Cryotube

0
-20 C (1h)

0
-80 C
9


GIẢI ĐÔNG

Bổ sung môi trường giải

o
37 C

Cryotube

đông

Bổ sung môi trường nuôi

Ly tâm thu cặn

Buồng đếm hồng cầu

Xác định tỉ lệ tế bào sống
chết

Bình Roux

10


IV.
1.

KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH

NUÔI CẤY SƠ CẤP

Hình 2. Hình chụp tế bào nuôi cấy sơ cấp

11

Thu được hỗn hợp tế bào: hồng cầu, tế bào đơn nhân và các loại tế bào
khác

Bảng kết quả
Hình thái

Kích thước

Dự đoán

Đĩa lõm, không có nhân

7-8um

Hồng cầu

Tròn, có nhân

Lớn hơn so với hồng cầu

Tế bào đơn nhân

12


Xác định mật độ tế bào
Tế bào

 

Ô lớn 1

44

Ô lớn 2

70

Ô lớn 3

68

Ô lớn 4

51

Ô lớn 5

40

Mật độ tế bào

4
V= A d 10 =

(tế bào/ml)

13

Nhóm 10

Nhóm 8
Hình 3. Hình chụp tế bào nuôi cấy sơ cấp

•
•
-

Nhận xét: Trên cùng 1 con chuột, số lượng tế bào thu được ở tủy xương của nhóm ít hơn nhóm 8
Giải thích:
Trong quá trình thu nhận, dội rửa tủy xương chưa sạch.
Do thao tác chưa tốt, làm gãy một phần khúc xương
Sau khi thu nhận, huyền phù chưa đều  tế bào tập trung thành cụm

14


So sánh quá trình qua ngày nuôi sơ cấp

Ngày 1

Ngày 4

Hình 4. Hình chụp tế bào nuôi cấy sơ cấp

•

Nhận xét: Sau 4 ngày nuôi sơ cấp, xuất hiện nhiều tế bào bám dính và trải, số lượng tế bào hình cầu
giảm.

15


2. Thay môi trường

Trước khi thay môi trường

Sau khi thay môi trường

So sánh tế bào trước và sau khi thay môi trường

16


•
-

Nhận xét:
Sau khi thay môi trường, các tế bào tách ra, các tế bào không bám dính, bám dính yếu bị loại bỏ,
quan sát được các tế bào bám dính (tế bào hình thoi, hình sao, hình sợi dài) với số lượng tế bào
nhiều hơn.

•
-

Giải thích:
Các tế bào không bám dính nổi trên bề mặt và lơ lửng trong môi trường bị loại bỏ sau khi rửa
bằng PBS

-

Môi trường DMEM/F12 + FBS 10% cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào bám dính phát triển

17


3.

CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

Trước cấy chuyền

So sánh trước và sau cấy chuyền tế bào MCF7

Sau cấy chuyền
18


•

Mục đích cấy chuyền

-

Cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho tế bào tiếp tục phát triển

•
-

Tránh hiện tượng kìm hãm tiếp xúc
Nhận xét:
Khi tế bào phủ kín 70-80% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy thì nên cấy chuyền.

19


•
-

Mục đích đông lạnh tế bào
Bảo quản tế bào để sử dụng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau
Tránh tế bào bị nhiễm
Tiết kiệm môi trường nuôi tế bào

20


4. GIẢI ĐÔNG

Hình 6. Hình chụp tế bào sau giải đông

Nhận xét: Sau giải đông thu được những tế bào tròn, căng, màng tế bào nguyên vẹn  tế bào sống
Những tế bào màng tế bào bị rách, tế bào bị méo, móp
 tế bào chết
21


Xác định tỉ lệ sống chết của tế bào

 Mật

Tế bào sống

Tế bào chết

Ô lớn 1

22

3

Ô lớn 2

29

7

Ô lớn 3

35

2

Ô lớn 4

45

5

Ô lớn 5

25

3

4
4
độ tế bào sống V= A x d x10 = x 2 x10

•
•

Số tế bào sống =156 tế bào
Tổng số tế bào =176 tế bào

5
= 6.24 x 10 tế bào/ml

Hiệu suất giải đông tế bào H=

•
•

Nhận xét: Mật độ tế bào sống sau giải đông đạt hiệu suất cao
Giải thích:

- Trong quá trình đông lạnh một số tế bào chết do hình thành tinh thể đá
- Trong quá trình giải đông, một số tế bào chết do sốc nhiệt

22


V.
1.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

-.

Nuôi cấy sơ cấp thành công tế bào tủy xương chuột

-.

Cấy chuyền được tế bào MCF7

-.

Đông lạnh và giải đông tốt

2. KIẾN NGHỊ

•.

Cần thêm thời gian nuôi sơ cấp để đủ mật độ tế bào để cấy chuyền trên chính tế bào của nhóm.

•.

Tiến hành thêm các thử nghiệm: sử dụng các marker bề mặt, biệt hóa in vitro để khẳng định được tế bào
gốc trung mô MSC.

23


PHẦN 2: THỤ TINH IN VITRO (IVF)

A. MỤC ĐÍCH
B. NGUYÊN TẮC
C. QUY TRÌNH- KẾT QUẢ
D. KẾT LUẬN
E. KIẾN NGHỊ

24


A.

MỤC ĐÍCH

Nắm được các thao tác trên giao tử đực và cái
Tìm hiểu được về phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm
Tìm hiểu quá trình hình thành và phát triển của phôi

25