báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược (nuôi cấy tế bào động vật và ivf)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y
DƯỢC
(NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT VÀ IVF)

1


NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

2


NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Thu nhận mô có chứa tế bào sống

NUÔI CẤY SƠ CẤP

Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào

Nuôi cấy

CẤY CHUYỀN VÀ NUÔI CẤY THỨ CẤP

3

THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI,XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT

Nguyên tắc

-Thu nhận xương đùi chuột có chứa tế bào sống tủy xương chuột bằng cách mổ và thu nhận trực tiếp
trên chuột

4


THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI CHUỘT

Kết quả

-Thu nhận thành công xương đùi chuột nguyên vẹn, đúng vị trí

5


THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

THU XƯƠNG ĐÙI CHUỘT

RỬA PBS 5X

RỬA PBS 2X

DỘI RỬA TỦY XƯƠNG

ĐẾM MẬT ĐỘ TẾ BÀO

NUÔI CẤY
6


THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

Nguyên tắc

-Thu nhận quần thế tế bào trong tủy xương bằng cách dội rửa với dung dịch nuôi tế bào (DMEM/F12
bổ sung 10% FBS,kháng sinh 1%)

7


THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

Kết quả

-Sau khi tiến hành dội rửa tủy xương, đoạn xương đã mất màu đỏ bên trong, tế bào đã được dội rửa
ra tỉ lệ cao
-Tuy nhiên, trong quá trình thao tác đã rơi xương nên có khả năng gây nhiễm trong quá trình nuôi cấy.

8


ĐẾM TẾ BÀO

Nguyên tắc

-Đếm tế bào bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu với thuốc nhuộm trypan blue(bắt màu với tế
bào chết).

9


ĐẾM TẾ BÀO

10


ĐẾM TẾ BÀO

11


ĐẾM TẾ BÀO

Kết quả

23

42
37

40

37

A= (23+42+37+40+37)/5*20*10^4=7.16*10^6

12


THAY MÔI TRƯỜNG

HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG CŨ

RỬA BẰNG 1ml PBS

THÊM 3ml MÔI TRƯỜNG MỚI

13


THAY MÔI TRƯỜNG

Kết quả

20um

20um

Trước khi thay môi trường

Sau khi thay môi trường

Đã loại bỏ được các tế bào không mong muốn, các tế bào gốc trung mô đã bám dính được, tỉ lệ bám dính khá
thấp
14

CẤY CHUYỀN

Mục đích – Nguyên tắc

Số lượng tế bào

Môi trường dinh

không thay đổi

dưỡng nghèo dần

Pha dừng
(Stationary
phase)
Tích lũy các sản

Tế bào đi vào

phẩm trao đổi chất

apoptosis

độc hại

Cấy chuyền cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên
tục
15

CẤY CHUYỀN

Mục đích – Nguyên tắc

•
•
•
•

Tần số và tỉ lệ pha loãng phụ thuộc vào
dòng tế bào.
Nếu cấy chuyền quá thường xuyên hay
nồng độ tế bào quá thấp thì chúng có
thể mất
Phương pháp tách tế bào: Cơ học và hóa
học
4 yếu tố ảnh hưởng cấy chuyền: pH (6.0
– 6.5, giảm 0.4/ngày); mật độ tế bào
(70% tế bào); loại tế bào; đánh giá hình
thái tế bào

16


CẤY CHUYỀN

Quy trình

Ly tâm ở 2000 rpm, 5

Huyền phù

phút,
22 độ C

½ chuyển vào bình

Bổ sung 1 ml môi

nuôi và ½ đem đi

trường nuôi tế bào,

đông lạnh

huyền phù đều

Hút bỏ dịch nổi, thu
cặn tế bào
17


CẤY CHUYỀN

Kết quả- biện luận

Lấy tế bào lên bằng scrapper vẫn còn dính ở góc, chưa lấy lên được hoàn toàn. Huyền phù tế bào không đều.

18

ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO

Mục đích – Nguyên tắc

Tiết kiệm môi

Công cấy

trường dinh

chuyền

dưỡng

CẦN ĐÔNG LẠNH
VÀ BẢO QUẢN TẾ
BÀO
Sự giới hạn số lần

Đột biến tế bào

phân chia của tế

qua nhiều lần

bào

phân chia

19


ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO

Mục đích – Nguyên tắc

•

•

Môi trường đông lạnh chứa 10%
DMSO có vai trò đi vào trong tế bào 
Khiến nước đi ra khỏi tế bào  Tế bào
sẽ không bị vỡ do tinh thể nước khi để
trong môi trường lạnh.
Phải đông lạnh chậm để tránh gây thiệt
hại.

20


ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO

Mục đích – Nguyên tắc

Từ 1 ml dịch huyền
phù tế bào vừa thu

Thêm MTĐL từ từ

đươc

Huyền phù nhẹ, tránh
tạo bọt

Chuyển vào -196 độ C trong

Chuyển qua -80 độ C trong 1

Chuyển vào lạnh - 20 độ C

Chuyển vào lạnh 4 độ C trong

nhiều năm

tuần

trong 1 giờ

30 phút
21


GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

Mục đích – Nguyên tắc

•

Phải nhanh chóng làm tan đá hoàn toàn ở 37 độ C để tránh hình thành tinh thể
đá trong tế bào trong quá trình bù nước

•

Các chất đông lạnh có thể làm tổn hại và gây độc tế bào  Nhanh chóng loại bỏ
chất đông lạnh

22


GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

Quy Trình

Huyền phù

Trong không khí 30s

37 độ C trong từ 2 đến 3
phút

Lấy 3 giọt đem đi
đếm tế bào

Thêm 3 ml môi

Ly tâm (1100 rpm,

Huyền phù nhẹ

trường

5 phút), Bỏ dịch nổi

nhàng

Cho môi trường
giải đông tỷ lệ 1:1
từ từ từng giọt
23


GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

Kết quả- biện luận

TRƯỚC ĐÔNG LẠNH VÀ GIẢI ĐÔNG

20um

SAU ĐÔNG LẠNH VÀ GIẢI ĐÔNG





Tỉ lệ tế bào sống rất ít
Nhiều mảnh tế bào vỡ
Lỗi: Thêm môi trường giải đông quá nhanh.

24


THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

25