báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

Nhóm 7

1


PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
I/ Đặt vấn đề
II/ Tổng quan tài liệu
III/ Vật liệu, phương pháp
IV/ Kết quả - Giải thích
V/ Kết luận, kiến nghị

Nhóm 7

2


I/ Đặt vấn đề

ản xuất kháng
hể đơn dòng,
interferon,…

Ngh/c tương tác
tế bào –tế bào.

Nuôi cấy tế
bào động
vật

Sản phẩm của tế
bào

Thu
nhận

Phân
lập

Nuôi
cấy

Quan
sát,
đánh
giá

Mô hình thử
thuốc

Invitro
Nhóm 7

3


II/ Tổng quan tài liệu
1) Tế bào gốc trung mô (MSC):
• MSC là tế bào gốc đa năng, có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau: xương,
sụn, mỡ,….
• Đặc điểm nhận dạng: MSC là tế bào bám dính, biểu hiện các marker bề mặt như: +CD73, +CD90, +105,
-CD45, -CD34, -CD14, -CD79_alpha, -HLA_DR.
• MSC có thể được thu từ tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ.
• Trong nuôi cấy invitro, MSC được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 FBS 10%.
2) Tủy xương:
• Tủy xương là nguồn chứa MSC dồi dào.
• MSC thu từ tủy xương dễ nuôi, dễ lên hơn MSC thu từ máu cuống rốn.
3) Tế bào MCF-7:
Là dòng tế bào ung thư vú.

Nhóm 7

4


III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Vật liệu:
III.1.1/ Mẫu vật:
Chuột nhắt trắng Swiss Albino, 6-8 tuần, 18-22g.
III.1.2/ Hóa chất:
• Cồn 70o
Trypsin/EDTA 0.25%/1%.

• Môi trường DMEM/F12 FBS 10%.
PBS (kháng sinh 5X, 2X, 1X)
III.1.3/ Dụng cụ:
Erlen 250 ml, 50 ml.
Becher 50 ml.
Kẹp.
Kéo.
Đĩa petri φ9-10.
Ống ly tâm loại 15 cm.

Buồng đếm hồng cầu, lamelle
Đầu tip 1ml; 0.1ml.
Micropipette.
Flask 25 cm2.
Khay rác.
Kim tiêm 1ml.

Nhóm 7

5


III/ Vật liệu, phương pháp
III.2/ Phương pháp:
III.2.1/ Thu nhận xương đùi và cẳng chân chuột
III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương
III.2.3/ Thay môi trường
III.2.4/ Cấy chuyền
III.2.5/ Đông lạnh
III.2.6/ Giải đông

III.2.7/ Xác định mật độ, tỉ lệ sống chết của tế bào
Nhóm 7

6


III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:
III.2.1/ Thu mẫu sơ cấp: Thu nhận xương đùi và cẳng chân chuột

Giết chuột: kéo giãn đốt sống cổ
Sát trùng, bật đèn cồn => Đảm bảo mt
vô trùng.

Sát trùng - cồn 70o
Cắt da bụng

Đã được loại bỏ da, lông.

Thu đùi, cẳng chân

Tránh cắt phạm vào xương =>Hạn chế nhiễm.
Trữ mẫu trong PBS kháng sinh 5X

Nhóm 7

7


III/ Vật liệu, phương pháp

III.1/ Phương pháp:
III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương:
Đảm bảo mt vô trùng

Chuyển Falcon chứa mẫu vào tủ ATSH
Rửa mẫu trong PBS 2X

Cắt theo từng bó cơ => Sạch, tiết kiệm
thời gian.

Loại cơ trong PBS 1X
Cắt rời xương đùi và xương cẳng chân

Vừa đủ, nhanh, tránh làm vỡ xương.

Cắt hai đầu xương

Rửa cả hai đầu => Thu nhiều tb.
Tránh làm rớt xương => Nhiễm.
Giữ kim vô trùng

Dùng kim tiêm 1ml, hút mt, dội rửa tủy xương => Thu tb
Huyền phù tb, chuyển vào flask, đem đi nuôi
Nhóm 7

Huyền phù kĩ, tránh tạo bọt.
Cho vào Flask => Tránh chạm miệng.
8

III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:
III.2.3 Thay môi trường:

Mục đích: thay môi trường mới, giúp tb tăng sinh đủ lượng để cấy chuyền.
Chiếu tủ, vô trùng dụng cụ

Hút bỏ mt cũ
Tránh chạm miệng Roux.
Nhỏ lên thành, không nhỏ trực tiếp lên bề mặt.

Rửa bằng PBSTráng nhẹ
Hút bỏ PBS-

3ml => Cung cấp đủ dinh dưỡng, oxi cho tb.
Hút nhả nhẹ nhàng => Tránh tạo bọt, văng ra ngoài, nhiễm.

Cho 3ml mt mới

Tủ nuôi tế bào: 37 độ C, 5% CO2.

Quan sát KHV, đem nuôi
Nhóm 7

9


III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:
III.2.4/ Cấy chuyền:

Mục đích: Cung cấp thêm không gian, dinh dưỡng cho tế bào.

Hút bỏ mt cũ
Tạo điều kiện tối ưu cho trypsin hoạt động

Rửa bằng 2ml PBSTách bằng 1ml trypsin
Ủ 3’ (37độ, 5% CO2)

Kiểm tra tế bào đã tách hết chưa?

Quan sát dưới KHV
Thêm 1ml mt nuôi

Bất hoạt Trypsin

Chuyển ra falcon
Ly tâm 2000 rpm, 5’
Thu cặn
Thêm 1ml mt, huyền phù, cho
vào Flask

Không đổ trực tiếp, phải dùng pipette để hút.
Nhóm 7

10


III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:

III.2.5/ Đông lạnh:
Hút bỏ mt cũ
Rửa bằng 2ml PBS-

Mục đích: Tránh phơi nhiễm khi cấy chuyền, tiết kiệm mt nuôi, trữ tế
bào cho những nghiên cứu sâu.
Môi trường đông lạnh chứa DMSO, Glycerol.

Tách bằng 1ml trypsin
Ủ 3’ (37độ, 5% CO2)

Quy trình đông lạnh: 4 độ -30’ => -20 độ - 1h => -80 độ - 16 h => -196 độ - dài hạn.

Quan sát dưới KHV
Thêm 1ml mt nuôi
Chuyển ra falcon

Môi trường đông lạnh: 2X -> Sử dụng ở nồng độ 1X.

Thu cặn
Thêm 1ml mt nuôi, huyền phù đều
Thêm từ từ 1 ml mt đông lạnh

Cho mt đông lạnh vào từ từ => Tránh shock tế bào.

Huyền phù nhẹ nhàng
Nhóm 7

11

III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:
III.2.6/ Giải đông:

Mục đích: Bổ sung nước lại cho tế bào hoạt động bình thường.

30s, nhiệt độ phòng -> 2’, 370c
Chuyển vào tủ thao tác
Thao tác nhẹ nhàng, không cần huyền phù, tránh thao
tác nhiều => Tế bào yếu.

Chuyển vào falcon

Cho nhẹ nhàng, từ từ, huyền phù trên mặt.

1ml mt giải đông
Ly tâm 1100 rpm, 5’
Thu cặn
1ml mt nuôi, huyền phù đều
Chuyển vào flask có sẵn 2ml mt
Nhóm 7

12


III/ Vật liệu, phương pháp
III.1/ Phương pháp:
III.2.7/ Xác định tỷ lệ sống chết của tế bào:
Rửa và lau khô => Đếm chính xác.

Chuẩn bị buồng đếm của tế bào
Pha loãng tế bào bằng PBS
Trộn tế bào với Trypan blue: 1/1
Chuyển tế bào lên buồng đếm

Tế bào sống: sáng, không bắt màu xanh.
Tế bào chết: bắt màu xanh.

Xác định mật độ, tỷ lệ sống chết

Nguyên tắc: Trypan blue bắt màu tế bào chết, không bắt màu tế bào sống.

Nhóm 7

13


IV/ Kết quả- Giải thích

Thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược – PTN TBG

Thu mMSC từ tủy xương chuột

Dòng MCF7

Thu mẫu sơ cấp

Ngày 1

Ngày 2

Cấy chuyền

Thu mẫu thứ cấp

Mật độ 70-90%
Cấy chuyền bằng
cell scrapper

Đông lạnh

Ngày 3

Giải đông,
hoạt hóa

Mật độ < 70%
Thay mt

Cấy chuyền dòng
MCF7 bằng Trypsin
Nhóm 7

Ngày 2

14


IV/ Kết quả- Giải thích

Nuôi sơ cấp

• Thu được xương đùi, xương cẳng chân.
• Thu được hỗn hợp tế bào từ tủy xương chuột.

 Cắt phạm đầu sụn của xương đùi => Nguy cơ nhiễm.
 Cắt đầu xương: mẻ một đầu xương.

Hình 1: Hình tế bào nuôi sơ cấp ở vật kính 5X, 10X, 20X (từ trái sang).

Nhóm 7

15


IV/ Kết quả - Giải thích
Bảng 1: Các loại tế bào kích thước khác nhau ở vật kính 20X
Số thứ tự
Kích thước
Hình dạng
Loại tế bào dự đoán
1

6 – 8 um

Tròn đều, lõm

Hồng cầu

2

10 – 15 um

Tròn đều

Tế bào gốc trung mô

3

3 – 5 um

Tròn đầy

Tiểu cầu

4

10 -15 um

Nhiều hình dạng

Bạch cầu

Mật độ tế bào: (45+30+40+41+42)/5 x 20 x 10^4
= 7.92 x 106 (tb/ml)
45

30
40

41

42

Nhóm 7

16


IV/ Kết quả- Giải thích

Thay môi trường:

Các tế bào bám và trải có hình dạng của nguyên bào sợi
=> Nghi ngờ là tbg trung mô.
→ Màu mt: đỏ ->
vàng cam, trong
=> CO2 ↑, pH
giảm, Phenol red
đổi màu; không
nhiễm.
→ Có tế bào không
bám, bám (trải,
chưa trải).

Hình 2: Hình tế bào nuôi sơ cấp trước khi thay môi trường ở vật kính 5X, 10X, 20X.
→ Tế bào phân
bố không
đều.

→ Vẫn còn một
số tế bào
không bám.

Nhóm 7
Hình 3: Hình tế bào nuôi sơ cấp sau khi thay môi trường ở vật kính
5X, 10X, 20X.

17


IV/ Kết quả- Giải thích

Cấy chuyền tế bào MCF7

→ Màu môi trường: vàng
cam.
→ Tế bào bám, mọc thành
cụm, mọc chồng lên
nhau => Không xác
định được mật độ.
→ Hình dạng: polygonal.
Hình 4: Hình tế bào MCF7 trước khi cấy chuyền ở vật kính 5X, 10X, 20X .

Nhóm 7

18


IV/ Kết quả- Giải thích

Giải đông

Mật độ tế bào sống: (22+16+24+24+23)/5 x 20 x 10^4 = 43.6 x 106 (tb/ml)
22

16

4

24
23

1
2

24

2

Mật độ tế bào chết: (4+1+2+2+3)/5 x 20 x 10^4 = 4.8 x 106 (tb/ml).
Mật độ tế bào: 48.4 x 106 (tb/ml).

3

Tỉ lệ tế bào sống: 90.08%.

Nhóm 7

19

V/ Kết luận, kiến nghị
1) Kết luận:
 Qua thu mẫu sơ cấp, thứ cấp quần thể tế bào từ tủy xương => Thu được tế bào nghi ngờ là tbg trung mô.
 Vì lần đầu tiên làm, có nhiều thiếu sót nên số lượng tế bào thu được không nhiều, không đủ để thực hiện cấy
chuyền (bằng cell scrapper), đông lạnh dòng tế bào này.
 Nắm được các thao tác cấy chuyền (bằng trypsin), đông lạnh bảo quản, hoạt hóa trên dòng tế bào MCF7. Sau
hoạt hóa, tế bào MCF7 vẫn sống với tỉ lệ lên đến 90.08%.
 Trong cả khóa thực tập, không ghi nhận trường hợp nhiễm.
 Nhận diện được hình dạng của các dòng tế bào khác nhau: MSC (giống nguyên bào sợi), MCF7(hình
Polygonal).

2) Kiến nghị:
 Phương pháp xa hơn để xác nhận MSC: marker bề mặt (+CD73, +CD90, +105, -CD45, -CD34, -CD14,
-CD79_alpha, -HLA_DR), cho biệt hóa thành xương, sụn, mỡ,…
 Cẩn thận hơn trong thao tác thu tế bào để thu được nhiều tế bào hơn.
 Nâng cao kĩ thuật đếm tế bào.
 Được cấy chuyền dòng MSC tự thu.
Nhóm 7

20


PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

I/ Mục tiêu
II/ Mẫu vật
III/ Nguyên tắc
IV/ Kết quả - Giải thích

V/ Lưu ý
VI/ Kết luận – Kiến nghị
Nhóm 7

21


I/ Mục tiêu
Nắm được: Các thao tác trên giao tử đực và cái.
Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm.
Quá trình phát triển của phôi.

II/ Mẫu vật
Chuột nhắt trắng 6-8 tuần, 18-22g

Nhóm 7

22


III/ Nguyên tắc
1. Tiêm chuột
a) Tiêm hoormon:
- Cầm chuột ngửa, dốc ngược chuột xuống => tránh tiêm vào nội tạng.
- Tiêm vào khoang bụng tại vị trí: giao điểm của hai đường chéo nối 2 cặp vú dưới.
- 5h45’ 03/11 tiêm PMSG: 0.1ml (100IU/ml). Sau 46-48h 17h15’ tiêm hCG: 0.1 ml (100IU/ml).
b) Tiêm thuốc mê Ketamin:
- Tiêm vào bó cơ đùi.
- Mũi kim song song với xương đùi.
- Liều: 0.1 ml

2. Lọc dầu khoáng:
- Giữ màng lọc vô trùng.
- Hút dầu khoáng ở lớp trên (vì lớp dưới là nước).
- Khi bơm dầu khoáng qua màng lọc, bơm từ từ.
Nhóm 7

23


III/ Nguyên tắc
3. Tạo vi giọt:
• Các vi giọt không được chạm vào nhau, không chạm vào thành.
• Dầu khoáng phải phủ kín vi giọt => Tránh nhiễm, tránh thay đổi nồng
độ các chất.
• Sau khi tạo vi giọt, tiến hành ủ ấm mt trong thời gian nhất định để cân
bằng pha khí.
• Tạo vi giọt đứng và nằm.
4. Kéo kim:
• Kim đầu lớn: kéo chậm, đoạn kéo ngắn, góc kéo 135o
• Kim đầu nhỏ: kéo nhanh, đoạn kéo dài, góc kéo 135o
• Mài nhẹ, cách đầu kim khoảng 3cm, tránh để mẻ đầu kim.
Nhóm 7

24


III/ Nguyên tắc
5. Chọn giao tử:
a) Giao tử đực:
• Chọn tinh trùng sống, không dị dạng, di động, tiến tới.

• Mật độ tinh trùng: 1- 2.5x106 tt/ml
b) Giao tử cái:
• Chọn trứng tròn, không phân mảnh, có lớp cumulus.
• Chọn trứng trưởng thành: có thể cực thứ nhất.

Nhóm 7

25