nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Báo cáo

THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

1


PHẦN 1

PHẦN 2

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM


1

2

3

ĐẶT VẤN ĐỀ

CƠ SỞ LÝ THUYẾT

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

4

5

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

KHÓ KHĂN-KHẮC PHỤC


PHẦN 1:

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

THU XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT
1.1

1.2

THU QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

1.3XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO

NUÔI TẾ BÀO TỦY XƯƠNG SAU 2 NGÀY
1.4

THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG
1.5

CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH
1.6

1.7GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO

Sơ đồ phòng thí nghiệm

Phòng hấp rửa

Phòng nuôi cấy tế bào
Phòng IVF

Phòng sinh học phân tử

Phòng thay đồ

*Cửa ra vào có máy quét phân quyền sử dụng -> an toàn, bảo mật
*Các phòng được phân cách và bố trí dựa theo mức độ vô trùng: phòng nuôi cấy tế bào cần mức độ vô trùng cao -> trước khi vào cần qua phòng thổi khí (Air
shower)

Pha PBS:
Dụng cụ:
Duran 1L, Erlen 1L, giấy bac, giấy trắng, giấy chỉ thị nhiệt, máy hấp, máy khuấy từ, cá khuấy từ, cân phân tích, giấy cân, nước cất 1 lần, nước cất 2 lần, ống đong
1L, găng tay, thun.

Thành phần trong 1L

Lý thuyết

Thực tế

NaCl 8g

NaCl 8.0011g

Na2HPO4.12H20 2.9384g

Na2HPO4.12H20 2.9334g

KCl 0.2g

KCl 0.2033g

KH2PO4 0.2g

KH2PO4 0.2016g


1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Nuôi cấy tế bào động vật là kĩ thuật cơ bản cần nắm để tiến hành những thí nghiệm liên quan đến tế bào động
vật, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu Y, Sinh, Dược.

2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MSC)
Đặc điểm hình dạng
Thuôn dài, như nguyên bào sợi.
Đặc điểm in vitro (theo Dominici và cộng sự, 2006)

1.
2.
3.

Bám dính lên plastic ( trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn)
Kháng nguyên bề mặt đặc trưng (CD105, CD73, CD90), không biểu hiện CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79α or CD19 and HLA-DR.
Biệt hóa thành nhiều loại tế bào: sụn, xương, mỡ. (TBG đa năng)


1.1 THU NHẬN XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT
VẬT LIỆU

MẪU VẬT:

3
PHƯƠNG PHÁP

Kéo giãn đốt sống cổ

- Chuột nhắt trắng
Sát trùng và cắt ngang bụng

0
0
- Dung dịch PBS (kháng sinh 5X), cồn 90 , cồn 70
Loại da, cắt ngang khớp háng và gót chân

DỤNG CỤ:
- Khay rác, kéo lớn, kéo nhỏ, 2 kẹp, falcon 15ml, đèn cồn,
găng tay, khẩu trang.

Thu chân sạch lông, da => Falcon 15ml PBS có kháng sinh

- Tủ kính lớn.

Tủ an toàn sinh học cấp II

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

HÓA CHẤT:


1.1 THU NHẬN XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

Thu được toàn vẹn chân chuột gồm xương đùi, xương cẳng chân, phần khớp không bị cắt phạm, nhưng còn dính lông.

Khó khăn
Thao tác xử lý chuột còn chưa thuần thục

Cách khắc phục
Luyện tập nhiều hơn


1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

VẬT LIỆU

Mẫu vật: Xương đùi chuột

3
PHƯƠNG PHÁP
Đùi chuột (PBS kháng sinh 5X)

Hóa chất:
- Dung dịch PBS kháng sinh 2X, 1X

Falcon PBS kháng sinh 2X

- Môi trường DMEM/F12 FBS 10%
- Cồn 700
Dụng cụ:

Petri PBS kháng sinh 1X
Loại bỏ cơ

- Kẹp cong, Kẹp thẳng, Kéo thẳng
- Đĩa petri đường kính 9-10cm, Becher 50ml
- Giá để falcon, Pipette, Kim tiêm 1ml

Petri PBS kháng sinh 1X

Đếm mật độ

Loại bỏ cơ còn sót lại

- Bình flask 25cm2, Eppendorf 1.5ml

flask

- Găng tay, khăn lau
Thiết bị:
- Tủ an toàn sinh học
- Kính hiển vi đảo ngược

Soi dưới kính hiển vi
Cắt đầu xương, bơm rửa tủy xương
bằng DMEM/F12 FBS 10%
nuôi


1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH
Bảng 1: Các loại tế bào trong tủy xương chuôt
Ø

Hình thái

Dự đoán loại tế bào

20-90µm

Hơi tròn, viền lồi lõm

Megakaryocyte, hủy cốt bào, Promegakaryocyte

12-20µm

Tròn/hơi bầu dục,

Pronormoblast, myeloblast, neutrophilic myelocyte, eosinophilic myelocyte,

viền rõ

eosinophil, basophilic myelocyte, lymphoblast, prolymphocyte, lymphocyte,
plasma cell, monoblast, promonocyte, monocyte, Megakaryoblast, promyelocyte

10-15µm

Khó khăn

Cách khắc phục

Mỏi tay trong quá trình loại bỏ

Đặt kéo, kẹp gác lên miệng đĩa petri, để tay nghỉ

Tròn/hơi bầu dục,

basophilic normoblast, neutrophilic metamyelocyte, neutrophilic band,

viền rõ

segmented neutrophil, eosinophilic metamyelocyte, eosinophilic band, basophilic
metamyelocyte, basophilic band, basophil,

cơ
Khó tách sạch cơ

Cắt riêng 2 khúc xương -> tách cơ từng khúc

8-10µm

tròn

Orthochromic normoblast, reticulocyte, Polychromatic erythroblast

7-8µm

Tròn, lõm ở giữa

Hồng cầu

một
(Bảng 1 theo Bernadette F. Rodak and Jacqueline H. Carr,
Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)


1.3 XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO

VẬT LIỆU

3
PHƯƠNG PHÁP

MẪU VẬT:
-Epp chứa 3 giọt dung dịch tế bào trong tủy xương

3 giọt từ Vbđ = 3ml

10µl+90µl PBS

VẬT LIỆU gồm:
-Buồng đếm hồng cầu, Lamelle

10µl( trong 100µl)+

-Pipette, Eppendorf, Đầu tip

10µl Trypan Blue

0
-Cồn 70 , vải lau.
HÓA CHẤT gồm
Nạp mẫu vào Buồng đếm sạch

-Trypan Blue
THIẾT BỊ:
Kính hiển vi

- Kính hiển vi quang học

Đếm mật độ


1.3 XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH




Pha loãng 20 lần
Kết quả:

Ô 1 (TB)

Ô 2 (TB)

Ô 3 (TB)

4
19 TB trung bình x 17
Mật độ TB(TB/ml)= Số lượng
hệ số pha loãng x 1015
= 17x 20x 104
= 3,4 x 106 (TB/ml)




SO SÁNH VỚI NHÓM 10( CÙNG CHUỘT): 1,09 x107 (TB/ml)--> ít hơn
DF

-Huyền phù không đều
GIẢI THÍCH KẾT QUẢ

Trung bình (TB)

17


1.4 NUÔI TẾ BÀO TỦY XƯƠNG SAU 2 NGÀY
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH
Môi trường màu vàng nâu, do tế bào sinh trưởng-> một

Bảng 2: Các loại tế bào trong tủy xương chuột sau 2 ngày nuôi
Ø

số chất có tính acid-> chuyển màu phenol red

70-150 µm

Hình thái

Dự đoán loại tế bào

Trải, bám dính, thuôn

MSC

dài

20-90µm

Hơi tròn, viền lồi lõm

Megakaryocyte, hủy cốt bào, Promegakaryocyte

12-20µm

Tròn/hơi bầu dục,

Pronormoblast, myeloblast, neutrophilic myelocyte, eosinophilic myelocyte, eosinophil,

viền rõ

basophilic myelocyte, lymphoblast, prolymphocyte, lymphocyte, plasma cell, monoblast,
promonocyte, monocyte, Megakaryoblast, promyelocyte

10-15µm

Tròn/hơi bầu dục,

basophilic normoblast, neutrophilic metamyelocyte, neutrophilic band, segmented neutrophil,

viền rõ

eosinophilic metamyelocyte, eosinophilic band, basophilic metamyelocyte, basophilic band,
basophil,

8-10µm

tròn

Orthochromic normoblast, reticulocyte, Polychromatic erythroblast

7-8µm

tròn

Hồng cầu

(Bảng 2 theo Bernadette F. Rodak and Jacqueline
H. Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG

VẬT LIỆU
MẪU VẬT:
- Bình Roux chứa TB đã nuôi sau khi thu TB từ tủy xương

DỤNG CỤ gồm:

3
PHƯƠNG PHÁP
Vệ sinh, chuẩn bị & sắp xếp dụng cụ,
ủ môi trường (MT) mới

Hút bỏ MT cũ

- Becher 50ml
-Ống hút nhựa (sử dụng 3 ống), găng tay, khẩu trang
0
-Cồn 70 , vải lau.

Rửa TB= PBS 1X(2ml)

HÓA CHẤT gồm:
-PBS
-DMEM/F12

Hút bỏ PBS

THIẾT BỊ:

-Kính hiển vi soi ngược.
-Tủ an toàn sinh học
Thêm 3ml MT mới(DMEM/F12)

Kính hiển vi


1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

Màu môi trường (MT) sau khi thay: Đỏ hồng
Hình thái TB dưới kính hiển vi:
(sau khi thay MT)

Bảng 3: Các loại tế bào trong tủy xương sau thay môi trường

Kích thước

70-150 µm

Hình thái

Dự đoán

Trải, bám dính, sợi thuôn dài
MSC

50 µm

Hơi tròn, viền TB lồi lõm

Hủy cốt bào,
Megakaryocytes

20 -25 µm

Hơi tròn Bầu dục, viền không rõ

Megakaryocytes,

nét, hình dạng màng biến động

Promegakaryocytes
Megakaryoblasts
Hủy cốt bào

10-20 µm

Tròn, viền tròn rõ nét

Nguyên hồng cầu, tiền nguyên hồng cầu,
Nguyên (tiền) tủy bào và lympho bào, bạch cầu
mono

5-7 µm
(Bảng 3 theo Bernadette F. Rodak and Jacqueline H. Carr,
Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

Tròn, viền tròn rõ nét

Hồng cầu lưới, bạch cầu, (tiền) lympho bào


1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

NHẬN XÉT - GIẢI THÍCH:
•

Số lượng các tế bào không phải MSC ít hơn nhiều so với trước khi thay môi trường

 Do không có đặc tính bám dính lên plastic flask nên bị rửa trôi.

Trước thay môi trường

Sau thay môi trường


1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

Sau thay môi trường: nhiều tế bào trải hơn, tế bào máu ít hơn.
Mật độ dày hơn lúc mới thay môi trường nhưng vẫn không đủ để cấy chuyền

Bảng 4: Các loại tế bào trong tủy xương chuột sau thay môi trường

Kích thước

30-150 µm

Hình thái

Dự đoán

Trải, bám dính, sợi thuôn dài
MSC

5-7 µm

Tròn, viền tròn rõ nét

Hồng cầu lưới, bạch cầu, (tiền) lympho bào

(Bảng 4 theo Bernadette F. Rodak and Jacqueline H. Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)


1.6 CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH
VẬT LIỆU

3

PHƯƠNG PHÁP

MẪU VẬT:

Flask tế bào MCF-7

- Tế bào ung thư MCF-7

hút bỏ môi trường cũ

+2ml PBS 1X (2 lần) -> rửa tế bào

HÓA CHẤT:

-

Dung dịch PBS kháng sinh

+0,5ml trypsin

1XTrypsin/EDTA0,25%

0
ủ 37 C, 5% CO2, 3 phútQuan sát

Môi trường nuôi cấy
Môi trường đông lạnh DMSO 10%

+1ml môi trường nuôi cấy, huyền phù

Cồn 70o
DỤNG CỤ:

-

hút sạch PBS

-> falcon -> ly tâm 2000rpm, 5p-> bỏ dịch nổi

Flask

Eppendor,

+1ml môi trường nuôi cấy, huyền phù đều

Bao tay, khăn lau
THIẾT BỊ:

- Tủ toàn sinh học
- Máy ly tâm
- Tủ ủ

Hút 0,5ml ->Flask

Hút 0,5ml -> cryotube

+ 2,5ml môi trường nuôi cấy

+ từ từ 0,5ml môi trường đông lạnh

o
Nuôi ở 37 C, 5% CO2

o
-80 C

o
-20 C

o
-4 C

30 phút

1 giờ

tối đa 1 tuần


1.6 CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

Mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt flask đạt khoảng 80%
 Có thể cấy chuyền.

Khó khăn

Khắc phục

Dễ chạm vào miệng falcon khi sử dụng ống hút

Thao tác cẩn thận
Sử dụng pipet Pasteur


1.7 GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO
VẬT LIỆU:

PHƯƠNG PHÁP
o
ủ 37 C, 30s

MẪU VẬT: Cryotube chứa tế bào đông lạnh

HÓA CHẤT: epp dd giải đông,

Chuyển dịch tế bào vào Falcon +

môi trường DMEM/F12 FBS 10%.

DỤNG CỤ: Falcon 15ml,

môi trường giải đông

Huyền phù mặt trên, ly tâm 1100 rpm, 5p

ống hút nhựa 1ml,
2
Becher đựng rác,bình flask 25mm .
Bỏ nổi, thu cặn,
+1 ml môi trường nuôi

THIẾT BỊ: tủ an toàn sinh học cấp II,
máy Li tâm, bể ủ nhiệt, tủ nuôi tế bào
3 giọt -> đếm tế bào

+ 2ml môi trường nuôi ->Falcon, huyền phù và hút vào flask.

tủ nuôi


1.7 GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO
KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH
Sau hoạt hóa: ở dạng huyền phù, phần trăm tế bào nguyên vẹn (sống) cao,tế bào nằm rời rạc.

Kích thước

15-25 µm

Hình thái

Dự đoán

MCF7.

Hơi tròn tròn, viền rõ nét.

(Bảng theo Bernadette F. Rodak and Jacqueline H. Carr,
Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

Kết quả đếm tế bào
Ô
Số tế bào

1

2

3

4

5

28 sống

34 sống

34 sống

25 sống

22 sống

5 chết

3 chết

4 chết

3 chết

2 chết

Số TB trung bình=32 (Tế bào)
4
5
Mật độ TB=32x 2x 10 = 6,4x10 (TB/ml)
Tỉ lệ sống =28,6/32x100= 89,38%


THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

PHẦN 2:

THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH

2.1

THU NHẬN TRỨNG VÀ TINH TRÙNG

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

ĐẾM TINH TRÙNG CHUỘT
LOẠI CUMULUS
THỤ TINH
NUÔI PHÔI
ĐÁNH GIÁ PHÔI SỐNG CHẾT


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF): kĩ thuật hỗ trợ sinh sản quan trọng áp dụng cho người lẫn động vật.

2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Trứng
Gây siêu bài noãn trứng: Gây trứng chín nhanh (PMSG); Gây rụng trứng
(hCG)

Thu nhận trứng: từ ống dẫn trứng, nang trứng.

Trứng tốt: tròn đều, màng TB nguyên vẹn sát màng Zona,TB chất mịn

Trứng chín: có thể cực thứ nhất (túi mầm)

Trứng đã thụ tinh: xuất hiện thể cực thứ hai

Tinh trùng

Thu tinh trùng: từ ống dẫn tinh, mào tinh.

Đánh giá tinh trùng: mật độ, độ di động, độ sống chết.

Đánh giá phôi sống chết: nhuộm huỳnh quang (thuốc nhuộm PI và Hoechst):

Phôi chết (màng tế bào không hoạt độngmàu đỏ PI)

Phôi sống (màng tế bào hoạt động màu xanh Hoest, không có màu đỏ PI)


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Sự phát triển của phôi về hình thái( Mammalian Development, Development Biology Interative)

Buổi 1&2: Thao tác với trứng và tinh trùng heo & lọc dầu khoáng, tạo vi giọt

1.

Đếm tinh trùng heo: ( 1epp chứa 100µl dd tinh trùng)
Phương pháp: Đếm ô giữa buồng đếm (25 ô nhỏ)
PHƯƠNG
PHÁP
 n=19 => Đếm 10 ô nhỏ
 Nhận xét: tinh trùng không di động




Ô

Tinh trùng (sống/chết) (con)

Ô

Tinh trùng (sống/chết) (con)

1

19/2

6

22/3

2

34/7

7

21/4

3

24/5

8

15/0

9

20/3

Mật độ=227/(4x10)x106x2= 11,35 x 106 (tinh trùng/ml)
4

21/1

% tinh trùng chết= 38/227x 100=16,74%
5

29/3

10

22/8

Tổng số tinh trùng (con)

Tinh trùng chết (con)

227

38