nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm ( in vitro fertilization IVF)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN – ĐHQG TP.HCM
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

1


PHẦN 1
NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT


I. TỔNG QUAN
 Cơ sở lí thuyết:
Máu trong tủy xương có ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu(MSC),tế bào
máu trưởng thành và MSC. Trong nuôi cấy, các MSC sẽ bám dính vào bề mặt (giá
thể) nuôi cấy, trong khi đó tế bào còn lại không có khả năng này.
 Đặc điểm của MSC:
Tăng trưởng chậm, nuôi cấy cần giá thể bám, có tính cơ học yếu và cơ chế kiềm
hãm ngược. MSC có thể bảo quản lâu bằng phương pháp lạnh sâu.
Tế bào gốc trung mô: có thể biệt hóa thành té bào xương, hủy cốt bào, tế bào
sụn, tế bào cơ, nguyên bào sợi, tế bào mỡ, tế bào nội mô, đại thực bào…
Chiếm từ 0.001-0.01% tế bào trong tủy xương.


Đặc điểm môi trường DMEM/F12 có bổ xung 10% FBS và 1% kháng sinh
Nồng độ amino axit, vitamin cao thuật lợi cho nuôi tế bào mật độ cao.
Huyết thanh: duy trì khả năng tăng sinh và biệt hóa tế bào ngoài ra còn tăng tính
bám dính của tế bào.
 Ứng dụng:

• Mô hình thử nghiệm và chuẩn đoán bệnh
• Sản xuất các hợp chất sinh học
• Làm vật liệu cấy ghép
• Tạo mô và cơ quan


 Mẫu thu nhận từ tủy xương, nơi chứa nguồn tế bào gốc trung
mô dồi dào.
 Cấy chuyền tăng sinh
• Khi mật độ tế bào MSC trong bình nuôi cấy đạt từ khoảng
70-80% diện tích bình nuôi,
• Nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho MSC,
đồng thời tránh hiện tượng ức chế ngược gây chết tế bào
 Bảo quản đông lạnh.
• Giảm sự thay đổi hay mất các đặc tính của tế bào và giảm
chi phí nuôi cấy.
• Với phương pháp bảo quản lạnh -80⁰C tế bào có thể được
bảo quản khoảng 1 tuần.
• Giải đông
Nhằm đưa tế bào về trạng thái hoạt động bình thường. Cần
môi trường dinh dưỡng cao và phải giải đông nhanh


Nội dung thực tập
Thu nhận quần thể tế bào tủy xương
Xác định mật độ và nuôi sơ cấp
Thay môi trường và cấy truyền
Đông lạnh
Giải đông

II. Vật liệu và phương pháp

1. Vật liệu
Mẫu vật: chuột nhắt trắng, tuổi từ 6-8 tuần
Hóa chất:
• Cồn 70%
• Dung dịch PBS( kháng sinh 5X, 2X và 1X)
• Trypsin/EDTA 0,25%/1%
• Môi trường DMEM/F12 FBS 10%
2. Phương pháp


A: Thu nhận quần thể tế bào tủy xương, nuôi cấy sơ cấp
 Quy trình:

 Xác định mật độ của tế bào


B. Thay môi trường

Mục tiêu: loại chất thải và cung cấp dinh dưỡng mới cho tế bào phát
triển
Quy trình:


C. Cấy truyền và đông lạnh

 Mục tiêu:
Cấy truyền:tạo không gian và cung cấp thêm dinh dưỡng cho tế bào phát triển.

Đông lạnh: bảo quản tế bào tiết kiệm môi trường nuôi cấy.
 Phương pháp:
Mẫu mượn của nhóm 8, ca 2 do mật độ tế bào của nhóm thấp không đủ để cấy
truyền. Dùng phương pháp cơ học do MSC có độ bám dính mạnh.


D. Qui trình giải đông


III. Kết quả và giải thích
A. Kết quả nuôi cấy sơ cấp

Xác định mật độ của tế bào khi nuôi sơ cấp
Nhuộm tế bào bằng trypan blue tỉ lệ 1:1 (10ul:10ul)
30 tế
bào

29 tế
bào
36 tế
bào

Hình 1: Trước nuôi sơ cấp
• Quần thể tế bào tủy xương thu được gồm
hai loại tế bào kích thước khác nhau
 có thể dự đoán đó là các tế bào bạch cầu đơn
nhân,hồng cầu hay tiểu cầu.

Độ pha loãng: 10 lần.
Mật độ tế bào:

Kết quả nuôi sơ cấp:
• Có thu được tế bào gốc trung mô
• Lượng ít
• Mật độ phân tán không đều
• Không bị nhiễm
• Môi trường chuyển màu đỏ sang
vàng cam tế bào đã sử dụng
glucose và tạo ra acid .

Hình 2: kết quả sau 3 ngày
nuôi sơ cấp
 Mật độ tế bào đếm cao nhưng lượng tế bào gốc trung mô thu
được thấp do lúc đếm mật độ có cả tế bào máu trưởng thành.


B. Kết quả thay môi trường
- Dự đoán có thể thu nhận
được tế bào gốc trung mô
• Tế bào mọc bám dính
• Hình dạng giống nguyên bào
sợi
-Không bị nhiễm

Hình 3: kết quả sau khi thay môi trường


3. Kết quả cấy truyền

Hình 4: mẫu trước cấy chuyền
Hình 5: kết quả sau khi cấy cấy
(nhóm 8, ca 2)
truyền
 Mật độ tế bào cấy chuyền thấp và phân bố không đều
do: lự cào craper yếu và huyền phù mẫu không đều


D. Kết quả sau giải đông
 Kết quả đếm tế bào:
13 c
6s

15c
8s
9c
5s

12c
11s

C: tế bào chết
S: tế bào sống

13c
5s

• Tổng số tế bào sống:30
• Tổng số tế bào chết: 53
• Tỉ lệ tế bào sống: 30/83=36.14%

Hình 6: kết quả sau khi giải đông
 hiệu suất đông lạnh là 36.14%
 Tỉ lệ tế bào chết cao có thể do sự hình thành tinh thể đá,
phá hủy cấu trúc tế bào lúc đông lạnh


Tài liệu tham khảo:
• Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc(2010). Chương 3: Nuôi cấy tế bào động vật. Công
nghệ sinh học trên Người và Động vật, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam trang 127-207
• Strecker S, Liu Y, Wang L, Rowe D, Maye P(2012). Mouse bone marrow derived
mesenchymal stem cells. Stem cells and Cancer stem cells. Vol. 6:231-245
• Nadri S, Soleimani M, Hosseni RH, Massumi M, Atashi A, Izadpanah R (2007). An
efficient method for isolation ò murine bone mesenchymal stem cells. The
international journal of development biology, 51(8): 723-9
• I Muller, S Kordowich, C Holzwarth, C Spano, G Isensee, A Staiber, S Viebahn, F
Gieseke, H Langer, MP Gawaz, EM Horwitz, P Conte, R Handgretinger and M
Dominici(2006). Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of
multipotent mesenchymal stromal cells from human BM
• Phần mềm Axio version


PHẦN 2:
THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM
( In vitro fertilization-IVF)


Nội dung:

1. Thu nhận giao tử đực và cái
2. Thụ tinh trong ống nghiệm

3. Đánh giá sự phát triển của
phôi

Mẫu vật:

Chuột nhắt trắng từ 6-8 tuần tuổi do:
• Chuột nhắt trưởng thành từ 35-42 ngày
• Con cái thì động dục khoảng 4-6 tuần, đực thì từ
tuần 5-7


LỌC DẦU KHOÁNG

1. Mục đích: loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm
Dầu khoáng dung để:
• Cố định cấu trúc vi giọt
• Ngăn sự bay hơi nước của vi giọt
• Chống nhiễm vi khuẩn
2. Nguyên tắc
• Kích thước vi khuẩn: đường kính (0.2÷2.0μm) x chiều dài
(2.0÷8.0μm) nên lọc bằng màng lọc 0.2 um bằng syringe có
thể loại bỏ hết vi sinh vật gây nhiễm
• Lọc trong môi trường vô trùng
• Hút dầu lên chậm tránh bị văng dầu và lúc nhả xuống thì
dùng lực ép mạnh để lọc
• Không được chạm vào đầu màng lọc


Tạo vi giọt

Mục đích:
• Tạo môi trường thụ tinh và nuôi phôi
Nguyên tắc:
• Thực hiện trong điều kiện vô trùng
• Tạo giọt đúng thể tích
• Không tạo bọt trong vi giọt

Kéo pipette pasteur

Mục đích: hút và chuyển trứng, phôi
Nguyên tắc:
Tùy mục đích có 2 loại : đầu lớn và đầu nhỏ
Kéo kim trên ngọn đèn cồn
Khi kéo thì đầu pipette tạo với thân 1 góc > 90⁰
Phải kéo nhanh dứt khoát


Chích chuột
1. Mục tiêu:

Gây mê chuột: giảm đau đớn cho chuột và dễ thao tác
2. Nguyên tắc:
 Vô trùng
 Bơm tiêm và các dụng cụ khác phải đảm bảo vô khuẩn.
 Khi chích cho chuột dùng cồn sát trùng vùng đùi, vuốt
ngược lên để lộ phần bắp.
 Khi hút thuốc xong chưa tiêm ngay thì phải đậy đầu kim lại.
 Tiêm đúng liều và đúng thời điểm
 Khi chích nghiêng mũi kim 45 độ chích khoảng 1/3 mũi kim
tránh tổn thương cơ quan bên trong của chuột

NGUYÊN TẮC LỰA CHON GIAO TỬ

Chọn trứng: trứng đã chín:
• Cụm cumulus xung quanh.
Trứng trưởng thành lớp cumulus sẽ mờ và tách thành nhiều tế bào
riêng lẽ
Các tế bào cumulus mở rộng,số lượng lớn đang ở metaphage I
• Thể cực thứ nhất
Có 1 thể cực xuất hiện, trứng đã trưởng thành và ở metaphage II
• Túi mầm:
Còn túi mầm: trứng chứa trưởng thành
Mất túi mầm: đã vỡ và trứng đã trưởng thành
• Trứng không phân mảnh: tăng khả năng thụ tinh

Hình 1: trứng trưởng thành


Nguyên tắc chọn tinh trùng bằng phương pháp
swim-up và nhuộm

• Mật độ tinh trùng: phải đạt từ 1-2.5x10^6 tt/ml
• Tinh trùng có độ di động cao
• Hình thái: >30% tinh trùng có hình dạng bình thường
Phương pháp swim-up:
• Tinh trùng di động tốt sẽ tự bơi lên trên, thoát khỏi lớp
tinh dịch

Nguyên tắc đánh giá phôi.

• Thụ tinh thành công khi có 2 tiền nhân và 2 thể cực
• Màng ZP dày
• Nguyên sinh chất sạch và thường có ít hạt


Kết quả

1. Thu nhận tinh trùng
• Thu được ống dẫn tinh nhưng ít tinh dịch
• Sau swim-up, đếm tế bào nhưng không có tinh trùng
Giải thích:
• Lương tinh dịch thu được quá ít, sau swim-up có thể hút phần thể tích
không chứa tinh trùng để đếm.
• Do nhóm 15 cùng làm trên 1 con chuột và thu được tinh trùng nên loại
khả năng chuột không có tinh trùng.
2. Thu nhận trứng:
• Thu được buồng trứng và ống dẫn trứng
• Không thu được trứng
Giải thích:
Khi thu đã làm đứt ống dẫn trứng nên có thể mất trứng. Cả 2 nhóm 15, 16
đều không thu được trứng có thể trứng chưa chín và rụng.