Kết quả nuôi cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng trữ lạnh sau phẫu thuật trích tinh trùng

PHỤ KHOA – NỘI TIẾT, VÔ SINH

NGUYỄN THỊ THÁI THANH, LÊ MINH TÂM, CAO NGỌC THÀNH

KẾT QUẢ NUÔI CẤY PHÔI THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM VỚI TINH TRÙNG TRỮ LẠNH
SAU PHẪU THUẬT TRÍCH TINH TRÙNG
Nguyễn Thị Thái Thanh, Lê Minh Tâm, Cao Ngọc Thành
Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế

Tóm tắt

Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá kết quả nuôi cấy phôi thụ tinh trong
ống nghiệm với tinh trùng trữ lạnh sau phẫu thuật trích tinh trùng.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu trên 27
cặp vợ chồng đến khám và điều trị tại Trung tâm Nội tiết Sinh sản
và Vô sinh – Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế (HUECREI) từ
tháng 01/2014 đến tháng 12/2015, chia làm 2 nhóm: nhóm 1 – 17
chu kỳ sử dụng tinh trùng trữ lạnh sau phẫu thuật trích tinh trùng,
nhóm 2 – 10 chu kỳ sử dụng tinh trùng tươi từ phẫu thuật.
Kết quả: Tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi phân chia, tỷ lệ phôi tốt giữa
hai nhóm sai khác không có ý nghĩa thống kê, lần lượt là nhóm
1: 67,16% ± 21,27, 72,29% ± 27,08 và 36,62% ± 19,05, nhóm 2:
92,23% ± 17,55, 78,95% ± 17,38 và 40,23% ± 16,26 (p > 0,05). Tỷ
lệ có thai lâm sàng của 2 nhóm là 27,64% và 30% (p >0,05).
Kết luận: Kết quả có thai của nhóm sử dụng tinh trùng trữ lạnh và
nhóm sử dụng tinh trùng tươi từ phẫu thuật trích tinh trùng là tương
đương nhau.

Abstract

Tập 14, số 02
Tháng 05-2016

RESULTS OF EMBRYOS CULTURE IN IVF/ICSI
USING FROZEN-THAWED SPERM FROM SURGICAL
SPERM RETRIEVAL

76

Tác giả liên hệ (Corresponding author):
Nguyễn Thị Thái Thanh,
email:
Ngày nhận bài (received): 10/03/2016
Ngày phản biện đánh giá bài báo (revised):
20/04/2016
Ngày bài báo được chấp nhận đăng
(accepted):25/04/2016

Objective: To determine the results of embryos culture using frozenthawed sperm from surgical sperm retrieval.
Methods: Prospective study on 27 ICSI cycles dividing into 2 group:
using frozen-thawed sperm group (n=17) and using fresh sperm group
(n=10) from 01/2014 to 12/2015, at the Hue Center for Reproductive
Endocrinology and Infertility.
Results: The frozen-thawed sperm group showed no statistically
significant differences from the fresh sperm group in the rate of
fertilization, cleavage, good quality embryos and clinical pregnancy


Nam giới được chẩn đoán vô tinh
(azoospermia) sau các xét nghiệm tinh dịch đồ

được ghi nhận là do thiếu vắng tinh trùng trong
tinh dịch (WHO, 2010). Nguyên nhân là bởi một
trong hai tinh hoàn thất bại việc khởi phát hoặc
duy trì sự sinh tinh vì lý do tại chỗ hoặc các bất
thường ngoại sinh (vô tinh do không tắc nghẽn)
hoặc tắc nghẽn hệ thống dẫn tinh. Vô tinh có
thể phân ra 2 loại, đó là vô tinh do tắc nghẽn
(Obstructive azoospermia: OA) và vô tinh không
do tắc nghẽn (Non-obstructive azoospermia:
NOA) (Dohle và cs, 2005; McLachlan và cs,
2007). Phương pháp chính xác phân biệt giữa
OA và NOA chính là mổ trích tinh trùng. Đây
là phương pháp đòi hỏi phải thực hiện các thủ
thuật trên tinh hoàn, mào tinh hoàn của bệnh
nhân vô tinh, nhờ đó có thể thu được tinh trùng
từ bệnh nhân.
Tinh trùng sau phẫu thuật trích ly tinh trùng
thường được trữ lạnh để sử dụng cho nhiều lần
ICSI. Việc đông lạnh tinh trùng làm giảm những
khó khăn trong công tác chuẩn bị như thực hiện
chọc hút trứng và phẫu thuật trích ly tinh trùng
trong một ngày.
Hiện tượng bệnh nhân azoospermia đôi khi
có một vài tinh trùng trưởng thành trong các
lần xuất tinh khác được coi là azoospermia ảo
(virtual azoospermia) (Tournaye và cs, 1995),
và đó là hậu quả của sự biến động sinh tinh
trong trường hợp vô tinh không do tắc nghẽn
(Bendiksin và cs, 2008). Những tinh trùng này
có thể được sử dụng để ICSI (Ron-EL và cs, 1997;

Swanton và cs, 2007). Tuy nhiên, không có biện
pháp nào đảm bảo có thể tìm ra tinh trùng trong
ngày chọc hút trứng. Khi không có tinh trùng
xuất tinh và không có tinh trùng trữ lạnh dự trữ
thì có thể thực hiện phẫu thuật trích tinh trùng.
Ngoài ra, một vài nam giới có thể có tinh trùng

chất lượng thấp và số lượng rất ít trong những
lần xuất tinh. Đây được gọi là cryptozoospermia
(WHO, 2010). Khi kết quả thụ tinh thấp hoặc
khi không có kết quả có thai sau một vài chu kỳ
với tinh trùng xuất tinh, việc sử dụng tinh trùng
từ phẫu thuật trích ly có thể là một sự lựa chọn
thay thế (Ron Hauser và cs, 2011).
Nguồn gốc tinh trùng, nguyên nhân hoặc
mức độ vô sinh nam ảnh hưởng như thế nào
đến kết quả ICSI vẫn còn là vấn đề tranh luận.
Do đó không có sự lựa chọn rõ ràng nào giữa
tinh trùng tươi và tinh trùng trữ lạnh cho ICSI
đối với các trường hợp trên. (Christian Gnoth
và cs, 2014).
Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu nghiên
cứu hiệu quả nuôi cấy phôi thụ tinh trong ống
nghiệm với tinh trùng trữ lạnh từ phẫu thuật trích
trinh trùng nhằm tìm ra biện pháp hữu hiệu đối
với bệnh nhân nam giới có khả năng sinh sản bị
suy giảm nặng.

2. Đối tượng và phương
pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo phương
pháp hồi cứu trên 27 cặp vợ chồng đến khám
và điều trị tại Trung tâm Nội tiết Sinh sản và
Vô sinh – Bệnh viện Trường Đại học Y Dược
Huế (HUECREI) từ tháng 01/2014 đến tháng
12/2015, với người chồng bị chẩn đoán là vô
tinh khi không tìm thấy tinh trùng trong mẫu tinh
dịch, và sau khi phẫu thuật trích tinh trùng tìm
thấy tinh trùng sử dụng cho ICSI.
Thủ thuật được tiến hành tuần tự theo các
phương pháp TESA (testicular sperm aspiration):
sử dụng kim cánh én chọc vào tinh hoàn, sau đó
hút dịch và mô tinh hoàn dưới áp lực âm, PESA
(percutaneous epidymal sperm aspiration)
tương tự như TESA, sử dụng kim én chọc và hút
dịch ở mào tinh hoàn, TESE (testicular sperm

Tập 14, số 02
Tháng 05-2016

1. Giới thiệu

TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 14(02), 76 - 80, 2016

(67,16% ± 21,27, 72,29% ± 27,08, 36,62% ± 19,05 and 27,64% vs 92,23% ± 17,55, 78,95% ± 17,38,
40,23% ± 16,26 and 30%, respectively) (p > 0,05).
Conclusion: No differences existed between the use of fresh and frozen spermatozoa.

77

Tập 14, số 02
Tháng 05-2016

PHỤ KHOA – NỘI TIẾT, VÔ SINH

NGUYỄN THỊ THÁI THANH, LÊ MINH TÂM, CAO NGỌC THÀNH

78

extraction) phẫu thuật sinh thiết tinh hoàn.
Mẫu trích tinh trùng sẽ được gởi qua phòng
lab để được xử lí, tìm tinh trùng. Tiến hành
dừng thủ thuật khi phát hiện được tinh trùng
trong mẫu trích.
Tinh trùng sau trích ly được trữ lạnh với môi
trường Sperm Freeze (Vitrolife, Thụy Điển) và
rã đông, xử lý vào ngày chọc hút trứng của
người vợ. Vào ngày đó, người vợ được chọc
hút trứng sau khi kích thích buồng trứng. Phức
hợp trứng-tế bào hạt thu được sẽ được nuôi cấy
trong G-IVF plus (Vitrolife, Thụy Điển), sau đó
xử lý với Hyase 10X (Vitrolife, Thụy Điển). Quy
trình tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (intra
cytoplasmic sperm injection – ICSI) được thực
hiện như quy trình thường quy chuẩn. Trứng sau
đó được nuôi cấy đơn trong G1 plus (Vitrolife,
Thụy Điển) ở tủ nuôi cấy Galaxy 170S 370C,
8% O2, 5% CO2. Đánh giá phôi ngày 3 theo

tiêu chuẩn của Scott (2003) vào 66-68 giờ sau
ICSI như sau: (1) Phôi tốt (loại I): phôi 6-8 tế
bào, <10% mảnh vỡ, kích thước đồng đều, phôi
bào đối xứng; (2) Phôi khá (loại II): phôi 6-8
tế bào, 10-20% mảnh vỡ, kích thước đồng đều
hoặc không, phôi bào đối xứng hoặc không;
(3) Phôi xấu (loại III): số lượng phôi bào không
phải 6-8, >20% mảnh vỡ, kích thước không
đều, phôi bào không đối xứng.
2-3 phôi tốt được lựa chọn để chuyển phôi
vào ngày 3. Các phôi còn lại được trữ bằng
môi trường đông phôi (Kitazato, Nhật Bản) sử
dụng cho các chu kỳ chuyển phôi trữ.
Kết quả chính là tỷ lệ beta-hCG, tỷ lệ thai
lâm sàng. Thử thai thực hiện vào 14 ngày sau
khi chọc hút trứng, beta-hCG > 5 mIU/ml được
xem là dương tính. Tỷ lệ thai lâm sàng (clinical
pregnancy rate) được tính bằng tỷ lệ phần trăm
các trường hợp có thai lâm sàng trên tổng số
các trường hợp chuyển phôi. Thai lâm sàng
được ghi nhận khi xác định được hình ảnh túi
thai và đo được tim thai vào khoảng 3 tuần sau
khi có xét nghiệm beta-hCG dương tính. Tỷ lệ
đa thai bằng tỷ lệ phần trăm các trường hợp đa
thai trên tổng số trường hợp có thai lâm sàng.
Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 16.0
(Mỹ) với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi
p-value < 0.05

3. Kết quả

Từ tháng 01/2014 đến tháng 12/2015,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu 27 chu kỳ nuôi
cấy phôi với tinh trùng từ phẫu thuật trích tinh
trùng trong đó bao gồm 17 chu kỳ sử dụng tinh
trùng trữ lạnh (nhóm 1) và 10 chu kỳ sử dụng tinh
trùng tươi (nhóm 2).
Bảng 1. Đặc điểm bệnh nhân
Đặc điểm
Tuổi trung bình người vợ
Thời gian vô sinh (năm)
Nguyên nhân vô sinh
- Do yếu tố chồng
- Suy buồng trứng sớm
- Buồng trứng đa nang
- Vòi tử cung
- U xơ tử cung
- Lạc nội mạc tử cung

Nhóm 1
33,12 ± 5,32
3,82 ± 3,24

Nhóm 2
35 ± 5,93
5,9 ± 4,18

17
3
3

0
0
1

10
1
1
1
1
1

p value
p >0,05
p >0,05

Bảng 2. Các thông số kết quả nuôi cấy phôi
Nhóm 1
Số trứng thu được
11,24 ± 7,69
Số trứng trưởng thành
9,35 ± 6,56
Tỷ lệ thụ tinh (%)
67,16 ± 21,27
Tỷ lệ phôi phân chia (%)
72,29 ± 27,08
Tỷ lệ phôi tốt
36,62 ± 19,05

Nhóm 2
9,4 ± 8,13

7,6 ± 6,33
92,23 ± 17,55
78,95 ± 17,38
40,23 ± 16,26

p value
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05

Bảng 3. Kết quả có thai của các chu kỳ chuyển phôi
Nhóm 1
Beta-hCG (+)
27,64%
Thai lâm sàng
27,64%

Nhóm 2
30%
30%

p value
p>0,05
p>0,05

4. Thảo luận

Trong 27 chu kỳ ICSI với tinh trùng từ phẫu

thuật trích tinh trùng tại Trung tâm chúng tôi, có
17 chu kỳ sử dụng tinh trùng đông lạnh và 10
chu kỳ sử dụng tinh trùng tươi.
Đặc điểm bệnh nhân của 2 nhóm được thống
kê ở bảng 1. Chúng tôi nhận thấy rằng không
có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nhóm ở độ tuổi
người vợ, 33 tuổi và 35 tuổi tương ứng với nhóm
1 và nhóm 2, tương tự với đặc điểm nhóm nghiên
cứu của Ron Hauser và cs (2011) là 34 tuổi. Độ
tuổi trung bình người vợ của nghiên cứu này
khá cao, có trường hợp bệnh nhân trên 40 tuổi.
Tuổi của người vợ là một yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến kết quả nuôi cấy phôi. Độ tuổi thích
hợp để thực hiện ICSI là dưới 35 tuổi. Đối với phụ
nữ ngoài 40, mặc dù sử dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh
sản tối ưu thì vẫn chỉ có khoảng dưới 20% cho
kết quả có thai (Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ,


nghiên cứu 114 bệnh nhân nam và các ca có
thai lâm sàng đều nằm trong nhóm bệnh nhân
nữ có độ tuổi trung bình thấp 31,7 tuổi. Theo
báo cáo của Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ
(2008), tỷ lệ có thai lâm sàng đối với tinh trùng
nguồn gốc từ phẫu thuật nằm trong khoảng 2657%. Ở nhiều Trung tâm, kết quả có thai lâm
sàng 30-40% là con số có thể mong đợi. Có một
số nghiên cứu khi sử dụng tinh trùng từ phẫu
thuật trích ly tinh trùng lại cho kết quả có thai
rất cao. Fischer và cs (2011) đã báo cáo kết
quả có thai đạt trên 60% trong cả 2 nhóm. Tỷ lệ

này trong nghiên cứu của Jansen và cs (2000)
của 2 nhóm lần lượt là 60,6% và 66,7%. Ngược
lại, Kalsi và cs (2011) khi so sánh hiệu quả ICSI
với mẫu tinh trùng rã đông và tinh trùng tươi thì
cho kết quả có thai của nhóm 1 cao hơn (60%
so với 32,1%).
Kết quả nuôi cấy phôi và có thai của nhóm
sử dụng tinh trùng từ mẫu tươi tốt hơn do
những tác động bất lợi của quy trình trữ lạnh
và rã đông tinh trùng đến độ di động, những
tổn thương của nhiễm sắc thể, hình thái học
và phản ứng cực đầu của tinh trùng. O’Connel
và cs (2002) đưa ra các ảnh hưởng đến hình
dạng và chức năng của ty thể, đồng thời khả
năng sống của tinh trùng rã đông cũng giảm.
Độ di động của tinh trùng cũng giảm 25% sau
khi rã đông (Prabakaran và cs, 2006). Theo
Nicopoullos và cs (2004), đối với mẫu tinh
trùng có nguồn gốc tinh hoàn, tỷ lệ thụ tinh
không có sự khác biệt giữa hai nhóm nhưng tỷ
lệ làm tổ bị ảnh hưởng đáng kể khi dùng tinh
trùng trữ lạnh. Tuy nhiên, sử dụng tinh trùng trữ
lạnh có thuận lợi trong việc đảm bảo có tinh
trùng trong ngày chọc hút trứng và với một lần
phẫu thuật có thể trữ lạnh tinh trùng dùng cho
nhiều lần ICSI về sau.

TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 14(02), 76 - 80, 2016

5. Kết luận

- Kết quả nuôi cấy phôi với tinh trùng trữ
lạnh từ phẫu thuật trích tinh trùng tương đương
đối với tinh trùng mẫu tươi từ phẫu thuật.
- Nguồn gốc tinh trùng (từ mẫu trữ lạnh và
mẫu tươi) đóng vai trò không đáng kể đến kết
quả nuôi cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm.

Tập 14, số 02
Tháng 05-2016

2008). Ở các cặp vợ chồng trong nghiên cứu,
yếu tố vô sinh không chỉ xuất phát từ chồng mà
còn do một trong các nguyên nhân khác liên
quan đến người vợ bao gồm: suy buồng trứng
sớm, buồng trứng đa nang, vòi tử cung, u xơ tử
cung và lạc nội mạc tử cung. Thời gian vô sinh
của nhóm 1 và nhóm 2 lần lượt là 3,82 ± 3,24
và 5,9±4,18 năm.
Số trứng thu được trung bình của 2 nhóm
lần lượt là 11,24 và 9,4. Nhóm 2 có số trứng
thu được thấp hơn, tuy nhiên sự khác biệt này
không có ý nghĩa thống kê. Số trứng trưởng
thành giữa hai nhóm nghiên cứu không có sự
khác biệt đáng kể, nhóm 1 có 9,35±6,56 trứng
MII và nhóm 2 có 7,6±6,33 trứng.
Tỷ lệ thụ tinh của nhóm sử dụng tinh trùng
trữ lạnh là 67,16% ± 21,27 và thấp hơn nhiều
so với nhóm sử dụng tinh trùng tươi (92,23% ±
17,55). Tuy tỷ lệ thụ tinh của nhóm 2 rất cao

nhưng sự khác biệt giữa 2 nhóm không có ý
nghĩa thống kê do cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ.
Trong khi đó, Fischer và cs (2011) lại chỉ ra sự
khác biệt không lớn giữa 2 nhóm (61% và 75%).
Kết quả tỷ lệ phôi phân chia trong nghiên cứu
này đối với nhóm 1 là 72,29% ± 27,08 và nhóm
2 là 78,95% ± 17,38. Mặc dù tỷ lệ thụ tinh của
nhóm 2 cao hơn nhóm 1 nhưng tỷ lệ phôi phân
chia của 2 nhóm lại xấp xỉ nhau. Trong khi đó,
nghiên cứu của Ron Hauser và cs (2011) cho
kết quả thấp hơn, lần lượt là 62,6% và 54,3%.
Tuy tỷ lệ phôi phân chia khá cao nhưng tỷ lệ
phôi tốt trong cả 2 nhóm đều thấp, tương ứng là
36,62% ± 19,05 và 40,23% ± 16,26, chứng tỏ
chất lượng phôi khi ICSI với tinh trùng từ phẫu
thuật trích tinh trùng không cao so với tinh trùng
bình thường từ xuất tinh.
Nhóm sử dụng tinh trùng đông lạnh cho kết
quả 27,64% có thai, trong khi đó, nhóm ICSI
với tinh trùng tươi cho kết quả có thai cao hơn
là 30%. Tuy nhiên sự sai khác này không có
ý nghĩa thống kê. Trong nghiên cứu của Ron
Hauser và cs (2011), nhóm 1 cho tỷ lệ có thai
thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của chúng
tôi (12,8%), nhóm 2 có tỷ lệ có thai cao hơn
(42,9%). Tỷ lệ có thai thấp ở nhóm 2 cũng được
Botelho và cs báo cáo năm 2011 (19,29%) khi

79

Tập 14, số 02
Tháng 05-2016

PHỤ KHOA – NỘI TIẾT, VÔ SINH

NGUYỄN THỊ THÁI THANH, LÊ MINH TÂM, CAO NGỌC THÀNH

80

Tài liệu tham khảo

Christian Gnoth, Vitaly Markhinin, Beatrice Maxrath, Therese
Skonieczny, Kerstin Friol, Judith Roos, Gohar Rahimi, Erhard Godehardt
(2014), Impact of sperm cell source on the results of intracytoplasmic
sperm injection, Springer ISSN 0932-0067.
Bendikson KA, Neri OV, Takeuchi T, Tosch M, Schlegel PN,
Rosenwacks Z, Palermo GD (2008), The outcome of intracytoplasmic
sperm injection using occasional spermatozoa in the ejaculate of men
with spermatogenic failure, J Urol 180:1060–1064.
Botelho F, Figueiredo L, Leite R, Carvalho A, Tomada N, Vendeira P
(2011), Which Men Have More Likelihood of Success with a Testicular
Biopsy?, J Urol 78.
Dohle GR, Colpi GM, Hargreave TB, Papp GK, Jungwirth A, Weidner
W (2005), EAU Guidelines on male infertility, Eur Urol 48:703–711.
Fischer M, Kovac J (2011), VF Using Surgically Obtained
Spermatozoa May Be Preferred as the Primary Treatment Modality in
Cases of Obstructive Azoospermia, J Urol 78.
Janzen N, Goldstein M, Schlegel PN, Palermo GD, Rosenwaks Z
(2000), Use of electively cryopreserved microsurgically aspirated

epididymal sperm with IVF and intracytoplasmic sperm injection for
obstructive azoospermia, Fertil Steril 74(4):696–701.
Kalsi J, Thum MY, Muneer A, Pryor J, Abdullah H, Minhas S (2011),
Analysis of the outcome of intracytoplasmic sperm injection using fresh
or frozen sperm, BJU Int.107(7):1124–8.
McLachlan RI, Rajpert-De Meyts E, Hoei-Hansen CE, de Kretser
DM, Skakkebaek NE (2007), Histological evaluation of the human testis
– approaches to optimizing the clinical value of the assessment: mini
review, Hum
Reprod 22:2–16.
Nicopoullos JDM, Gilling-Smith C, Almeida PA, Norman-Taylor

J, Grace I, Ramsay JWA (2004), Use of surgical sperm retrieval in
azoospermic men: a meta-analysis, Fertil Steril 82(3):691–701.
O’Connell M, McClure N, Lewis SE (2002), The effects of
cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial
function, Hum Reprod 17(3):704–9.
Practice Committee of the American Society for Reproductive
Medicine in collaboration with the Society for Male Reproduction and
Urology (2008), The management of infertility due to obstructive
azoospermia, Fertil Steril 90(Suppl(3)):S121–4.
Prabakaran SA, Agarwal A, Sundaram A, Thomas AJ, Jr, Sikka
S (2006), Cryosurvival of testicular spermatozoa from obstructive
azoospermic patients: The Cleveland Clinic Experience, Fertil Steril
86(6):1789–91
Ron Hauser, Guy Bibi, Leah Yogev, Ariella Carmon, Foad Azem,
Amnon Botchan, Haim Yavetz, Sandra e. Klieman, Ofer Lehavi, Ami amit,
Dalit Ben-Yosef (2011), Virtual Azoospermia and Cryptozoospermia—
Fresh/Frozen Testicular or Ejaculate Sperm for Better IVF Outcome?,
Journal of Andronoly 32(5):484-490.
Ron-El R, Strassburger D, Friedler S, Komarovski D, Bern O,

Soffer Y, Raziel A (1997), Extended sperm preparation: an alternative
to testicular sperm extraction in non-obstructive azoospermia, Hum
Reprod 12:1222–1226.
Swanton A, Itani A, McVeigh E, Child T (2007), Azoospermia: is
sample centrifugation indicated? A national survey of practice and the
Oxford experience, Fertil Steril 88:374–378.
Tournaye H, Camus M, Goossens A, Liu J, Nagy P, Silber S,
Van Steirteghem AC, Devroey P (1995), Recent concepts in the
management of infertility because of non-obstructive azoospermia, Hum
Reprod 10:115–119.