THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA GIÁO DỤC THỂ CHẤT


BÁO CÁO

THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC PHẨM
GVHD: ThS. LÊ TẤN HOÀNG
Lớp: PFBC312850_03.
Thứ 3: Tiết 1-11.
NHÓM THỰC HIỆN: Nhóm 4.
NĂM HỌC: 2018-2019.

TP Hồ Chí Minh – 9/2018

Page 19


Nhóm 4

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Hoàng Ngọc Thương
Hà Thị Trinh
Trần Lê Tri

Đỗ Duy Tùng
Nguyễn Thị Yến
Trương Thị Thu

16116179
16116187
ĐIỂM

16116186
16116191
16116200
16116176

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
………....
Mục Lục

Danh mục hình

Page 19


Danh mục bảng

Bài thí nghiệm số 1
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO
PHƯƠNG PHÁP WOLHGEMUTH
1.Tóm tắt thí nghiệm
1.1 Nguuyên tắc

Page 19


Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến
dextrin. Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1 mg tinh
bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa.
1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất
- 11 ống nghiệm đánh số từ 1 11
- Dung dịch NaCl 0,55̀%: Cân 1.08g NaCl cho vào bình định mức 100ml. thêm 50ml nước
cất, lắc đều rồi định mức đủ 100ml.
- Dung dịch H2SO4 10%: Dùng bình định mức 50ml cho khảng 30ml nước cất xong dùng
pipep lấy 5.21 ml dung dịch H2SO4 10% vào bình định mức sau đó định mức đủ 50ml.
- Tinh bột 0.5%: cân 0.5g tinh bột pha với 100ml nước cất, đun nóng,khuấy đều cho dung
dịch từ trắng đục sang trong suốt.
- Iodine 0,3% trong KI 3%: cân 0.3g Iodine và 3g KI sau đó định mức đủ 100ml.

1.3 Trình tự thí nghiệm
1.3.1 Chuẩn bị dịch chiết amylase
Cân 10 gam Malt

Xay cả vỏ, định
mức 100ml, lắc kĩ

Ngâm 15 phút, lắc
đều

Dịch chiết enzyme amylase

Lọc 2 lần bằng giấy
lọc

1.3.2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase
Chuẩn bị môi trường chứa chất hoạt hoá ClCho mào mỗi ống nghiệm 1ml NaCl-đã pha

Pha loãng dung dịch enzyme Amylase
Cho vào ống nghiệm số 1 1ml, lắc đều. Chuyển 1ml dung dịch ống nghiệm 1 sang
ống nghiệm 2, lắc đều. tương tự tới ống nghiệm số 10 bỏ đi 1 ml.

Page 19


Cho cơ chất tác dụng với enzyme
Ở mỗi ống nghiệm từ 110 cho 1ml tinh bột. đem ủ ở 37oC trong 30 phút

Bất hoạt enzyme, cho Iodine làm chỉ thị màu
Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml H2SO4 10%, hai giọt Iodine trong KI, lắc đều

Kết quả
Quan sát, ghi nhận kết quả, tiến hành tính toán

1.3.2 Giải thích mục đích các bước thực hiện
• Chuẩn bị môi trường hoạt hoá: Ion Cl- là chất hoạt hoá của enzyme amylase. Khi
hoà tan NaCl vào nước sẽ phân li ra ion Cl - . Cl- làm thay đổi trung tâm hoạt động

•

cho phù hợp với cơ chất gắn vào dễ dàng hơn.
Pha loãng dịch chiết enzyme: Tìm nồng độ pha loãng enzyme mà tại đó enzyme

•

không thuỷ phân được hoàn toàn tinh bột.
Bất hoạt enzyme, iodine chỉ thị màu: Thay đổi pH của môi trường làm cho enzyme
Amylase bị biến tính bất thuận nghịch. Giúp quá trình quan sát kết quả chính xác
hơn. Iodine được thêm vào để xác nhận trong dung dịch có còn tinh bột hay không.

2. Kết quả thí nghiệm
♦ Tính lượng enzyme Amylase cho vào ống nghiệm

Trong đó:
V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)
V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml )
m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (10000mg)

Page 19


2.1 Khảo sát hoạt độ enzyme ở 37oC trong 30 phút.
Hình 1: Kết quả khảo sát ở 37oC trong 30 phút

Bảng 1: Kết quả thu được ở 370c
Số ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Độ pha loãng

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

V

V

V

V

X

X

X

X

X

X

Nồng độ
enzyme
Màu

♦ Một đơn vị Wohlgemuth
Trong đó :
F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn
tinh bột (ống nghiệm số 4 có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
♦ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):

♦Nhận xét kết quả thu được:
Page 19


- Ở ống nghiệm số 1,2,3,4 thì xuất hiện màu vàng là do tinh bột đã bị enzyme
amylase thuỷ phân, nên khi ta thêm dung dịch Iodine vào thì chỉ thấy màu vàng của dung
dịch Iodine trong KI.
- Ống nghiệm số 5,6,7,8,9,10 xuất hiện màu xanh đen do trong dung dịch còn tinh
bột, bao lấy Iodine tạo phức xanh đen. Điều đó chứng tỏ khi pha loãng tới nồng độ n/32 thì
enzyme đã không còn thuỷ phân hoàn toàn được tinh bột.
- Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) thì ta thấy màu sắc của ống
kiểm chứng trùng với màu của ống nghiệm số 4.

2.2 Khảo sát hoạt độ enzyme Amylase ở 47oC trong 30 phút

o ở 47 oC trong 30 phút
2: Kết
quảsátkhảo
Hình 2:Hình
Kết quả
khảo
ở 47sát
C trong 30 phút

Bảng 2: Kết quả thu được ở 470c
Số ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Độ pha loãng

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

V

V

V

V

N

X

X

X

X

X

Nồng độ enzyme
Màu

Page 19


♦ Một đơn vị Wohlgemuth
Trong đó :
F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh
bột (ống nghiệm số 4 có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
♦ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):

♦ Nhận xét kết quả
Ở ống nghiệm số 1,2,3,4 thì xuất hiện màu vàng là do tinh bột đã bị enzyme
amylase thuỷ phân, nên khi ta thêm dung dịch Iodine vào thì chỉ thấy màu vàng của dung
dịch Iodine trong KI.

Ống nghiệm số 5 có màu nâu đỏ là vì lượng tinh bột còn lại ít. Do vậy enzyme đã
thuỷ phân tinh bột và còn lại một phân chưa thuỷ phân.
Ống nghiệm số 6,7,8,9,10 xuất hiện màu xanh đen do trong dung dịch còn tinh bột,
bao lấy Iodine nên tạo phức xanh đen. Điều đó chứng tỏ khi pha loãng tới nồng độ n/32 thì
enzyme đã không còn thuỷ phân hoàn toàn được tinh bột.
Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) thì ta thấy màu sắc của ống
kiểm chứng trùng với màu của ống nghiệm số 4.
3. Bàn luận và câu hỏi mở rộng
3.1 Bàn luận về kết quả
Theo kết quả thực hiện hai thí nghiệm thì ta nhận thấy rằng khi ở nhiệt độ 47 oC thì
enzyme Amylase hoạt động mạnh hơn ở 37 oC điều này có thể giải thích bởi các nguyên
nhân sau:
Page 19


- Khi nằm trong khoảng nhiệt độ tối ưu của enzyme Amylase thì hoạt độ của enzyme tăng
theo nhiệt độ, tới một giới hạn thì enzyme Amylase không tăng được nữa và nếu cứ tăng
nhiệt độ enzyme sẽ bị biến tính và không phục hồi được( biến tính bất thuận nghịch).
- Nguyên nhân thứ 2 có thể do khi ta dùng acid H2SO4 để thay đổi pH nhằm bất hoạt
enzyme, có thể acid cũng làm tinh bột thuỷ phân khi có xúc tác nhiệt độ. Do vậy kết quả
thu được ở thí nghiệm sau không đáng tin cậy.
3.1.1 Các nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả
- Quá trình pha hoá chất ( cân, đong, tính lượng chất tan) làm kết quả không chính xác,
có thể mắc sai số.
- Do thao tác thực hiện sai sót dẫn đến kết qảu mắc sai số.
- Do thiết bị phòng thí nghiệm có thể quá cũ dẫn đến sai số. ví dụ như không đảm bảo
đủ nhiệt độ 37oC hay 47oC trong thời gian 30 phút. Gây nên sai số.
3.1.2 Cách khắc phục sai số
- Cần xác định rõ chất nào cần định lượng, tiến hành pha hoá chất thật chính xác
- Thao tác thí nghiệm cẩn thận, chính xác.

- Kiểm tra các dụng cụ, thiết bị trước khi thực hiện.

3.2 Câu hỏi mở rộng
1. Nêu các điều kiện hoạt động tối ưu của 3 loại Alpha-amylase có nguồn gốc khác
nhau.
Alpha-amylase từ nấm men Cryptococcus flavus: pH tối ưu 5.5, nhiệt độ tối ưu
50°C (Kenya J. Wanderley,2004).
Alpha-amylase từ cây rum (Carthamus tinctorius L.): pH tối ưu 6, nhiệt độ tối ưu
55°C, chất hoạt hóa Ca2+ (Mosbah Ben Elarbi, 2009).
Alpha-amylase từ hạt đậu tương nảy mầm (Glycine max): pH tối ưu 5.5, nhiệt độ
tối ưu 70°C (Arpana Kumari,2010)..
2.Nêu tất cả sản phẩm thủy phân thu được khi thủy phân tinh bột bằng enzyme các loại
amylase sau:
a. Alpha
b. Beta
c. Gamma
Page 19


Alpha Amylase thủy phân tinh bột cắt liên kết 1,4-alpha-glucoside một cách ngẫu
nhiên nên phần lớn sản phẩm tạo ra là dextrin và maltose dextrin. Và sau thời gian dài
lượng dextrin sẽ bị thủy phân tiếp tạo maltose, glucose.
Beta Amylase thủy phân tinh bột tạo maltose và β-dextrin.
Gamma Amylase thủy phân tinh bột tạo glucose.
3. Nêu những loại enzyme có trong malt, cơ chất và hàm lượng của chúng.
Malt là các loại hạt ngũ cốc nảy mầm: malt đại mạch, malt thóc, malt ngô…Enzyme
trong malt phần lớn là alpha-amylases, beta-amylases, proteases. Ngoài ra còn một số
enzyme như beta-glucanases, hemicellulases và lipases.
- Amylases: cơ chất là tinh bột, hàm lượng amylase trong malt là
- beta-glucanases: cơ chất cơ chất là beta-glucan

- Proteases: cơ chất là protein, hàm lượng amylase trong malt là
- Hemicellulases: cơ chất là Hemicellulose
- Lipase: cơ chất là lipide
4.Nêu các giai đoạn của quá trình dextrin hóa.
Tinh bột
alpha-amylase
dextrin phân tử lượng thấp

Bài thí nghiệm số 2
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME LIPASE
1. Tóm tắt thí nghiệm
1.1 Nguyên tắc
Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo. Hàm lượng
acid được chuẩn độ bằng kiềm. Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid
mới được hình thành. Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng
enzyme.
1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
-Cối chày sứ, erlen 10ml, pippet 1ml,10mlống đong, burret, cốc 100ml, 250ml, tủ
ấm.

Page 19


-Đệm acetate pH=4,7 ( trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1). Đệm
có tác dụng ổn định PH trong dung dịch để quá trình chuẩn độ diễn ra dễ dàng.
-Cồn 96o để gây biến tính protein và làm enzyme ngưng hoạt động sau khi đem ra
khỏi máy lắc.
-Toluen là dung môi để hòa tan cơ chất.
-

Ether ethylic là dung môi để phân tán chất chuẩn độ để chuẩn độ được hiệu quả

hơn.
-NaOH 0,1N là chất chuẩn độ để trung hòa acid.
-Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml
nước cất. Là chất chỉ thị để nhận biết NaOH dư.
-Dầu đậu nành tinh khiết là cơ chất cho enzyme thủy phân.
1.3 Trình tự thí nghiệm
-Cân 5.0 g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ. Chuyển vào erlen, thêm
10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30oC.
-Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọt
toluene, lắc đều hỗn hợp ở 30oC trong 24 giờ.
-Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96 o và 15ml ether, lắc đều
và để yên 2 phút. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1%.
-Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải được đun
cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào.
2. Kết quả và giải thích
-Sau khi đem bình dung dịch và bình kiểm chứng ra khỏi máy lắc. Thêm 25ml cồn
96° và 15ml ether lắc đều để trong 2 phút quan sát : màu của 2 bình đều giống nhau và có
màu trắng đục. Lúc này trong bình thí nghiệm acid béo tự do đã được sinh ra.

Page 19


-Tiến hành

Hình 3: kết quả sau khi chuẩn độ

chuẩn độ với NaOH 0,1N có
chỉ thị phenolphtalein 1% cho đến khi dung dịch bắt đầu chuyển qua màu hồng nhạt. Sự

chuyển màu này là do dung dịch có enzyme lipase sẽ thủy phân lipid trong dầu đậu nành
thành các acid béo. Ban đầu NaOH sẽ phản ứng với acid để trung hòa dung dịch. Sau đó
NaOH dư tác dụng với chỉ thị làm dung dịch chuyển sang màu hồng.

Hình 4: Dung dịch sau khi chuẩn độ

Hình 5: Màu của 2 dung dịch trước và sau
chuẩn độ

Page 19


Bảng 3: Kết quả thu được sau khi chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0.1N
Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

17,1ml

Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm chứng

8,4ml

 Bình kiểm chứng có lượng NaOH thấp hơn là do dịch chiết enzyme đã được đun cách thủy
nên bị bất hoạt do đó lượng acid béo được sinh ra từ quá trình thủy phân rất ít nên cần ít
lượng kiềm để trung hòa, dung dịch dễ chuyển sang màu hồng nhanh hơn.
-Hoạt độ của lipase (X) được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ
lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ:

X
với a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm
b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N (k=1)
m: khối lượng hạt sử dụng


Vậy hoạt độ của enzyme lipase là 17,4.
=>Ta thấy được hoạt độ enzyme lipase là khá cao, qua đó thấy được rằng khả năng
xúc tác(cường độ xúc tác) để phân giải chất béo của enzyme lipase cũng cao, cao hơn
nhiều loại enzyme khác.
- Kết quả của thí nghiệm cũng dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố như:
+ Qúa trình nghiền đậu nành không được mịn.
+Dầu đậu nành làm cơ chất không tinh khiết do mua ở ngoài cũng ảnh hưởng
đến việc xúc tác của enzyme.
+Do hệ thống cân có thể bị sai lệch trong quá trình cân làm thí nghiệm chưa
chính xác dẫn đến nồng độ pha có thể bị xê dịch.

Page 19


+Do thao tác của người tiến hành thí nghiệm chưa chuẩn xác, gây sai số.
+Do chuẩn bị chưa kĩ càng nên chỉ để dịch chiết có enzyme thủy phân cơ chất
trong vòng khoảng 7 tiếng, gây ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.
+Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH chỉ lấy tương đối chưa hoàn toàn chính xác.

Bài thí nghiệm số 3
KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME INVERTASE

1.Tóm tắt thí nghiệm
1.1 Nguyên tắc
Invertase là enzyme thủy phân đường saccharose thành glucose và fructose. Có thể xác
định hoạt độ enzyme invertase thông qua lượng glucose được tạo ra. Iodine có khả năng

oxi hóa glucose trong môi trường kiềm. Sau đó, lượng glucose sinh ra sẽ được xác định
bằng cách định phân iodine dư bằng dung dịch Na2S2O3.
1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

− Saccharose 10%: Cân 10g Saccharose pha trong bình định mức 100mL, thêm nước đến
vạch định mức. Saccarose là cơ chất cho phản ứng.
− NaOH 0.1N: hòa tan 4g NaOH cho đủ 1000 ml bằng nước cất; NaOH giúp tạo môi trường
kiềm để Iodine oxy hóa glucose
− Iodine 0.1N: cân 4g KI hòa tan với 10ml nước cất trong bình cầu 100ml. Cân 1.27g I 2 cho
vào bình cầu trên và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 2 giọt HCl 37%. Định mức
cho đủ 100ml bằng nước cất.

− H2SO4 1N: hòa tan 2.27 ml H2SO4 96% cho đủ 100ml bằng nước cất;
− Hồ tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột với 100ml nước cất. Đun cách thủy trong 15 phút.
− Dung dịch Na2S2O3 0.05N: cân 12.5g Na2S2O3.5H2O cho đủ trong nước cất cho đủ 1000ml.
1.3 Trình tự thí nghiệm

a. Điều chế dung dịch invertase: Cân 1g men bánh mì, hòa tan với 50ml nước cất, cho vào
bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc.
b.Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

Page 19


Bảng 4: Chuẩn bị các ống nghiệm như sau.
Số ống

1

2

3

Dung dịch saccharose 10% (ml)

0

2

2

Nước cất (ml)

2

0

0

Dịch enzyme (ml)

2

2

0

Dịch enzyme đã đun cách thủy (ml)

0

0

2

Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong chính xác 30 phút sau đó đem đi cách
thủy 10 phút. Sau đó Ở từng ống nghiệm, hút ra 1ml hỗn hợp dung dịch cho vào một bình
tam giác 100ml để xác định hàm lượng glucose.
Xác định glucose: cho vào mỗi bình tam giác 2 ml dung dịch iodine 0,1N và nhỏ
chậm 3 ml NaOH 0,1N sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút. Để yên trong bóng
tối 20 phút. Lấy ra cho thêm 1ml H 2SO4 1N. Định phân lượng iodine thêm thừa bằng
Na2S2O3 0.05N có hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị.
Lặp lại các bước thí nghiệm 3 lần.

2.Kết quả thí nghiệm và giải thích
Bảng 5: Kết quả dùng Na2S2O3 dùng để chuẩn độ I2 dư trong thí nghiệm xác định
hoạt độ của dung dịch invertase
Ống nghiệm

1

2

3

Số ml dung dịch
Na2S2O3 dùng để
định phân

7.0

3.5

6.8

3.8
3.65

Page 19


Hình 6: Kết quả chuẩn độ I2 dư bằng Na2S2O3 trong thí nghiệm xác địn hoạt độ enzyme
invertase
Hoạt độ của enzyme invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân
bởi lượng enzyme có trong 1g men bánh mì trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
a invertase = (V1 - V2) × A × B/( 1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

Trong đó:
V1: số ml dung dịch dùng để định phân trong ống nghiệm 1
V2: là số ml dung dịch dùng để định phân trong ống nghiệm 2
A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm
B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m(g) men bánh mì (ml)
a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)

Page 19


b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml)
t: thời gian thủy phân (phút)

Như vậy, hoạt độ của enzyme invertase được xác định trong thí nghiệm này là

a = () × 4 × 100/(1000 × 20 × 2 × 1 × 2 × 30 × 1) =5.58 × 10-4

Vậy hoạt độ của enzyme invertase là 5.58 × 10-4 mol saccarose bị thủy phân bởi
100ml enzyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phòng.
Giải thích kết quả
Thí nghiệm được thực hiện dựa trên những phản ứng hóa học sau:
invertase
Saccharose

α-glucose + β- fructose

Trong môi trường kiềm, Iodine tác dụng với NaOH tạo thành NaOI và NaI. NaOI sẽ
tác dụng với glucose (tạo thành do quá trình thủy phân bằng invertase) tạo thành acid
gluconic và NaI.
I2 + NaOH = NaOI + NaI + H2O
NaOI + CH2OH-(CHOH)4-CHO = NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH
(Glucose)

(Acid gluconic)

Sau đó, cho dung dịch H2SO4 vào ta thu hồi được lượng I 2 dư sau khi đã xảy ra quá
trình oxi hóa glucose.
2NaOI + 2NaI + 2H2SO4 = I2 + 2Na2SO4 +2H2O

Page 19


Lúc này, hỗn hợp dung dịch trong bình tam giác có màu vàng của I2 dư. Sau khi

cho hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị, dung dịch trong bình tam giác có màu xanh đen của
phức iodine- hồ tinh bột
Dung dịch Na2S2O3 được dùng để chuẩn độ lượng I2 dư đến khi màu xanh đen trở
thành không màu
2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 +2 NaI.
Trong ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme nên toàn bộ lượng Iodine
cho vào sẽ được Na2S2O3 chuẩn độ. Vì vậy, số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ là nhiều nhất.
Tỉ lệ chuyển hóa của saccharose nhờ enzyme invertase tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng để
tránh biến tính, nhiệt độ được cố định từ 50 0c đến 550c (Monsan và cộng sự. 1984) nên
trong thí nghiệm này ta đun cách thủy 10 phút làm bất hoạt enzyme. Vì vậy, trong ống
nghiệm số 3 saccharose 10% hầu như không bị thủy phân bởi dịch enzyme được đun cách
thủy 10 phút nên glucose cũng không được tạo ra.
Ở ống nghiệm số 2, enzyme invertase hoạt động giúp thủy phân saccharose tạo
thành glucose và fructose và xảy ra đầy đủ các phản ứng nên lượng Na 2S2O3 dùng định
phân là ít nhất.

Bài thí nghiệm số 4
KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC XÁC ĐỊNH HÀM ĐỘ ENZYME UREASE
1. Tóm tắt thí nghiệm
1.1 Điều chế dung dịch urease.
Page 19


- Cân 10g đậu nành đã xay thành bột khuấy vào 150ml nước sau đó cho vào bình định
mức 250ml, định mức tới vạch bằng nước cất. Lọc và thu dịch.
1.2 Khảo sát động học.
-Chuẩn bị 2 dãy óng nghiệm mỗi dãy 6 ống. Cho dung dịch vào từng dãy như sau:

Bảng 6: Thành phần cho vào mỗi ống nghiệm
1

2

3

4

5

6

Ure 1/3M (ml)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Nước cất (ml)

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

1

1

1

1

1

1

dung dịch urease(ml)

- Đặt dãy thứ nhấ vào bể ổn nhiệt 40°C, dãy thứ hai vào tủ ấm 30°C trong 20 phút.
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml formol trung tính, lắc đều trong 2 phút.
- Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước cất,
thêm 2 giọt phenolphtalein 1%.
- Cho dung dịch NaOH 0,05 N lên burret bắt đầu định phân tới khi dung dịch chuyển
sang màu hồng thì dừng lại và ghi nhận kết quả.
1.3 Khảo sát hoạt độ enzyme.

Bảng 7: Thành phần cho vào mỗi ống nghiệm
1

2

3

Ure 1/3M

0

1

1

Nước cất (ml)

1

0

0

dung dịch urease (ml)

1

1

0

dung dịch urease đun cách thủy (ml)

0

0

1

- Mang tất cả các ống nghiệm cho đặt vào 40°C trong 20 phút.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml formol trung tính lắc đều trong 2 phút .
Page 19


- Đổ lần lượt các ống ra erlen 100ml thêm vào 2 giọt phenolphtalein và tiến hành chuẩn
độ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng thì dừng lại và ghi nhận kết quả.
2. Kết quả và giải thích thí nghiệm
2.1 Kết quả
- Ống nghiệm sau định phân chuyển từ không màu sang màu hồng nhạt.

Hình 7: Kết quả chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0.05N
2.1.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme
Bảng 8: Kết quả lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch ở thí nghiệm khảo sát
động học(ml)
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

ở 30°C

0,2

0,4

1

1,1

1,1

1,2

ở 40°C

0,2

0,6

1,1

1,2

1,2

1,3

*Lưu ý: do ống nghiệm thứ nhất không có cơ chất nên nhỏ NaOH xuống để chuẩn độ
dung dịch ngay lập tức chuyển sang màu hông ta ghi nhận lại kết quả nhưng thực chất
phản ứng thủy phân không xảy ra nên vận tốc bằng 0.
Page 19


Từ kết quả trên có thể vẽ được đồ thị biểu diễn phương trình động học của MichaelisMenten như sau:

Bảng 9: Kết quả xác định vận tốc thủy phân urease đậu nành
[S]
(mM)

Ống

V1 (30°C)
(mM/phút)

V2(40°C)
(mM/phút)

1/[S]
(mM)-1

1/V1

(mM/phút)-1

1/V2
(mM/phút)-1

-

-

-

7.5.10-4

30

2000

1333

1.25.10-3

1.38.10-3

15

800

725

1/10

1.38.10-3

1.5.10-3

10

725

667

5

2/15

1.38.10-3

1.5.10-3

7.5

725

667

6

1/6

1.5.10-3

1.63.10-3

6

667

613

1

0

0

0

2

1/30

5. 10-4

3

1/15

4

Đồ thị biểu diễn sự biến đổi vận tốc thuỷ phân của urease đậu nành khi thay đổi nồng độ cơ chất ure.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/[S] của urease đậu nành

Bảng 10: Từ kết quả số liệu thu được nhận thấy cách thông số động học của đậu nành
như sau:
Vmax (mM/phút)
0

Km (mM)

Ở 30 c

7,99.10

-3

0,486

Ở 400c

4,34.10-3

0,166

Từ kết quả cho thấy Km ở 30°C cao hon Km ở 40°C điều này có thể cho giúp ta
kết luận đậu nành ủ ở nhiệt độ 30°C có ái lực với cơ chất thấp hơn đậu nành ủ ở nhiệt độ
40°C. Ta cũng thấy được Vmax của đậu ủ ở 30°C thấp hơn đậu ủ ở 40°C.
2.1.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme
Bảng 11: Kết quả lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch ở thí nghiệm khảo sát hoạt
độ enzym

Page 19


Ống nghiệm

1

2

3

400C

0,3

0,7

0,4

- Hoạt độ của enzyme được tính theo công thức:
1.25× 10-5
- Vậy có 1.25× 10-5 (mol) ure bị thủy phân bởi lượng enzym urease có trong 1g bột đậu
nành trong thời gian 1 phút ở 400c.
- Trong đó:
V1,V2: Số ml NaOH 0,05N dùng định phân ống nghiệm 1 và 2
a: Thể tích enzyme cho vào ống nghiệm
A: Tổng thể tích enzyme có được từ m(g) đậu nành
t: Thời gian thủy phân (phút)
m: Khối lượng mẫu cân
k: Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05N

2.2.

Gỉai thích

Ở thí nghiệm khảo sát động học lượng
- NaOH được dùng để chuẩn độ ở nhiệt độ 40°C cao hơn so với ở nhiệt độ 30°C bởi vì:
Nhiệt độ tối ưu của urease là 45-50°C (Mobley và cộng sự). nên khi gần nhiệt độ tối ưu
hơn enzyme urease sẽ thủy phân ure tốt hơn để tạo ra NH3 và CO2 vì vậy nên lượng
H2CO3 tạo ra cũng nhiều hơn do đó lượng NaOH dùng cũng nhiều hơn.
- Khi lượng H2CO3 đã hết tiếp tục nhỏ NaOH vào erlen sẽ chuyển sang màu hồng do
phenolphtalein có bản chất là một acid yếu có thể tác dụng với bazơ và đổi màu.
- Trong thí nghiệm ta cần phải điều chế formol trung tính bởi vì formol dư có thể tác
dụng với NaOH khi chuẩn độ làm sai lệch đáp số cuối cùng.
Ở thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme

Page 19


-Ống nghiệm thứ nhất không có ure vì vậy không có H2CO3 tạo ra vì vậy khi giọt
NaOH đầu tiên nhỏ xuống ngay lập tức dung dịch bị chuyển sang màu hồng.
-Ống nghiệm thứ hai có phản ứng thủy phân ure xảy ra do có urease xúc tác nên thể tích
tăng NaOH cao hơn ống thứ nhất và ống thứ 3.
- Ở ống thứ ba mặc dù có cả ure và urease nhưng do urease bị bất hoạt bởi quá trình đun
cách thủy nên không thể xúc tác cho ure tham gia phản ứng thủy phân, vì lí do đó mà khi
giọt NaOH đầu tiên nhỏ xuống ngay lập tức dung dịch chuyển sang màu hồng.
3. Câu hỏi mở rộng
Trình bày những lợi ích và tác hại của enzyme urease?

• Lợi ích:

- Ure là nguồn cung cấp N2 quan trọng nhưng cây trồng khôn sử dụng được trực tiếp
nguồn N2 này vì vậy urease phân hủy ure thành NH3 cho cây trồng tiêu thụ.
- Urease được ứng dụng trong y học để định lượng ure trong máu và nước tiểu

• Tác hại:
Urease khi thủy phân Ure tạo ra NH3 làm tăng pH. Điều kiện pH tạo ra có thể tăng
cường lắng đọng khoáng chất trên bề mặt răng, và nồng độ amoniac cao có thể có tác dụng
có hại trên các tế bào chủ chẳng hạn như nguyên bào sợi và bạch cầu đa nhân. Vì vậy, sự
phân hủy có thể góp phần vào sự phát triển và sự hủy hoại mô được thấy trong các trường
hợp viêm nướu và viêm nha chu.(M. Chen và cộng sự. 1996)

• Mở rông: Ngoài phương pháp xác đingj hoạt độ enzyme nêu trên người ta có thể chuẩn độ
trực tiếp lượng NH3 tạo ra bằng H2SO4 hoặc dùng phản ứng tạo màu với thuốc thử Nessler
để định lượng NH3 được phóng thích.
Tài liệu tham khảo
[1] Tài liệu hướng dẫn Thí nghiệm Hóa sinh, 2017, trường Đại học Sư phạm Kỹ
thuật TPHCM, page 1-10
[2] H L Mobley, M J Cortesia, L E Rosenthal, B D Jones.1988.Characterization of
Urease from Campylobacter pylori. Journal of clinical microbiology. Pp831-836
Page 19


[3] Yi-ywan M. chen, 1K. Anne Clancy,1,2 and Robert A. Burne .
1996.Streptococcus salivarius Urease: Genetic and Biochemical Characterization and
Expression in a Dental Plaque Streptococcus. Infection and immunity. Pp585–592.

[4] Arpana Kumari. 2010. Alpha-Amylase from germinating soybean (Glycine
max) seeds – Purification, characterization and sequential similarity of conserved and
catalytic amino acid residues. Phytochemistry. 71. 1657–1666.
[5] Kenya J. Wanderley. 2004. Biochemical characterization of alpha-amylase

from the yeast Cryptococcus flavus. FEMS Microbiology Letters. 231. 165-169.
[6] Mosbah Ben Elarbi. 2009. Purification and characterization of α-amylase from
safflower (Carthamus tinctorius L.) germinating seeds. Biochemistry / Biochimie. C. R.
Biologies 332. 426–432.
[7] Nguyễn Đức Lượng. 2010. Những hiểu hiết cơ bản về enzyme. Công nghệ
enzyme. Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 10.
[8] R.J. Whitehurst and B.A. Law. 2002.Enzymes in brewing. Enzymes in Food
Technology. CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. 64-66.
[9] Monsan, P., & Combes, D. (1984). Application of immobilized invertase to
continuous

hydrolysis

of

concentrated

sucrose

solutions.

Biotechnology

and

Bioengineering, 26(4), 347–351

Page 19