luận văn thạc sĩ xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU
HÓA CỦA NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU
HÓA CỦA NGƢỜI
Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số

8420114

:

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài:“ Xác định khả năng phân giải muối mật
của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời” là
do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Tuyết
Nhung. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận hoàn toàn chính xác,

trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích
dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2020
Học viên

Lã Thị Lan Anh


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu em đã đƣợc sự hƣớng dẫn
và giúp đỡ rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị
Tuyết Nhung - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời các
thắc mắc và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Đồng Văn Quyền,
trƣờng phòng Vi sinh phân tử, các anh chị Vũ Thị Hiền,Trần Xuân Thạch, Hà
Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Bùi Thị Dƣơng, Nguyễn Đình Duy trong phòng Vi
sinh phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó
khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác
nghiên cứu Sinh học.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán
bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và
công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em có
lƣợng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng nhƣ đề tài
luận văn này.
Xin cảm ơn gia đình đã động viên, là hậu phƣơng vững chắc giúp em
có động lực học tập.

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả bạn bè đã bên cạnh, cùng nhau học tập và
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ hoàn thành đề tài luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Học viên
Lã Thị Lan Anh


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Giải thích chữ viết tắt

WHO

World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới

LAB

Vi khuẩn sinh axit lactic

BSH

Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật

S. aureus

Staphylococcus aureus

RT-PCR

Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng
chuỗi polymerase thời gian thực

Pox

Pyruvate oxidase

Lox

Lactate oxidase

Nox

NADH oxidase

SE

Staphylococcal enterotoxin

De novo

Tổng hợp mới

MRS

De Man, Rogosa & Sharpe

HRP

Horseradish peroxidase

TMB

3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine

SGC

Sodium Glycocholate

SGDC

Sodium Glycodeoxycholate

STC

Sodium Taurocholate

STDC

Sodium Taurodeoxycholate


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau ........................................ 29
Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh ........................... 31
Bảng 3.1. Giá trị đo OD620nm và hàm lƣợng H2O2 có trong dịch nuôi ............ 42
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trƣờng pH thấp của các chủng vi
khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng................................................................ 44
Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng

có bổ sung muối mật ....................................................................................... 45
Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu .......................................... 54
Bảng 3.5. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân
hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14............... 56


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Lactobacillus sp. ............................................................................... 7
Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic ................................................ 9
Hình 1.3. Cấu trúc của axit mật ...................................................................... 14
Hình 1.4. Sự tổng hợp axit mật ....................................................................... 15
Hình 1.5. Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa ... 19
Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời
......................................................................................................................... 38
Hình 3.2. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy .............. 38
Hình 3.3. Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. A. ảnh soi tƣơi. B.
ảnh nhuộm Gram. ............................................................................................ 39
Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính Catalase ........................................................ 40
Hình 3.5. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với
đối chứng ......................................................................................................... 41
Hình 3.6. Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật
độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB. .................................... 41
Hình 3.7. Khả năng phân giải muối mật của 5 chủng Lactobacillus .............. 48
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4
(lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và
Lac.VFE-14. .................................................................................................... 50
Hình 3.9. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng trên S. aureus của các chủng
Lactobacillus ................................................................................................... 52

Hình 3.10. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04;
Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. .......................................................................... 54
Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08
và Lac.VFE-14. ............................................................................................... 55
Hình 3.12. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập
Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7
Neighbor-Joining Tree. ................................................................................... 57


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỤC LỤC ......................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7
1.1.

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS ........................ 7

1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung .................................................................... 7
1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn
Lactobacillus ............................................................................................. 8
1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus ......................................................... 12
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE
SALT HYDROLASE (BSH) ...................................................................... 13
1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa ........ 13

1.2.2. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase ......................... 18
1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN
LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN
NAY............................................................................................................. 19
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 20
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .............................................. 21
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
1


2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................................. 23
2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................... 23
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 23
2.2.2. Mẫu vật nghiên cứu ...................................................................... 23
2.2.3. Máy móc thiết bị ........................................................................... 23
2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng ................................................................ 23
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 25
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus ............................. 25
2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus ...... 25
2.3.3. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của
các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................... 26
2.3.4. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus ........................................................................................... 30
2.3.5. Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh
Staphylococcus ........................................................................................ 31
2.3.6. Định danh vi khuẩn ....................................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 37
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS ................. 37
3.2. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS .................. 38
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM

PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......... 39
3.3.1. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn .................................. 39
3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus ........................................................................................... 40

2


3.3.3. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các
chủng đƣợc chọn lọc ............................................................................... 43
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA
CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......................................... 47
3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy................................................ 47
3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh ............................... 49
3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY
BỆNH S. AUREUS ...................................................................................... 51
3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ................................................................... 53
3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số ............................................................ 53
3.6.2. Kết quả PCR.................................................................................. 55
3.6.3. Kết quả giải trình tự ...................................................................... 55
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 59
4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 59
4.2. KIẾN NGHỊ.......................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 60
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ....................... 71

3

MỞ ĐẦU
Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015
trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân và béo phì. Đây là một con số
báo động đối với xã hội. Béo phì đƣợc đặc trƣng bởi một nhóm các rối loạn
chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ,
tăng huyết áp, ung thƣ... và đặc biệt là bệnh tim mạch. Trong số các bệnh về
tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất. Tình trạng cao
cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến
sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển
của bệnh mạch vành. Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu
giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi
trƣờng liên quan đến việc kiểm soát trọng lƣợng cơ thể. Ở ngƣời, hệ vi sinh
đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là
Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia,
Cyanobacteria và Actinobacteria [1]. Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở
các đối tƣợng động vật và ngƣời béo phì có sự thay đổi trong thành phần của
hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những
đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn,
cũng nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2]. Sự thay đổi các gen của
vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi là nguyên nhân ảnh hƣởng đến các con đƣờng
chuyển hóa trong cơ thể [3].
Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ở
ngƣời béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng. Lactobacillus
là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate
là axit lactic. Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức
khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Vi khuẩn này có vai trò
quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và
4

các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể
làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium
difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại
trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Chi Lactobacillus đã đƣợc
tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có
pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống
chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể
là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên
cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập đƣợc L. johnsonii số 1088 đã đƣợc
tìm thấy có khả năng kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót ở pH 1.0 sau 2
giờ [7].Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót
của các chủng Lactobacilli ở pH 2.5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6].
Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công
dụng của hoạt tính thủy phân muối mật thông qua tác động trực tiếp vào quá
trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6].
Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.C.3.5.1.24)
xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự
do với gốc Glycine hoặc Taurin. Các axit mật tự do (dạng giải liên hợp) sau
đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể đƣợc tái hấp thu qua
ruột và sẽ đƣợc thải ra ngoài cơ thể. Cholesterol là cơ chất để tổng hợp nên
axit mật, vì thế việc thủy phân muối mật sẽ làm lƣợng cholesterol trong máu
giảm đi, giúp cơ thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy cơ béo phì và các bệnh tim
mạch [8].
Các chủng Lactobacillus phân lập và có những đặc điểm probiotics
đặc trƣng trong nghiên cứu này có một tiềm năng rất lớn để trở thành sản
phẩm probiotics, là liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông
qua khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật BSH. Chính vì lí do nêu
trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề: " Xác định khả năng phân

giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa
của ngƣời."
5


 Với mục tiêu:
Nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này.
 Nhiệm vụ của đề tài:
- Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả
năng phân giải muối mật.
- Xác định các đặc điểm sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi
khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc.

6


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS
1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung
Lactobacillus - một thành viên chính trong nhóm vi khuẩn lactic, là
một chi vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí,
không sinh bào tử (Hình 1.1) [9]. Chúng đòi hỏi môi trƣờng giàu dinh dƣỡng
để sinh trƣởng nhƣ carbohydrates, amino axit, peptide, các ester của axit béo,
muối, dẫn xuất axit nucleic và vitamin [10].

Hình 1.1. Lactobacillus sp.
Nguồn: />Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc phân bố từ dạ dày đến ruột già ở ngƣời và
động vật với số lƣợng thay đổi phụ thuộc vào loài, tuổi của vật chủ, hoặc vị trí
trong ruột. Trong phân ngƣời trƣởng thành, vi khuẩn Lactobacillus chiếm một

tỷ lệ nhỏ, khoảng 0,01% đến 0,6% tổng số lƣợng vi khuẩn với các loài chiếm
ƣu thế nhƣ L. gasseri, L. reuteri, L. crispatus, L. salivarius, và L.ruminis [11].
Ngoài ra các loài L. axitophilus, L. fermentum, L. casei, L.rhamnosus, L.
johnsonii, L. plantarum, L. brevis, L.s delbrueckii, L. curvatus, và L. sakei
cũng có thể đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời với mức độ thay
đổi thất thƣờng [12]. Vi khuẩn này đóng vai trò chính trong lên men thực
phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật từ thời xa xƣa.
7


Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe
khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng có vai trò quan trọng
trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và các hội
chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm
giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium
difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại
trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Đƣờng tiêu hóa là nơi
chính mà vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hầu hết các hoạt tính để kiểm soát
sức khỏe. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đƣợc điều kiện khắt khe
của môi trƣờng sống. Các vi khuẩn lactic có tác dụng chống lại các tác nhân
gây đột biến, phá hủy các tác nhân gây ung thƣ, chống lại các bệnh liên quan
đến hệ tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch [5].
1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn
Lactobacillus
Quá trình trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển của các chủng
Lactobacillus sống trong đƣờng tiêu hóa cũng đồng thời mang lại nhiều lợi
ích cho vật chủ, vì thế vi khuẩn Lactobacillus đóng góp rất nhiều vai trò
trong đời sống của con ngƣời. Một số khả năng chuyển hóa của Lactobacillus
đã đƣợc phát hiện bao gồm:
1.1.2.1. Phân giải protein

Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các
peptide mạch ngắn [13]. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ
thể vật chủ tiêu hoá dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của
Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối
tƣợng nhƣ trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non
[14]. Ngoài ra, trong công nghệ thực phẩm, Lactobacillus còn dùng để làm
tăng hƣơng vị và tham gia kết cấu sản phẩm.
8


1.1.2.2. Phân giải đường lactose
Lactose đƣợc enzyme β-galactosidases của vi khuẩn Lactobacillus
chuyển hóa thành glucose và galactose. Glucose và galactose lại tiếp tục đƣợc
chuyển hóa thành sản phẩm chính là axit lactic cùng với các sản phẩm phụ
nhƣ axit béo chuỗi ngắn acetate, propionate, butyrate,… [15].
Về mặt sinh lý học, axit lactic có những ƣu điểm nhƣ: tăng cƣờng khả
năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón; tăng cƣờng hoạt tính Ca, P,
Fe; kích thích sự tiết dịch vị; tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống
dƣới dạ dày và là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp.
Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc
ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi
cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) axit
lactic (Hình 1.2). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong
đƣờng ruột [16].

Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic [16]
L (+) axit lactic: đƣợc chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá
trình tổng hợp glycogen.
D (-) axit lactic: đƣợc chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ
đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của axit không đƣợc chuyển hoá

trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axit trong trao đổi chất ở trẻ sơ
sinh.
9


1.1.2.3. Vi khuẩn Lactobacillus và cholesterol
Tác dụng của vi khuẩn lactic lên tình trạng cao cholesterol trong máu
đã phát hiện trong nhiều nghiên cứu trên động vật cũng nhƣ con ngƣời. Sử
dụng vi khuẩn lactic theo đƣờng uống có tác dụng làm giảm đáng kể
cholesterol từ 22 đến 33% hoặc làm giảm cholesterol ở chuột béo phì [6,1719]. Những tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của vi khuẩn này có thể
đƣợc thông qua: hoạt tính enzyme thủy phân muối mật [19], khả năng đồng
hóa cholesterol [18]; hoạt tính gắn kết vào màng tế bào, và khả năng sản xuất
các hợp chất nhƣ FA có tác dụng ức chế hoạt tính của các enzyme nhƣ HMGCoA reductase.
Các sản phẩm từ đậu nành đƣợc lên men bởi L. jugurti có thể làm giảm
cholesterol trong máu, giảm lipid, triglyceride tổng số trong huyết thanh và
gan ở chuột bị cao cholesterol trong máu [20].
L. plantarum KCTC 3928 cũng có tác dụng giảm cholesterol trong máu
đạt đƣợc bằng cách tăng tổng hợp axit mật và bài tiết axit mật qua phân [21].
L. plantarum BBE7 với hoạt tính BSH cao đã đƣợc chọn lọc và hoạt tính giải
liên hợp muối mật cũng nhƣ tác dụng loại bỏ cholesterol của nó ở quy mô
phòng thí nghiệm đã đƣợc nghiên cứu. L. plantarum BBE có tác dụng làm
giảm cholesterol lên đến 58% ở chuột [22].
Tác dụng làm giảm béo của vi khuẩn L. plantarum 14 thông qua hoạt
động làm giảm nồng độ leptin và cholesterol tổng số. Thêm vào đó L.
plantarum 14 làm giảm kích thƣớc của các tế bào mô mỡ, làm giảm trọng
lƣợng của mô mỡ trắng [23].
Kết quả của RT-PCR cho thấy ở L. plantarum CGMCC 8198, tất cả
gen bsh2, bsh3, và bsh4 đều tăng khi có mặt muối mật. L. plantarum CGMCC
8198 làm giảm 20% cholesterol trong huyết thanh ở chuột béo phì. Kết quả

10


này cho thấy L. plantarum CGMCC 8198 có lợi thế tiềm năng trong việc
ngăn ngừa bệnh tim mạch.
1 .1.2.4. Sản xuất H2O2 và tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn
Hydrogen peroxide có công thức hóa học là H2O2. Đây là một một chất
oxy hóa mạnh. H2O2 chủ yếu đƣợc sinh ra trong quá trình chuyển hóa carbon
và năng lƣợng bởi các enzyme oxidase, bao gồm pyruvate oxidase, lactate
oxidase và NADH oxidase [24]. Ngoài ra, H2O2 cũng đƣợc tổng hợp trực tiếp
từ các hợp chất xanthine (nhƣ hypoxanthine, xanthine…) có liên kết –H dễ
thay thế cùng với nƣớc và oxi nhờ xúc tác của xanthine oxidase và Nox-4
[25]. Tác dụng diệt khuẩn của H2O2 là nhờ khả năng dễ dàng chuyển đổi thành
gốc hydroxyl, đây là một chất oxy hóa mạnh có tác dụng gây độc cho tế bào,
ức chế sự sinh trƣởng của một số loài vi khuẩn nhƣ Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus… [26].
Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản
xuất H2O2 nhƣ: L. johnsonii, L. axitophilus, L. fermentum, L. gasseri,...[24].
Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng là khác nhau
với nồng độ dao động trong khoảng 0,8 – 6,4 mM [27]. Khả năng tạo H2O2
của chủng L. fermentum CS 12-1 là 3.5 mM [28], chủng L. johnsonii
NCC533 là 1mM [24] hay các chủng Lactobacillus trong nghiên cứu của
Zalán và cộng sự, (2005) là từ 0,059 – 0,176 mM [29].
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trƣởng và bài tiết độc
tố ở vi khuẩn S. aureus [30]. Trong nghiên cứu của Misaghi và cộng
sự,(2017) cho thấy cả ba loài L. acidophilus, L. paracasei và L. fermentum
đều có khả năng ức chế sinh trƣởng của S. aureus. Ngoài ra, các chủng
Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen SE là yếu tố gây độc chính của
S. aureus [31]. Thử nghiệm lâm sàng của Eggers và cộng sự, (2018) cho thấy
những ngƣời sử dụng bổ sung đƣờng uống vi khuẩn probiotic L.

11


rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73- 83% số lƣợng vi khuẩn S.
aureus đƣờng ruột ngƣời so với những ngƣời chỉ dùng giả dƣợc [30]. Hơn
nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trƣởng của S.
aureus nhờ chủng vi khuẩn này có khả năng tiết ra môi trƣờng những phân tử
kháng khuẩn nhƣ ethanol, H2O2 và các bacteriocin [32].
1.1.2.5. Khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp và chịu muối
mật
Để có thể tồn tại trong môi trƣờng đƣờng tiêu hóa của vật chủ, các vi
khuẩn cần phải có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối mật cao, pH thấp [6] và
có khả năng bám dính vào chất nhầy và các tế bào niêm mạc ruột [22].
Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong
đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật,
chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất
enzyme thủy phân muối mật có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng
của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập
đƣợc L. johnsonii 1088 có khả năng kháng axit mạnh, hơn 10% tế bào sống
sót ở pH 1 sau 2 giờ [7]. Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho
thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2,5 và 2% muối mật sau 3
giờ [6].
Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công
dụng của hoạt tính enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình
chuyển đổi muối mật của vật chủ [6].
1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus
Lactobacillus cũng nhƣ nhiều loại vi khuẩn lactic khác đã và đang đƣợc
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ y tế, môi trƣờng, nông
nghiệp, và trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm.

12


- Trong nông nghiệp:
Một số chủng lactobacillus nhƣ L. acidophilus, L. casei, L.
sporogenes... đƣợc sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi nhờ khả năng tạo
môi trƣờng giàu axit lactic, H2O2, giảm độ pH trong đƣờng tiêu hóa làm ức
chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh, đồng thời kích thích khả
năng miễn dịch cho vật nuôi, cải thiện khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng [33,
34].
Lactobacillus còn đƣợc sử dụng kết hợp với các vi khuẩn lactic khác
trong chế phẩm để xử lý ô nhiễm môi trƣờng, cải tạo đất, ức chế sự phát triển
của mầm bệnh làm tăng khả năng sống và năng suất cho cây trồng, vật nuôi
[35].
- Trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm:
Nhờ khả năng lên men sinh axit lactic cùng một số sản phẩm có giá trị
nhƣ vitamin, chất thơm... Lactobacillus đƣợc sử dụng để bổ sung vào sữa tạo
nên các sản phẩm sữa chua thơm ngon dinh dƣỡng và có lợi cho sức khỏe
ngƣời sử dụng [36- 38].
Trong lên men dƣa chua, hoa quả muối chua, các vi khuẩn lactic bổ
sung vào giúp cho thực phẩm không bị biến đổi về màu sắc tự nhiên mà vẫn
giữ nguyên giá trị dinh dƣỡng, giúp thực phẩm đƣợc bảo quản trong thời gian
lâu hơn [39].
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT
HYDROLASE (BSH)
1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa
1.2.1.1. Đặc điểm của mật
Mật là một dịch lỏng màu vàng xanh, chứa các thành phần nƣớc, axit
mật, cholesterol, phospholipids và sắc tố màu biliverdin [40] . Ở nhiều loài,
13

mật đƣợc lƣu giữ trong túi mật giữa các bữa ăn và đƣợc đổ vào tá tràng khi
ăn, ở đó mật hỗ trợ quá trình tiêu hoá thức ăn. Axit mật chiếm khoảng 50%
thành phần hữu cơ của mật và chúng đƣợc tổng hợp mới từ cholesterol trong
gan. Sau khi đƣợc liên kết với glycine hoặc taurine để tạo thành axit mật liên
hợp, chúng thƣờng kết hợp với ion Na+ hay K+ để tạo thành muối mật. Tính
chất lƣỡng cực cho phép các muối mật đóng một vai trò quan trọng trong việc
nhũ tƣơng hóa các chất béo làm tăng sự tiếp xúc giữa lipase và cơ chất lipid,
do đó muối mật đóng một vai trò thiết yếu trong việc tiêu hóa chất béo. Trong
quá trình di chuyển ở ống tiêu hóa, các muối mật tiếp xúc với các vi khuẩn
đƣờng ruột, là những đối tƣợng có khả năng loại bỏ gốc glycine hoặc taurine
bằng cách sử dụng enzyme BSH. Với lƣợng lớn axit mật lƣu thông trong ống
tiêu hóa, hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa tham gia tích cực vào việc chuyển hóa
muối mật với mức độ lớn.

Hình 1.3. Cấu trúc của axit mật [40]
1.2.1.2. Tổng hợp axit mật từ Cholesterol
Các axit mật sơ cấp gồm cholic và axit chenodeoxycholic đƣợc tổng
hợp mới ở gan từ cholesterol (Hình 1.4). Axit mật đƣợc duy trì sự cân bằng
một cách hiệu quả trong điều kiện bình thƣờng bằng một quá trình gọi là chu
trình gan - ruột. Axit mật liên hợp (với glycine hoặc taurine) và không liên
hợp đƣợc hấp thu bằng cách khuếch tán thụ động dọc theo toàn bộ ruột và vận

14


chuyển tích cực ở đoạn cuối hồi tràng. Axit mật có thể đƣợc tái hấp thu vào
máu và đƣợc giữ bởi các tế bào gan, tái liên kết, và tái tiết vào trong mật. Ở
ngƣời bình thƣờng, mỗi ngày có khoảng 0,3 đến 0,6 g (5% tổng số axit mật)

vƣợt quá khả năng hấp thụ của tế bào biểu mô nên chúng đƣợc xử lý bởi các
vi khuẩn đƣờng ruột [41].

Hình 1.4. Sự tổng hợp axit mật

1.2.1.3. Chuyển hóa axit mật của hệ vi sinh vật đường ruột
Với lƣợng lớn axit mật lƣu thông trong ống tiêu hóa, hệ vi sinh vật
đƣờng tiêu hóa phức tạp có liên quan đến khả năng chuyển hóa muối mật với
mức độ lớn. Hệ vi sinh đƣờng ruột có thể tạo ra khoảng 20 chất chuyển hóa
axit mật khác nhau từ axit cholic và chenodeoxycholic axit [42]. Biến đổi sinh

15


học đƣợc biết đến bởi vi khuẩn đƣờng ruột bao gồm: (1) thủy phân muối mật
liên hợp để giải phóng axit mật tự do và các gốc axit amin, (2) loại bỏ các
nhóm hydroxyl chủ yếu là nhóm hydroxyl 7 cacbon của gốc axit cholic, (3)
phản ứng oxi hóa khử của các nhóm hydroxyl, và (4) sự epime hóa axit mật
[43]. Trong số những phản ứng trên, thủy phân muối mật liên hợp là phản ứng
quan trọng nhất về mặt sinh học. Đây là một điều kiện tiên quyết cho bất kỳ
chuyển đổi nào của sterol trong cơ thể [40].
1.2.1.4. Thủy phân muối mật
Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit amin đƣợc thực
hiện trong gan. Ngƣợc lại, các hoạt động của vi sinh vật đƣờng ruột có thể
tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin [40]. Các
lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp đƣợc gọi
chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp - BSH, còn đƣợc gọi là
hydrolases cholylglycine [40].
BSH đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật trong ruột, chúng tham gia vào
những bƣớc đầu tiên của sự biến đổi axit mật. Những vi khuẩn giải liên hợp

của muối mật đƣợc cho là tăng một cách khiêm tốn ở ngoại vi hồi tràng và
tăng đáng kể ở đại tràng, bằng chứng là axit mật không liên hợp không thấy
xuất hiện trong hỗng tràng, nhƣng tăng chậm trong hồi tràng. Trong phân hầu
hết axit mật ở dạng không liên hợp. Thí nghiệm với động vật sạch (không có
vi sinh vật trong đƣờng ruột), thấy xuất hiện các muối mật liên hợp nguyên
vẹn trong phân, do vậy có thể nói rằng các vi khuẩn đƣờng ruột chịu trách
nhiệm cho sự giải liên hợp [42]. Từ việc so sánh các đặc điểm giữa không có
vi khuẩn Lactobacillus và có vi khuẩn Lactobacillus cƣ trú ở ruột chuột, cho
thấy rằng Lactobacillus chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động thủy phân
muối mật trong đƣờng ruột của chuột [40].

16


Những muối mật giải liên hợp đƣợc tái hấp thụ lại ít hơn so với các
muối mật liên hợp của chúng, kết quả là một lƣợng lớn axit mật tự do đƣợc
bài tiết trong phân. Ngoài ra, muối mật tự do có hiệu quả thấp trong việc hòa
tan và giúp chất béo hấp thu trong ruột. Vì thế, sự giải liên hợp của muối mật
có thể dẫn đến làm giảm cholesterol huyết thanh bằng cách: 1- làm tăng nhu
cầu đối với cholesterol để tổng hợp mới các axit mật, bù lại phần bị mất đi
trong phân hay 2- nhờ làm giảm độ hòa tan cholesterol, qua đó làm giảm độ
hấp thu cholesterol qua lumen ruột [44].
1.2.1.5. Thủy phân axit mật làm giảm cholesterol
Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus đƣợc xem nhƣ các các liệu pháp
sinh học có tác dụng làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ hoạt
tính của enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển hóa
muối mật của vật chủ [45]. Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit
amin đƣợc thực hiện trong gan. Ngƣợc lại, các hoạt động của Lactobacillus có
thể tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin. Các
lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp đƣợc gọi

chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp, còn đƣợc gọi là hydrolases
cholylglycine [42].
Các axit mật tự do là sản phẩm của phản ứng thủy phân muối mật bởi
các enzyme BSH của một số Lactobacillus ít tan trong nƣớc, dễ bị kết tủa và
kết quả là dễ dàng bị đào thải qua phân. Việc tăng cƣờng sự đào thải muối
mật qua phân sẽ làm tăng nhu cầu sử dụng cholesterol nhƣ một tiền chất để
tổng hợp muối mật mới để duy trì sự cân bằng muối mật trong cơ thể. Vì vậy,
sự tiêu hao muối mật có thể đƣợc coi nhƣ là một liệu pháp sinh học để can
thiệp vào việc điều trị chứng tăng cholesterol trong máu [43].
Các thành phần chính của mật là các axit mật sơ cấp, cholesterol và các
phospholipid. Trong cơ thể, axit mật sơ cấp đƣợc tổng hợp mới từ cholesterol
17