NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI. LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 942 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng

Hà Nội – 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu,
cộng tác với các nhà khoa học khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong
nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại
trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng năm 2020

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang

Nguyễn Ngọc Quang


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ
cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm
túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực
hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau
này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.
Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.
Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong
những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các
đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,
thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp
tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
1.1. Ung thư phổi......................................................................................................... 4
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi .................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ung thư phổi ...................................................................................... 6
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ............................................................................... 7
1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi .......................................................................... 9
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến ....................................................................... 9
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................ 11
1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi ............................................................. 13
1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR ................................................................... 13
1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi .......................................................... 15
1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi ................................................... 17
1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi ................................................................. 17
1.4.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................. 17
1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong
ung thư phổi ...................................................................................................... 20
1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi....................................................... 29
1.5.1. Điều trị đích trong ung thư .............................................................................. 29
1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi ...................................................................... 31
1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi ............................. 33
1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi ................................ 33
1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................ 35
1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam ....................... 37
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 39
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 39
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 39
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39

2.2. Thiết bị chính ..................................................................................................... 42
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43


2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA ...................................... 43
2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số ..................................................................... 44
2.3.3. Phương pháp PCR ........................................................................................... 44
2.3.4. Phương pháp điện di ....................................................................................... 47
2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR ..................................................... 47
2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................... 48
2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI ......................... 49
2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học ............................................................. 50
2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 50
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ...................................................................................... 51
3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu ........................................................................ 51
3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR ....................................................................... 52
3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ...................... 52
3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.............. 56
3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của
phổi ................................................................................................................... 59
3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ................ 59
3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân .............. 61
3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ............... 63
3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân ...................... 65
3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ........... 66
3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một
số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi ................................................... 68
3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR..................... 68
3.4.2.

Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa

các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ................................................. 71
3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu
mô tuyến của phổi ............................................................................................ 74
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 76
4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi..... 76
4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR ...................................... 76


4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR ............................................................ 78
4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR .................................................................. 80
4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR ........................................ 81
4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh
nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi .............................................................. 83
4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 .......................................................... 83
4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT .......................................................... 84
4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 ........................................................... 86
4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A ...................................................... 87
4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của
phổi ................................................................................................................... 88
4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u ............... 88
4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u ............................ 90
4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô
tuyến của phổi................................................................................................... 91
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 94
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 95
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ............................................................................... 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 97


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

A260

Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm

AAH

Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức
không điển hình)

ABL

Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene

ACS

American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)

AIS

Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)

ALK

Anaplastic Lymphoma Kinase gene

ALK-EML4,

Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL

BCR-ABL
APC

Adenomatous polyposis of the colon gene

BAC

Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang)

BCR

Breakpoint Cluster Region gene

BRCA1

Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú)

BRAF

v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B

CD74

Cluster of Differentiation 74 gene

CHFR

Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains

CK5/6

Cytokeratin 5/6 protein

CK7

Cytokeratin 7 protein

COBRA

Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp
Bisulfite và cắt giới hạn)

cs.

Cộng sự

DAB

3, 3 –diaminobenzidine

DAPK

Death‐associated protein kinase

DNA

Acid deoxyribonucleic

DNMTs

DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)


dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EGFR

Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô)

ER

Estrogen receptor (thụ thể estrogen)

FDA

Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc
Hoa Kỳ)

FFPE

Formalin fixed paraffin embedded

FISH

Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)

GTP

Guanosine triphosphate

GDP

Guanosine diphosphate

GSTP1

Glutathione S-transferase Pi 1 gene

H&E

Hematoxylin & Eosin

HDACs

Histone deacetylase

HRM

High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)

HPR

Horseradish Peroxidase

IARC

International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên
cứu ung thư thế giới)

IHC

Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)

MAPK

Mitogen-activated protein kinase

MDR

Multidrug resistance gene

MEK
Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1
(MAP2K1)
MET

Mesenchymal-epithelial transition factor

MIA

Minimally Invasive Adenocarcinoma

MGMT

O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene

MLH1

MutL homolog 1 gene

MsssI

CpG methyltransferase

MS-PCR

Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)


MYC

Myelocytomatosis genes

NGS

Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

NSCLC

Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ)

PI3K

Phosphoinositide 3-kinases

PTEN

Phosphatase and tensin homologue

PR

Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone)

RASSF1A

Ras association domain family 1A gene

RARP2

The retinoic acid receptor P gene

Ras

Rat sarcoma

RB2

Retinoblastoma-like protein 2

RET

Rearranged during transfection

ROS1

c-ros oncogene 1gene

SAM

S-adenosylmethionine

SCLC

Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)

SDC4

Syndecan 4 gene

SLC34A2

Solute Carrier Family 34 Member 2 gene

SNP

Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)

SSCP

Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi
đơn)

TAE

Tris-acetate-EDTA

TBE

Tris-borate-EDTA

TEMED

N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine

TKIs

Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase)

TIMP3

Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene

TTF-1

Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1)

WHO

World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

WNT

Wingless genes

YAP

Yes-associated protein


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1

Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên
thế giới

5

Hình 1.2

Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018

5

Hình 1.3

Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi

7

Hình 1.4

Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến

11

Hình 1.5

Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

12

Hình 1.6

Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR

14

Hình 1.7

Tần suất các dạng đột biến gen EGFR

15

Hình 1.8

Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư

19

Hình 1.9

Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR

22

Hình 1.10

Cấu trúc gen BRCA1ở người

22

Hình 1.11

Chức năng ức chế khối u của BRCA1

23

Hình 1.12

Cấu trúc gen MLH1

24

Hình 1.13

Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1

24

Hình 1.14

Cấu trúc gen MGMT

26

Hình 1.15

Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT

26

Hình 1.16

Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân

27

Hình 1.17

Chức năng ức chế khối u của RASSF1A

28

Hình 1.18

Điều trị đích trong ung thư phổi

32

Hình 1.19

Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen

35

Hình 1.20

Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA

36

Hình 2.1

Phương pháp xử lý bisulfite

44

Hình 2.2

Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms

48

Hình 2.3

Phương pháp hóa mô miễn dịch

49

Hình 2.4

Sơ đồ nghiên cứu

50

Hình 3.1

Kết quả phát hiện đột biến EGFR

53


Hình 3.2

Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR

Hình 3.3

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen EGFR

Hình 3.4

Hình 4.1

63

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl
hóa MLH1

Hình 3.7

61

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen MGMT

Hình 3.6

59

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen BRCA1

Hình 3.5

56

65

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen RASSF1A

67

Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện
EGFR

81


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

40

Bảng 2.2

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

41

Bảng 2.3

Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu

45

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu

46

Bảng 3.1

Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu

51

Bảng 3.2

Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu

52

Bảng 3.3

Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân

54

Bảng 3.4

Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh
nhân nam giới

55

Bảng 3.5

Mức độ biểu hiện protein EGFR

57

Bảng 3.6

Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm
bệnh nhân

58

Bảng 3.7

Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân

60

Bảng 3.8

Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân

62

Bảng 3.9

Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân

64

Bảng 3.10

Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân

66

Bảng 3.11

Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân

68

Bảng 3.12

Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein
EGFR

69

Bảng 3.13

Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR

70

Bảng 3.14

Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR

70