Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố apx IA từ actinobacillus pleuropneumoniae​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR
BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA
TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR
BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA
TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ SỐ: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Thị Thu Ngà
2. PGS. TS. Dương Văn Cường

Thái Nguyên, 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS. Dương Văn Cường. Các số liệu trích
dẫn rõ ràng, các kết quả trong luận văn là trung thực.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong
luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2018
Tác giả luận văn

Hoàng Thị Huyền Trang

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS.
Dương Văn Cường đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái
Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Sinh học phân tử & Công nghệ tế bào - Viện
Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, cảm ơn Công ty thuốc thú y Đức Hạnh
Marphavet đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các
thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích

giúp đỡ trong quá trình làm đề tài.
Tác giả luận văn

Hoàng Thị Huyền Trang

ii


MỤC LỤC
Trang
TRANG BÌA PHỤ
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC .........................................................................................................iii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI .......................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus
pleuropneumoniae ....................................................................................... 3
1.1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn ...................................................................... 3
1.1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ............................................. 5
1.2. Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh .................................................................... 7
1.2.1. Ngoại độc tố Apx ....................................................................................... 7
1.2.2. Các yếu độc lực khác ............................................................................... 10
1.2.3. Cơ chế gây bệnh ...................................................................................... 11

1.2.4. Gen mã hóa protein ApxIA ..................................................................... 12
1.3. Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra..... 12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
2.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu .................................................... 14
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 14
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 15

iii


2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 15
2.2.1. Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen .................... 15
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ..................................................... 15
2.2.3. Phương pháp PCR ................................................................................... 16
2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng và biểu hiện ....................... 17
2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ....................................... 18
2.2.6. Phương pháp cắt kiểm tra ........................................................................ 19
2.2.7. Phương pháp xác định và phân tích trình tự DNA .................................. 20
2.3. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu ......................................................... 20
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................... 23
3.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự đoạn gen ApxIA của
A.pleuropneumoniae .................................................................................. 23
3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen ApxIA........................................................ 23
3.1.2. Kết quả biến nạp đoạn gen ApxIA vào vector tách dòng pGEM ............ 24
3.1.3. Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA.......................................................... 25
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA ............ 28
3.2.1. Kết quả sàng lọc các dòng plasmid mang vector biểu hiện chứa đoạn
gen ApxIA ............................................................................................... 28
3.2.2. Kết quả chọn lọc vector pET– ApxIA bằng PCR và cắt kiểm tra bằng
enzyme giới hạn....................................................................................... 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 31
1. Kết luận .......................................................................................................... 31
2. Đề nghị........................................................................................................... 31
01 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .......... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 33

iv


CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI
App

Actinobacillus pleuropneumoniae

bp

Base pair

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

Kb

Kilo base

LPS

Lipopolysaccharide

NAD

Nicotinamide Adenine Dinucleotide

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

TAE

Tris - Acetate - EDTA

Taq

Thermus aquaticus

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu....................... 3
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ...................... 17
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector biểu hiện....................... 17
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng BamHI và HindIII ........... 19
Bảng 2.4. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .................. 20

Bảng 2.5. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 21
Bảng 3.1. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen ApxIA của
A.pleuropneumoniae serotype 5a và ApxIA (GQ369732.1) ........... 28

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae ............. 5
Hình 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae .................................... 6
Hình 2.1. Sơ đồ vector pGEM®-T Easy của Promega.................................... 14
Hình 2.2. Sơ đồ vector biểu hiện pET-28a (+) ................................................ 14
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện pET - ApxIA ............... 22
Hình 3.1. Kết quả nhân gen ApxIA từ App serotype 5a .................................. 23
Hình 3.2. Khuẩn lạc mang plasmid trên môi trường chọn lọc ........................ 24
Hình 3.4. Kết quả cắt vector pGEM- ApxIA bằng enzyme BamHI và HindIII ... 25
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide ApxIA của
A.pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA
(GQ369732.1) trên Genbank ........................................................... 26
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen ApxIA
của A. pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA
(GQ369732.1) trên Genbank ........................................................... 27
Hình 3.7. Kết quả tách plasmid các dòng có khả năng mang pET-ApxIA .... 29
Hình 3.8. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA bằng
PCR với cặp mồi đặc hiệu Apx ....................................................... 29
Hình 3.9. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA khi cắt
bằng enzyme BamHI và HindIII...................................................... 30

vi

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Lợn là vật nuôi chiếm tỷ trọng cao trong ngành chăn nuôi ở Việt Nam.
Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi thì dịch bệnh cũng phát
sinh, lây lan và gây thiệt hại lớn về kinh tế.
Bệnh viêm màng phổi ở lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô
hấp phức hợp, được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới, nơi có ngành chăn
nuôi lợn phát triển. Bệnh có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của đàn lợn với
tỷ lệ chết có thể lên đến 20% khi có dịch cấp tính xảy ra. Tuy nhiên, các thiệt
hại gián tiếp khi bệnh ở thể mãn tính gây ra như tăng trọng trên ngày giảm 50
gram và các chí phí thuốc cho điều trị cao hơn nhiều so với tỷ lệ chết.
Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ lâu đã được nghiên cứu
nhiều và xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm màng phổi ở lợn.
Nhiều công bố đã cho thấy, mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi
khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản
sinh từ vi khuẩn đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn. Độc lực
của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố,
trong đó độc tố ApxI có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế
bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính.
Hiện nay để phòng bệnh viêm màng phổi do vi khuẩn A.
pleuropneumoniae gây ra chủ yếu sử dụng vaccine nhược độc. Đây đều là các
loại vaccine có giá thành khá cao, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm
cũng rất thất thường và không ổn định. Trong những năm gần đây, việc ứng
dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất vaccine đang được quan tâm, tạo ra
vaccine thế hệ mới khắc phục được nhược điểm của các loại vaccine truyền
thống như vaccine nhược độc.

1


Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tách dòng và
thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA từ Actinobacillus
pleuropneumoniae” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu sản
xuất vaccine phòng bệnh sau này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tách dòng được đoạn gen ApxIA mã độc tố ApxIA của vi
khuẩn A.pleuropneumoniae.
Thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp Apx IA trên vi khuẩn
Escherichia coli.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và tách dòng đoạn gen ApxIA mã hóa độc tố ApxIA
của vi khuẩn A. pleuropneumoniae.
Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện pET-Apx IA mang đoạn gen mã
hóa độc tố Apx IA của vi khuẩn A. pleuropneumoniae.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus
pleuropneumoniae
1.1.1. Bệnh viêm màng phổi ở lợn
Bệnh viêm phổi hay còn gọi là bệnh viêm phổi màng phổi dính sườn trên
lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, bệnh có ảnh
hưởng rất lớn đến năng suất đàn lợn. Theo Jäger H. C. và đtg (2012) tổng hợp
dữ liệu từ 14 lò mổ tại Anh cho thấy trong 15.237 lô hàng giết mổ từ tháng 7

năm 2005 đến tháng 10 năm 2008, 80% bị ảnh hưởng bởi viêm màng phổi. Các
nghiên cứu ở các nước khác đã phát hiện thấy tỷ lệ viêm màng phổi tương tự
và thậm chí tăng lên ( Bảng 1.1 ) [9].
Bảng 1.1. Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu.
Năm

Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi

2000

16%

2009

20,8 %

1987

14

1998

24%

2000

25%

1990

12%

2004

22,5%

Na Uy

1991

41%

Tây Ban Nha

2009

26,8%

Anh

1988

16%

Quốc gia
Bỉ

Đan mạch

Hà Lan

Nguyên nhân
Nhiều nghiên cứu đã xác định vi khuẩn A. pleuropneumoniae là nguyên
nhân chính gây ra các đợt bùng phát dịch hô hấp cấp tính ở lợn [8], [11], [20]...

3


Vi khuẩn này xâm nhập vào lợn qua hệ thống hô hấp gồm miệng, phế quản,
phế nang, thùy đỉnh và các thùy khác của phổi. Thời gian ủ bệnh thường ngắn,
khoảng 12 giờ đến 3 ngày [9].
Triệu chứng
Bệnh viêm màng phổi ở lợn có các triệu chứng lâm sàng khác nhau tùy
thuộc vào nhiều yếu tốp như tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi
trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh. Tiến triển lâm sàng có thể
là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính.
Bệnh viêm màng phổi thể quá cấp tính có đặc điểm lợn mắc bệnh sốt
41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy. Thời gian ngắn trước khi
chết, thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tư thế
ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh. Ngay trước khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn
máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn
bộ cơ thể trở nên tím tái, lợn mắc bệnh thường chết sau 24 - 36 giờ [1], [21].
Bệnh viêm màng phổi thể cấp tính có đặc điểm lợn bệnh sốt từ 40,5oC 41oC, da đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn. Các dấu
hiệu hô hấp nặng như khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ. Bệnh diễn
biến khác nhau tùy thuộc vào từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ tổn thương ở
phổi và thời điểm bắt đầu điều trị. Lợn thường sống sót nếu qua được 4 ngày
đầu của bệnh [1], [21].
Bệnh viêm màng phổi thể bán cấp tính có đặc điểm xuất hiện sau khi
các dấu hiệu cấp tính mất đi; lợn bệnh không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự
phát, với các cường độ khác nhau, con vật kém ăn, giảm tăng trọng [1], [6].

Bệnh viêm màng phổi thể mãn tính có đặc điểm lợn mắc bệnh không có
biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng. Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân
tố truyền bệnh cho những lợn khác Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ

4


hơn nếu có nhiễm trùng kế phát các vi sinh vật đường hô hấp khác như
Mycoplasma, Pasteurella, hay các nhân tố stress.
Bệnh tích
Lợn bị nhiễm A. pleuropneumoniae có những tổn thương chủ yếu ở đường
hô hấp. Phần lớn các trường hợp lợn bị viêm hai bên phổi với tổn thương ở các
thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm hoành. Viêm màng phổi tơ
huyết và fibrin thường rất rõ ở những lợn chết trong giai đoạn cấp tính của
bệnh. Những trường hợp lợn bị tử vong nhanh chóng như thể cấp tính thường
quan sát thấy khí quản và các phế quản bị lấp đầy bởi các chất tiết nhày, bọt
nhuốm máu, phổi trở nên sẫm màu, có rất nhiều máu ở lồng ngực và nhiều tơ
huyết gắn giữa phổi, thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim (hình 1.1) [1]
[21].

Hình 1.1. Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae [21]
1.1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae
Phân loại, hình thái
Vi khuẩn A. pleuropneumoniae hay Haemophilus parahaemolyticus hoặc
Haemophilus

pleuropneumoniae

Gammaproteobacteria,

bộ

thuộc

Pasteurellales,

ngành

Proteobacteria,

lớp

họ

Pasteurellaceae,

chi

Actinobacillus đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi
5


- màng phổi truyền nhiễm ở lợn [4].
A. pleuropneumoniae thuộc loại trực cầu khuẩn, kích thước nhỏ, thuộc
nhóm gram âm, kích thước khoảng 0,3 - 0,5 x 0,6 - 1,4 pm. Vi khuẩn A.
pleuropneumoniae không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành
giáp mô, trừ một số chủng không có giáp mô. Vi khuẩn có nhung mao với kích
thước 0,5 - 2 x 60 - 450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm
thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn App, loại không có vỏ ít tìm thấy hơn
[4].

Hình 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae [12]
Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có khả năng lên men đường glucose,
xylose, mannitol, mannose và không lên men đường arabinose, lactose,
raffinose, sorbitol. A. pleuropneumoniae dương tính với các phản ứng urease,
oxidase, âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey
[5].
Phân loại A. pleuropneumoniae
Căn cứ vào nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine
Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn,
A. pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype chính. Biotype 1 cần có NAD,
6


còn biotype 2 thì không cần NAD trong quá trình nuôi cấy, nhưng vẫn cần có
các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid
cho quá trình tổng hợp NAD [4]. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2 [10].
Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule
polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào [7]. Ở
biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như
biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được
phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 [16]. Năm 2002,
Blackall P.J. và đồng tác giả đã đề xuất một serotype mới của App - serotye 15
với HS143 là chủng tham chiếu cho serotype mới [5]. Các serotype phân bố
khác nhau giữa các quốc gia. Ví dụ, các serotype 1 và 5 chiếm ưu thế ở Bắc
Mỹ, serotype 2 chủ yếu được tìm thấy ở châu Âu, serotype 15 chủ yếu ở Úc và
serotype 2, 1 và 5 ở Nhật Bản. Ở Việt Nam, serotype 2 và 5 rất phổ biến.
Serotype 1, 2, 5, 9 và 11 thường được tìm thấy có độc lực hơn các serotype
khác [11].

1.2. Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh
1.2.1. Ngoại độc tố Apx
Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin)
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype
vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx)
sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn
[15], [19], [21]. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn
A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này
được xếp vào nhóm RTX - toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII,
ApxIII. Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các
serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae [14].
Độc tố ApxI

7


ApxI là một protein có trọng lượng phân tử từ 105 - 110 kDa, có độc lực
cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào
phế nang và bạch cầu trung tính. ApxI đầu tiên phát hiện và được đặt tên là
haemolysin I (HlyI) hay cytolysin I (ClyI) [5]. ApxI được tiết ra bởi các A.
pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10; 11 thuộc biotype 1 và serotype 14 của
biotype 2. Operon mã hóa cho protein ApxI được xác định là gen apxI và gồm
4 cistron được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB, và apxID, trong đó
C là chức năng tạo ra protein hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố và B
cùng D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự
tiết độc tố qua cả hai màng. Ion Canxi (Ca2+) cần thiết cho các hoạt động sinh
học của độc tố dung huyết A. pleuropneumoniae [8]. Phân tích protein của độc
tố ApxI cho thấy 56% tương đồng với HlyA- độc tố làm dung huyết của vi
khuẩn E. coli [6]. Các chủng sản sinh ra ApxI thường có độc lực cao, điều này
cho thấy độc tố có liên quan đến độc lực của A. pleuropneumoniae.

Độc tố ApxII
ApxII là loại độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung
bình, trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa [7]. Đầu tiên ApxII được gọi
là HlyII, ClyII hay CytII. Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều
tiết loại độc tố ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 [6].
Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các cistron apxIICA và thiếu các cistron
bài tiết tương ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào cistron apxIBD và gen này được
tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae , ngoại trừ serotype 3
[19].
Độc tố ApxIII
ApxIII là loại độc tố không làm tan huyết, nhưng có khả năng gây dung
giải tế bào mạnhk, trọng lượng phân tử 120 kDa [15]. Đầu tiên, ApxIII được
đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay

8


độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) [15]. ApxIII được phân
biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng có khả năng
gây dung giải mạnh các tế bào khác. Cấu trúc của ApxIII giống 50% với cấu
trúc của ApxI và HlyI của vi khuẩn E. coli. Vùng operon mã hóa cho ApxIII
chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng operon mã hóa cho ApxI. Protein
độc tố ApxIII được tiết ra bởi các serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A.
pleuropneumoniae [12], [19].
Độc tố Apx IV
ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã được
phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA [6]. Gen ApxIVA được phát hiện thấy
ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều này chứng tỏ nó có tính
chất đặc trưng cho loài. Chưa có nghiên cứu cụ thể về vai trò của độc tố ApxIV
với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh, song đã có một số công trình

nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo
ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae [6].
Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra
cả ba loại độc tố Apx, phần lớn chỉ có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype
1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra 2 loại độc tố là ApxI và ApxII; các serotype 2; 3;
4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số serotype chỉ tiết ra một loại
độc tố Apx như serotype 10 chỉ tiết ApxI; serotype 7 và serotype 12 chỉ tiết
ApxII [11]. Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi mạnh hay
yếu tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Những serotype sản sinh
ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản
sinh ra độc tố. Theo Inzana và đồng tác giả (1991), A. pleuropneumoniae
serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc
lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan
trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5 [11].

9


Đồng thời chủng A. pleuropneumoniae này được dùng làm giống gốc sản xuất
vaccine và cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các
chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích
thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A.
pleuropneumoniae serotype 5 [1], [2], [3], [19].
1.2.2. Các yếu độc lực khác
Protein màng ngoài
Protein màng ngoài khác nhau giữa các chủng vi khuẩn A.
pleuropneumoniae nhưng có một số loại protein màng ngoài có mặt ở hầu hết
các chủng. Protein màng ngoài đóng vai trò như một thụ thể thu nhận sắt (iron)
và sắt là một yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng của A. pleuropneumoniae
[4].

Kháng nguyên O
Kháng nguyên O hay Lipopolysaccharides (LPS) là thành phần chính
của màng ngoài tế bào vi khuẩn A. pleuropneumoniae, liên quan nhiều đến
quá trình gây độc và có khả năng gây tổn thương đối với mô. LPS có vai trò
quan trọng trong quá trình bám dính của vi khuẩn A. pleuropneumoniae lên tế
bào biểu mô và lớp nhầy khí quản của lợn. Bám dính là hoạt động ban đầu
giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn, rồi từ đó gây bệnh [4].
Kháng nguyên K
`

Kháng nguyên K hay Polysaccharides vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định

đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi
trường nuôi cấy. Lớp vỏ này của A. pleuropneumoniae có độ dày từ 80 –
230 nm tùy thuộc vào các chủng khác nhau. Các chủng A. pleuropneumoniae
độc lực cao có lớp vỏ dày, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng
hoặc dễ dàng bị phá vỡ. LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi
khuẩn lên tế bào biểu mô và lớp màng nhày khí quản của lợn [4].

10


Các protein thu nhận sắt
Khả năng cạnh tranh hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc
lực quan trọng của A. pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật
chủ. Chính protein gắn thụ thể vận chuyển đã giúp cho A. pleuropneumoniae
được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây
nhiễm trùng [4].
1.2.3. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn A. pleuropneumoniae sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn sẽ gắn

vào các tế bào biểu mô trên bề mặt, sau đó tiến sâu vào bên trong các hốc của
hạch amidan, vi khuẩn A. pleuropneumoniae di chuyển xuống đường hô hấp
dưới và tồn tại trong các phế nang, ở đây nó gây ra phần lớn các tổn thương.
Khi vi khuẩn tăng số lượng sẽ giải phóng các độc tố Apx từ lớp màng ngoài
của vi khuẩn có chứa lipopolysaccharides (LPS) (kháng nguyên O). LPS và độc
tố Apx vừa giúp các vi khuẩn gây hại cho các tế bào vật chủ vừa ngăn chặn vi
khuẩn bị phá hủy bởi thực bào. LPS thu hút bạch cầu trung tính đến khởi đầu
quá trình viêm và sau đó bạch cầu trung tính bị phá hủy bởi các độc tố
cytotoxins sản sinh ra lysozymes gây tổn hại mô lân cận. Các tổn thương mô
có thể tiến triển nhanh chóng, lợn bị nhiễm A. pleuropneumoniae sẽ chết trong
vòng 4-12 giờ tiếp xúc [4].
A. pleuropneumoniae không lây nhiễm sang người và không gây ảnh
hưởng đến sức khoẻ cộng đồng. Đường lây lan chính là lây trực tiếp từ lợn bệnh
sang lợn khỏe.
Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có sức đề kháng kém, chỉ tồn tại trong môi
trường tự nhiên trong thời gian ngắn. V i k h u ẩ n A. pleuropneumoniae k h i
s ố n g t rong niêm dịch và môi trường có nhiều chất hữu cơ thì có thể sống
sót trong vài ngày; trong nước sạch ở nhiệt độ 4oC, vi khuẩn có thể sống được
30 ngày. Ngoài ra, trong khí dung vi khuẩn có thể sống sót trong nhiều ngày.
11


Ở mô phổi và chất thải ở nhiệt độ phòng, vi khuẩn có thể tồn tại được trong 4
ngày. Vi khuẩn bị diệt nhanh chóng ở điều kiện khô và các chất sát trùng thông
thường [1], [3].
1.2.4. Gen mã hóa protein ApxIA
Protein ApxIA là protein quy định cấu trúc của độc tố ApxI [15].
Gen mã hóa độc tố ApxIA của A. pleuropneumoniae dài 3069 bp, mã hóa
cho 1022 amino acid. Từ vị trí amino acid 8 đến 652 tạo nên vùng RTX Nterminal domain, từ acid amin 729 đến 845 là vùng gắn Ca 2+ (Ca2+-binding
protein), từ amino acid 739 đến 749 là vùng peptidase_M10_C, từ amino acid

874 đến 1020 là vùng RTX C-terminal domain [11]. Khối lượng phân tử của
protein ApxIA tái tổ hợp khoảng 29 kDa [11].
Theo Shin Min-Kyoung và đtg (2011), vùng RTX C-terminal domain
thuộc ApxIA của App có thể tạo ra tính kháng nguyên và gây đáp ứng miễn
dịch trên 320 lợn thí ngiệm [19].
Năm 2003, Shin S. J. và đtg đã tiến hành chuyển đoạn gen ApxIA vào trong
Saccharomyces cerevisiae và xác định biểu hiện protein ApxIA. Đầu tiên, gen
apxIA được khuếch đại bằng PCR với mồi có chứa BamHI và SalI. Thứ hai,
DNA được cắt với BamHI và SalI được ghép vào vector YEpGPD-TER và
chuyển vào S. cerevisiae 2805. Thứ ba, sau khi nhận dạng được bản sao được
định hướng chính xác, protein 120 kDa Apx IA được biểu hiện trong S.
cerevisiae 2805 và được xác định bởi SDS-PAGE và Western blot [20].
1.3. Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra
Bảo vệ lợn bằng cách tiêm phòng chống A. pleuropneumoniae, tác nhân
gây bệnh viêm màng phổi gặp khó khăn bởi A. pleuropneumoniae có 15 loại
serotype khác nhau [17].

12


Vaccine thương mại chống nhiễm trùng A. pleuropneumoniae chủ yếu
bao gồm toàn bộ tế bào vi khuẩn – vaccine nhược độc. Mặc dù giảm tỷ lệ tử
vong, nhưng miễn dịch bảo hộ thường thất thường hoặc không ổn định. Một số
chủng A. pleuropneumoniae được sử dụng chế tạo các vaccine sống (vaccine
nhược độc) phòng ngừa A. pleuropneumoniae như Serotype 1 chủng 4074,
ATCC 27088, HS25; Serotype 7 chủng AP76, HS93; Serotype 2 chủng C5934;
Serotype10 chủng D13039, Serotype 5 chủng J45 [17], [20].
Để khắc phục những hạn chế này, các vaccin tiểu đơn vị chống A.
pleuropneumoniae đã được phát triển, mỗi loại vaccine chứa một hoặc một tập
hợp các kháng nguyên của vi khuẩn. Các kháng nguyên này tạo nên tính miễn

dịch trong cơ thể và được bảo đảm ổn với các chủng khác nhau. Các loại
vaccine tiểu phần phòng ngừa A. pleuropneumoniae đã được phát triển như
vaccine chứa protein màng ngoài, chứa kháng nguyên K, chứa độc tố Apx I,
Apx II, ApxIII kết hợp protein màng ngoài OMP, chứa ApxI N- terminal,...
[17]. Mặc dù tất cả các nghiên cứu và thử nghiệm đã được thực hiện với tiêm
chủng A. pleuropneumoniae tuy nhiên một loại vaccine bảo vệ hoàn toàn chống
lại tất cả các serotype chưa đạt được thị trường [13], [14].

13


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5a do Công ty thuốc thú
y Đức Hạnh MARPHAVET cung cấp.
Chủng E. coli DH5α và E. coli BL21 (DE3) do Bảo tàng giống chuẩn vi
sinh vật Việt Nam cung cấp.
Vector pGEM của hãng Promega:

Hình 2.1. Sơ đồ vector pGEM®-T Easy của Promega
Vector pET - 28a (+)

Hình 2.2. Sơ đồ vector biểu hiện pET-28a (+)
14


2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ tế bào,

Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên; phòng Công nghệ gen, khoa
Sinh học, trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên và phòng thí nghiệm
của Công ty thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet.
Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2017 đến tháng 04/2018
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen
Nghiên cứu thông tin và thiết kế cặp mồi với mục đích nhân gen ApxIA
được thực hiện qua các bước i) thu thập trình tự nucleotide từ GenBank; ii) thiết
kế cặp mồi; iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng PCR.
Chúng tôi thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen ApxIA dựa trên trình tự gen
ApxIA đã công bố trên GenBank có mã số GQ369732.1. Mồi ApxIA – F và
ApxIA - R được chèn thêm trình tự đoạn enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII
tương ứng.
Mồi đặc hiệu nhân đoạn gen ApxIA (Kích thước dự kiến khoảng 800bp)
ApxIA – F: 5’GCGGATCCGGAGACGACGGTAATGATGTA3’
ApxIA – R: 5’GCAAGCTTTTAAGCAGATTGTGTTAAATAATTACT3’
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype
5a được tách chiết theo quy trình của GenJET Genomic DNA Purfication Kit.

15


Bước

Quy trình

1

Thu hồi 2x109 tế bào vi khuẩn trong ống 1,5 ml bằng cách ly tâm

10 phút, 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi.

2

Hòa tan cặn khuẩn trong 180 µl Digestion Solution. Bổ sung 20 µl
Proteinase K, trộn đều bằng vortex hoặc pipet để thu được hỗn hợp
đồng nhất.

3

Ủ mẫu ở 56oC cho đến khi các tế bào tan hoàn toàn (khoảng 30
phút)

4

Thêm 20 μl dung dịch RNase A, trộn bằng vortex và ủ hỗn hợp
trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

5

Thêm 200 µl Lysis Solution vào mẫu. Trộn đều bằng cách vortex
trong khoảng 15 giây cho đến khi thu được hỗn hợp đồng nhất.

6

Thêm 400 µl ethanol 50% và trộn đều bằng pipet hoặc vortex.

7

Chuyển phần dịch ở bước 6 vào cột “GeneJET Genomic DNA

Purification”. Ly tâm cột 1 phút 6000 vòng/phút, bỏ ống thu chứa
dịch chảy qua. Đặt cột lọc vào ống thu 2 ml mới.

8

Thêm 500 µl Wash Buffer I vào cột lọc, ly tâm 1 phút 8000
vòng/phút, loại bỏ dịch chảy qua đặt cột lọc vào ống thu 2 ml mới

9

Thêm 500 µl of Wash Buffer II vào cột lọc, ly tâm 3 phút 12000
vòng/phút, loại bỏ phần dịch chảy qua và đặt cột lọc vào ống 1,5 ml
mới

10

Thêm vào cột lọc 200 µl Elution Buffer, ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng
, sau đó ly tâm 1 phút 8000 vòng/phút, loại bỏ cột lọc. Giữ mẫu ở
-20oC.

2.2.3. Phương pháp PCR
Gen ApxIA được phân lập từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu có chu trình như sau: 94ºC/3 phút; 30 chu kì: 94ºC/30 giây, 55ºC/30 giây,
72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: Buffer 7,5 μl, dNTPs – 0,3 μl, Mồi xuôi (10pmol/μl) - 0,5 μl, Mồi ngược (10 pmol/μl) 0,5μl, DNA khuôn - 0,5 μl, dH2O -5,7 μl.Tổng thể tích 15μl.

16