Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của Enzyme Acetylcholinesterase từ hồng cầu bò: Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG

TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Luận văn thạc sỹ chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG
Học Viên: Đoàn Văn Thuyết
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Trần Văn Tính
2. PGS.TS
Bùi Phƣơng
Thuận CỦA ENZYME
TINH SẠCH VÀ NGHIÊN
CỨU
TÍNH CHẤT

ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Văn Hoàng
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

HÀ NỘI – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

LỜI CÁM ƠN
Hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn
Hoàng và PGS.TS. Nguyễn Quang Huy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và
Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ thuộc phòng Công nghệ Sinh
học và phòng Công nghệ Hóa sinh/Viện Công nghệ mới/Viện KH-CN quân sự, cùng các
cán bộ Viện Hóa học – Môi trường quân sự/Bộ Tư lệnh Hóa học, những người đã giúp đỡ
tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo cho tôi

điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn này.
Luận văn được thực hiện với kinh phí của đề tài khoa học và công nghệ cấp Viện
KH-CN quân sự, căn cứ theo Hợp đồng số 290/2014/HĐKHCN.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Học viên

Đào Thị Hương Giang

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG
BẢNG VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 2
1.1. Enzyme acetylcholinesterase ............................................................................ 2
1.1.1. Lịch sử phát hiện và vai trò của enzyme acetylcholinesterase ...................... 2
1.1.2. Phân loại enzyme acetylcholinesterase .......................................................... 4
1.1.3. Phân bố và chức năng của enzyme acetylcholinesterase ............................... 5
1.1.4. Cấu tạo của enzyme acetylcholinesterase ...................................................... 6
1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase .......... 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase trên thế giới... 10
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase ở Việt Nam ... 12

1.3. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ của enzyme
acetylcholinesterase .................................................................................................. 13
1.4. Ứng dụng của enzyme acetylcholinesterase ..................................................... 14
1.5. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase .............. 16
1.5.1. Đặc điểm gen mã hóa enzyme acetylcholinesterase ...................................... 16
1.5.2. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase ........... 17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 24
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị....................................................................... 24

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................... 24
2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................... 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................... 25
2.2.1. Phƣơng pháp định lƣợng protein thu đƣợc .................................................... 25
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme acetylcholinesterase ........................ 25
2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase .................................... 27
2.2.4. Đánh giá độ sạch của chế phẩm thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel
polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970) ................................... 28
2.2.5. Phƣơng pháp đông khô .................................................................................. 29
2.2.6. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme acetylcholinesterase ..................... 29
2.2.7. Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số ......................................................... 30
2.2.8. Phƣơng pháp tổng hợp cDNA ........................................................................ 30
2.2.9. Phƣơng pháp PCR .......................................................................................... 31

2.2.10. Điện di trên gel agarose................................................................................ 31
2.2.11. Phƣơng pháp nhân dòng vào vector pGEMT .............................................. 31
2.2.12. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α
.................................................................................................................................. 32
2.2.13. Phƣơng pháp giải trình tự ............................................................................. 33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 34
3.1. Khảo sát hoạt độ của acetylcholinesterase ở một số sinh vật ........................... 34
3.2. Tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò ................................... 34

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

3.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose .................................... 35
3.2.2. Tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75 ............. 36
3.2.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm acetylcholinesterase từ hồng cầu bò bằng
SDS – page. .............................................................................................................. 39
3.2.4. Đông khô chế phẩm enzyme acetylcholinesterase ........................................ 40
3.3. Nghiên cứu một số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò ...... 43
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterarse....... 43
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase ................ 43
3.4. Nhân dòng và giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò ......................... 44
3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp cDNA ................................ 44
3.4.2. Nhân bản gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò ................................................. 44
3.4.3. Nhân dòng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò vào vector pGEM T ............. 45
3.4.4. Giải trình tự của gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò ...................................... 49
KẾT LUẬN...... ........................................................................................................ 55

KIẾN NGHỊ...... ....................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO...... .................................................................................. 57

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Khớp thần kinh – cấu trúc truyền xung thần kinh

3

Hình 1.2

Mô phỏng cấu trúc bậc 4 của AChE

8

Công thức hóa học của một số acid amin tạo thành trung tâm

8

Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5

Hình 1.6

hoạt động của AChE
Sự phù hợp không gian giữa nhóm chức của trung tâm hoạt

8

động với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine
Công thức hóa học của acetylcholine

9

Mô hình trạng thái trung gian tƣơng tác giữa chất truyền thần

10

kinh acetylcholine với enzyme AChE làm lỏng lẻo liên kết CO dẫn đến thủy phân acetylcholine thành choline và acid
acetic

Hình 1.7
Hình 1.8

Cấu trúc gen mã hóa AChE ở một số động vật

17

So sánh trình tự axit amin suy diễn của AChE từ Aedes

18

aegypti (Ad), Anopheles stephensi (An) và Drosophila
melanogaster (Dr)

Hình 1.9
Hình 1.10

Quy trình nhân dòng và biểu hiện AChE của bò

20

So sánh trình tự axit amin của BoAChE với các trình tự

21

AChE khác

Hình 1.11

Quy trình xây dựng plasmid tái tổ hợp pYES-DEST52-AChE

23

Hình 2.1

Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho AChE vào vector pGEM T

32

Hình 3.1

Hoạt độ AChE ở một số đối tƣợng nghiên cứu

34

Sắc ký đồ trao đổi ion qua cột DEAE - Sepharose tinh sạch

35

Hình 3.2
Hình 3.3

AChE từ hồng cầu bò
Sắc ký đồ lọc gel qua cột Sephadex G75 tinh sạch AChE từ

Khóa 2013 – 2015

36


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

hồng cầu bò
Điện di đồ của AChE từ hồng cầu bò sau giai đoạn tinh sạch
Hình 3.4

39

qua cột trao đổi ion DEAE - Sepharose và cột lọc gel
SephadexTM G75

Hình 3.5

Quy trình tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu

42

bò
Hình 3.6

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme AChE

43

Hình 3.7

Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme AChE

44

Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen AChE từ

45

Hình 3.8

máu bò
Sự hình thành các khuẩn lạc sau khi biến nạp hỗn hợp gắn

Hình 3.9

46

đoạn gen hóa AChE và vector pGEMT vào E. coli chủng
DH5α

Hình 3.10

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector

47

pGEM-AchE

Hình 3.11

Kết quả điện di sản phẩm plasmid pGEM- AChE

48

Hình 3.12

Kết quả PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE

48

So sánh trình tự gen AChE trong nghiên cứu và trình tự

50

Hình 3.13

AChE của bò đã đƣợc công bố trên thế giới
(NM_001076220.1)

Hình 3.14
Hình 3.15
Hình 3.16
Hình 3.17

Phân tích vị trí cắt của các enzyme giới hạn có trên trình tự

50

gen AchE
Các vị trí glycosyl hóa và vị trí hình thành cầu nối disunfua

51

của AChE của bò
Trình tự acid amin enzyme AChE của bò với các vị trí trung

52

tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn
Trình tự acid amin enzyme AChE của ngƣời với các vị trí

Khóa 2013 – 2015

52


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

trung tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn
Hình 3.18

So sánh trình tự gen AChE trong nghiên cứu và trình tự

54

AChE của ngƣời đã đƣợc công bố trên thế giới (M55040.1)

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Thành phần hỗn hợp phản ứng của bộ kit Biovision

26

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR

31

Kết quả thu đƣợc qua các bƣớc tinh sạch AChE từ

37

Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3

Bảng 3.4

Khóa 2013 – 2015

hồng cầu bò
Một số kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme AChE

38

Kết quả đông khô các phân đoạn protein sau sắc ký

40

trao đổi ion
Thành phần phản ứng ligase AChE vào vector
pGEM T

46


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

DANH MỤC VIẾT TẮT
ACh

Acetylcholine

AChE

Acetylcholinesterase

AchI

Acetylthiocholine iodide

BVTV

Bảo vệ thực vật

BchE

Butyrylcholineserase

CAT

Chloramphenicol acetyl-transferase

CB

Carbamate

CBB

Coomassie brilliant blue

cDNA

Complementary DNA (DNA bổ trợ)

ChE

Cholinesterase

ChOH

Choline

CM-cellulose

Carboxymethyl-cellulose

CNS

Hệ thống thần kinh trung ƣơng

DEAE-cellulose

Diethylaminoethyl-cellulose

DTNB

Chất sinh màu 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

EPA

Tổ chức bảo vệ môi trƣờng Mỹ

GA

Tabun

GB

Sarine

GD

Soman

GF

Xyclo sarine

HEK-293

Tế bào 293 phôi thận của ngƣời

kDa

Kilodalton

OP

Các hợp chất thuốc trừ sâu phospho hữu cơ

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng
hợp)

RBCs

Tế bào máu đỏ

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sinap

Khớp thần kinh

Tacrine

9-Amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine

Tm-melting

Nhiệt độ biến tính

Khóa 2013 – 2015


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

MỞ ĐẦU
Enzyme acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) là một enzyme đóng vai trò
quan trọng trong truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh động vật. Enzyme
acetylcholinesterase (AChE) tập trung trong các mô thần kinh, cụ thể trong các
khớp thần kinh (sinap) nơi có các liên hệ chuyên trách giữa các đầu của sợi tế bào
thần kinh hay giữa các tế bào thần kinh và các tế bào của các cơ quan (nhƣ các
tuyến, các cơ…) [68].
Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian
phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên các chất này dễ dàng kết hợp với
AChE với vai trò là chất ức chế cạnh tranh. Khi đó enzyme sẽ bị ức chế do sự tạo
thành phức chất trung gian giữa enzyme – chất ức chế khá bền, vì vậy enzyme sẽ bị
mất hoạt tính rất nhanh. Dựa trên tính chất của chất ức chế, thông qua việc xác định
độ giảm hoạt độ AChE có thể nghiên cứu sử dụng AChE làm phƣơng tiện phân tích,
phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ [48, 68].
Trong đời sống, AChE đƣợc ứng dụng để sản xuất ra các phƣơng tiện phát
hiện nhanh thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ tồn dƣ trong môi
trƣờng, nông sản, rau quả. Ngoài những ứng dụng trong đời sống sinh hoạt thì việc
nghiên cứu khai thác và ứng dụng AChE để chẩn đoán phát hiện phospho hữu cơ
cũng đƣợc ứng dụng rộng rãi vào mục đích an ninh quốc phòng [68].
Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về tính chất của
AChE cũng nhƣ các nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch enzyme này. Tuy
nhiên, việc tách chiết AChE bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế
nhất định về hiệu suất, hoạt độ, kinh phí và đặc biệt là các điều kiện tiến hành thực
nghiệm trong phòng thí nghiệm còn gặp nhiều khó khăn trong việc tinh sạch. Vì
vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzyme
acetylcholinesterase từ hồng cầu bò” nhằm xây dựng một quy trình tinh sạch
AChE hiệu quả từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền và phổ biến.

Khóa 2013 – 2015

1


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Enzyme acetylcholinesterase

1.1.1. Lịch sử phát hiện và vai trò của enzyme acetylcholinesterase
Vào năm 1914, Dale phát hiện trong máu có loại enzyme làm xúc tác cho
sự thủy phân acetylcholine (ACh) – một chất dẫn truyền xung thần kinh trong các
mô thần kinh [24]. Sau đó nhiều nghiên cứu chứng tỏ sự phổ biến rộng rãi của
enzyme này trong các mô khác nhau của động vật và đƣợc gọi là cholinesterase
(ChE).

Nhóm

enzyme

này

bao

gồm

acetylcholinesterase

(AChE)

và

butyrylcholinesterase (BuChE) có khả năng thủy phân các cơ chất acetylcholine và
butyrylcholine để cùng tạo ra choline [68].
Chức năng chính của ChE là thủy phân nhanh ACh tiết ra, dẫn truyền
xung thần kinh. Qua nghiên cứu ngƣời ta phát hiện ra rằng sự thủy phân ACh nhờ
enzyme còn đƣợc thực hiện ở các cơ quan khác nhƣ trong mô của cơ, trong gan,
trong tuyến tụy [68]…Ý nghĩa sinh lý của ChE trong các mô này đến nay vẫn chƣa
xác định đƣợc một cách rõ ràng. Một số tác giả cho rằng ChE của hồng cầu đóng
vai trò quan trọng trong sự thấm của màng tế bào. Có tác giả lại cho rằng ChE của
máu và các mô khác đóng vai trò nhƣ một loại enzyme “thay thế” trong trƣờng hợp
ACh tiết ra đáng kể vào máu thì kích thích lại hệ thống thần kinh [48].
AChE giữ vai trò quan trọng đặc biệt trong hoạt động thần kinh, đó là
thủy phân ACh - vật liệu truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh ngoại biên và hệ
thần kinh trung ƣơng ở nhiều cơ thể trong đó có cơ thể ngƣời. ACh đƣợc tổng hợp
chủ yếu trong các nơron từ choline và acetyl - CoA do enzyme choline
acetyltransferase xúc tác cho quá trình này.

Khóa 2013 – 2015

2


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

Hình 1.1. Khớp thần kinh – cấu trúc truyền xung thần kinh [67]
ACh làm nhiệm vụ dẫn truyền xung thần kinh từ màng trƣớc synap của tế
bào truyền xung (nơron truyền) vào màng sau synap của một tế bào ở trạng thái tĩnh
(nơron nhận xung) (Hình 1.1) [67]. ACh nằm trong các túi ở axon, chờ khi nhận
đƣợc các xung thần kinh thì chuyển vào vùng đệm của khớp để truyền cho bộ phận
nhận nằm ngay trên mặt của dendrite làm nhiệm vụ gửi những thông điệp chuyển
mệnh lệnh hoạt động cho các cơ bắp. Tác dụng truyền đạt của ACh chỉ phát huy
hiệu lực trong thời gian ngắn, khoảng 10-3s, bởi màng tế bào phải nhanh chóng hồi
phục để tiếp nhận xung mới. Khi ACh hoàn thành, enzyme AChE đã nằm sẵn trong
vùng đệm của khớp chịu trách nhiệm làm mất tác dụng của ACh và nhanh chóng
tách chúng ra khỏi hệ thống thần kinh bằng cách phá vỡ để giải phóng choline và
acetate [66].
AChE
Acetylcholine

Choline
+

+

Acetate

Nếu AChE bị ức chế, thì vật liệu truyền tín hiệu thần kinh ACh không bị
phá vỡ, khi đó ACh không bị phá vỡ thì chúng liên tục truyền tín hiệu làm cho cơ
bắp không thể nghỉ, co thắt liên tục dẫn đến liệt và các vấn đề sinh lý bất lợi khác.
Ngƣợc lại, nếu AChE có hoạt tính quá mạnh thì luôn luôn phá vỡ các acetylcholine
trƣớc khi hoàn thành nhiệm vụ. Do đó, các tín hiệu thần kinh không kịp truyền đi từ

Khóa 2013 – 2015

3


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

axon làm cho dendrite não bộ không nhận đƣợc tín hiệu và không ghi nhận đƣợc
thông tin, gây nên bệnh lãng quên „Alzeimer hay mất trí nhớ‟ [58, 69, 74, 79].
1.1.2. Phân loại enzyme acetylcholinesterase
Trong hệ thống phân loại, AChE đƣợc xếp vào nhóm các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân este carboxyl (EC 3.1.1 Carboxyl este hydrolases) thuộc lớp
enzyme thủy phân Hydrolase. AChE có ký hiệu phân loại là EC 3.1.1.7.
Phản ứng đặc hiệu của AChE là thủy phân ACh tạo thành choline và
acetate với tốc độ 25.000 phân tử acetylcholine trong 1 giây
Acetylcholine + H2O  choline + acetate
Enzyme này có tên phân loại là acetylcholine acetylhydrolase và còn có
các

tên

gọi

khác

nhau

nhƣ:

Choline

esterase

I,

cholinesterase,

acetylthiocholinesterase, acetylcholine hydrolase.
Trong nghiên cứu ChE của các mô khác nhau, ngƣời ta phát hiện thấy còn
một enzyme nữa, có thể thủy phân cơ chất khác acetylcholine (thủy phân
acylcholine) nhƣng cũng cho sản phẩm là choline. Để phân biệt, ngƣời ta gọi
enzyme thủy phân acetylcholine là “Cholinesterase thật”. Enzyme thứ 2 thủy phân
acylcholine đƣợc gọi là „Cholinesterase giả‟ [72] với phản ứng đặc hiệu :
Acylcholine + H2O  choline + carboxylate
„Cholinesterase giả‟ thƣờng đƣợc gọi là Butyrylcholinesterase (BuChE)
với ký hiệu EC 3.1.1.8. Ngoài tên phân loại là acetylcholine acylhydrolase, enzyme
này còn có các tên khác nhƣ : anticholinesterase, benzoycholinesterase, non-specific
cholinesterase, propionylcholinesterase.
„Cholinesterase thật‟ có trong hồng cầu và mô não, thủy phân
acetylcholin và acetyl-β-metylcholin một cách dễ dàng nhƣng không thủy phân
đƣợc benzoycholine. Trong khi đó „cholinesterase giả‟ tìm thấy trong gan, ruột, tim
và máu có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính đối với acetyl-β-metylcholin
nhƣng thủy phân benzoycholin và acetylcholin một cách rất dễ dàng.

Khóa 2013 – 2015

4


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

AChE – „Cholinesterase thật‟ và BuChE –„cholinesterase giả‟ liên quan
chặt chẽ đến độc tính của thuốc trừ sâu phospho hữu cơ do các hợp chất phospho
hữu cơ có cấu trúc không gian phù hợp với cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE.
Đây là một trong các điều kiện để chúng cạnh tranh với cơ chất và kết hợp với trung
tâm hoạt động của enzyme, do đó làm mất hoạt tính của enzyme. Dựa vào tính chất
này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất ra nhiều hợp chất phospho hữu cơ
dùng làm chất độc thần kinh sử dụng trong chiến tranh, làm thuốc trừ sâu BVTV.
1.1.3. Phân bố và chức năng của enzyme acetylcholinesterase
ChE có mặt rộng rãi ở hầu hết các loài động vật [27]. Sự hiện diện của
chúng phổ biến ở các loài côn trùng và các loài động vật không xƣơng sống khác có
các tác nhân kháng ChE. Sự tƣơng đồng trong cấu trúc phân tử của ChE ở các loài
động vật không xƣơng sống đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều loài động vật nhƣ giun tròn
[23], mực [75] và lƣỡng cƣ [61].
AChE điều hòa ức chế sự dẫn truyền xung thần kinh. Chúng đƣợc tìm thấy
ở các khớp thần kinh, cơ thần kinh, cầu nối cơ-gân, trong dịch não tủy và hệ thống
thần kinh trung ƣơng (CNS) tổ chức tế bào thần kinh, sợi trục thần kinh, cơ vân và
cơ trơn [68]. Ngoài ra, đã có nghiên cứu phát hiện thấy AChE có trong nƣớc bọt
[37].
AChE cũng có mặt trong hồng cầu của động vật có vú, tiểu cầu, tế bào
lympho tuy nhiên hoạt tính rất thấp [39, 60, 82]. Hoạt tính của AChE trong máu của
ngƣời bị hạn chế bởi những yếu tố hình thành nó, phần lớn là các tế bào hồng cầu
[80]. AChE huyết tƣơng của các loài có xƣơng sống khác và một số loài động vật
có vú cũng đƣợc tìm thấy, tuy nhiên rất khó xác định đƣợc hoạt tính [13-15]. Ví dụ
AChE đƣợc tìm thấy trong huyết tƣơng của các loài động vật gặm nhấm nhƣ chuột
nhƣng hoạt tính thấp hơn nhiều so với BuChE [77].
Hoạt tính AChE cũng đƣợc tìm thấy trong huyết thanh của phôi động vật
có vú và các loài chim. Hoạt tính này giảm xuống ở động vật trƣởng thành sau khi

sinh. Hoạt tính AChE trong huyết thanh của thai bê đƣợc xác định là cao, đủ để

Khóa 2013 – 2015

5


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

dùng làm nguồn tinh sạch enzyme [26]. Ngƣợc lại, trong máu bò trƣởng thành có
lƣợng AChE hồng cầu tƣơng đối cao và rất thấp trong huyết tƣơng [82]. Ở các loài
khác có nhiều loại ChE khác nhau, đầu tiên đƣợc phát hiện bởi các cơ chất và chất
ức chế đặc hiệu và gần đây là dựa trên sự phân tích DNA [18].
Chức năng sinh lý của ChE hồng cầu và huyết thanh vẫn chƣa đƣợc
nghiên cứu kỹ. Có khả năng là các ChE trong máu đã phát triển để bảo vệ cơ thể
khỏi những tác nhân kháng ChE tự nhiên. Một số độc tố thực vật có thể ức chế hoạt
động của ChE bao gồm những glycoalkaloids họ cà, các steroid có mặt tự nhiên
trong khoai tây và một số thực vật khác [46] và territrems của nấm [21]. Một số
chất kháng ChE khác có trong tự nhiên nhƣ fasciculin từ nọc độc của rắn [50],
chaconine và solancine từ các loại củ, cây cà dƣợc [57], và huperzine từ rêu [59].
Việc nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kháng ChE đến hoạt động của enzyme
giúp xác định vai trò của ACh và AChE trong hệ thống thần kinh.
ChE ở các mô có thể có tính đặc hiệu nhƣng vẫn chƣa đƣợc biết đến ngoài
vai trò tham gia vào dẫn truyền xung thần kinh. Có một bằng chứng về sự tham gia
của các ChE vào quá trình hình thành sợi trục thần kinh dựa trên các nghiên cứu về
tế bào võng mạc, hạch rễ lƣng và phôi, các sợi oligolucleotide sense và antisense,
cùng với các chất ức chế [7, 22, 71]. Chức năng của AChE và BuChE có thể trùng
nhau. BuChE giống nhƣ bản sao lƣu AChE trong việc hỗ trợ và điều tiết trong hệ

cholinergic, có vai trò dự phòng khi AChE bị tổn thƣơng hoặc vắng mặt. Nghiên
cứu sự phát triển của con chuột bị đột biến mất gen AChE chỉ ra rằng các enzyme
khác nhƣ BuChE có thể thay thế AChE [47].
1.1.4. Cấu trúc của enzyme acetylcholinesterase
Các nghiên cứu về AChE cho thấy bản chất của AChE là một phân tử
protein có cấu trúc bậc 4 và trên bề mặt có trung tâm hoạt động đóng vai trò xúc tác
[65, 73].
 Cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE

Khóa 2013 – 2015

6


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

Nghiên cứu về cơ chế xúc tác của AChE đối với cơ chất, đã chứng minh
đƣợc rằng trung tâm hoạt động của AChE có nhóm anion đóng vai trò quan trọng
trong xúc tác của enzyme, nhóm này không chỉ thực hiện chức năng cố định cơ
chất khi tƣơng tác với đầu cation của cơ chất ACh mà tƣơng tác của nhóm này với
cơ chất còn làm biến đổi cấu trúc protein trong vùng trung tâm hoạt động theo
hƣớng tạo điều kiện cho sự tạo thành các liên kết khác với phân tử cơ chất cần thiết
cho hiệu ứng xúc tác. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng nếu trong trung tâm
hoạt động của AChE có một nhóm anion thì điện tích bằng -1 còn nếu có 2 nhóm
thì điện tích bằng -2.
Trung tâm hoạt động của AChE có các gốc serin, histidin và tyrosin. Sự
sắp xếp của các gốc này chƣa rõ ràng, nhƣng vị trí tyrosin và serin rất xa nhau trong
mạch polypeptide. Bộ ba xúc tác trong trung tâm hoạt động của AChE ở Torpedo

californica là Glutamate ở vị trí 334 (Glu334), histidin ở vị trí 447 (His447) và Serin ở
vị trí 203 (Ser203) [32]. Túi acyl là Phenylalanin ở vị trí 295 (Phe295) và
Phenylalanin ở vị trí 297 (Phe297). Trong cấu tạo các tiểu đơn vị thì Tryptophan ở vị
trí 86 (Trp86), Glutamat ở vị trí 202 (Glu202) và Tyrosin ở vị trí 72 (Tyr72), Các axit
amin Tyrosin ở vị trí 124 (Tyr124) và Aspactat ở vị trí 74 (Asp74), Tyrosin ở vị trí
341 và 449 (Tyr341, Tyr449) có vai trò làm ổn định cấu trúc của enzyme.
Phần thứ hai trong trung tâm hoạt động của AChE là phần esterase. Chức
năng chủ yếu của phần này là thủy phân acetylcholine. Phần esterase đƣợc cấu tạo
không những bởi các axit amin mạch nhánh trong mạch polypeptide xếp gần nhau
mà còn do sự bố trí xa gần của các nhóm tạo thành cấu trúc bậc 2 hoặc 3. Sở dĩ hoạt
tính của enzyme mất đi hoặc bị giảm có lẽ do sự thay đổi cấu trúc bậc 2 hoặc 3 này.
Trong phần esterase, còn có nhóm phân tử của các gốc axit amin cho proton và
nhóm nhận proton. Các nhóm này có thể là Hydroxyl của tyrosin và nhóm imidazol
của Histidin. Phân tử ChE có trục đối xứng nhất định, nó có thể chuyển từ trạng thái
này sang trạng thái khác khi phản ứng với cơ chất, chất hoạt hóa hay chất ức chế
theo nguyên lý cảm biến trung tâm xúc tác [16].

Khóa 2013 – 2015

7


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

Cấu trúc không gian ba chiều và công thức hóa học của một số axit amin
trong trung tâm hoạt động của AChE (hình 1.2 và hình 1.3).

Hình 1.2. Mô phỏng cấu trúc bậc 4 của

Hình 1.3. Công thức hóa học của một số

AChE [32]

axit amin tạo thành trung tâm hoạt động
của AChE [32]

Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động
của AChE với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine (Acetylcholine là cơ chất
đặc hiệu của AChE) đƣợc thể hiện ở hình 1.4.

Hình 1.4. Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức của trung tâm hoạt động với
các nhóm của cơ chất acetylcholine [85]
Vị trí gắn (COO-) nơi mà N+ của cơ chất đƣợc gắn vào theo liên kết tĩnh
điện; Vị trí xúc tác: nơi hoạt động chính của cholinesterase với các gốc Ser, Tyr,
His; Cơ chất là acetylcholine đƣợc liên kết vào vị trí gắn bằng liên kết giữa COOtích điện âm (của vị trí gắn) với N+ của cơ chất.

Khóa 2013 – 2015

8


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

Hình 1.5. Công thức hóa học của acetylcholine
 Cơ chế xúc tác của AChE
Trung tâm hoạt động của enzyme chứa hai phần với những nhóm chức

khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau trong quá trình xúc tác thủy phân
acetylcholine:
+ Phần anion tích điện âm: có nhóm COO- nơi mà N+ của cơ chất đƣợc
gắn vào theo liên kết tĩnh điện.
+ Phần esterase có các gốc Ser, Tyr, His với chức năng xúc tác thủy phân
là nơi họat động chính của AChE.
Để chuẩn bị cho quá trình thủy phân: phần N+ của cơ chất acetylcholine
đƣợc gắn vào phần anion có COO- tích điện. Phần –CH2-O-C-O-CH3 của cơ chất
đƣợc gắn vào phần esterase cùng phân tử nƣớc để thực hiện xúc tác thủy phân.
Trong quá trình phản ứng, proton đƣợc phân ly từ nhóm phenol của Tyr sẽ
kết hợp với oxy trong nhóm rƣợu của cholin, nhờ đó sinh ra điện tích dƣơng tại C
của nhóm acetyl trong cơ chất. Carbon này sẽ bị hút bởi oxy tích điện âm của nhóm
rƣợu đã phân ly của Ser trong trung tâm hoạt động. Liên kết giữa C và O bị đứt ra
và acetyl đƣợc giải phóng sẽ phản ứng với Ser ở dạng trung gian tạm thời
acetylserin. Proton bắn ra từ Ser đƣợc hút tới oxy tích điện âm của nhóm phân ly từ
tyrosin, nhóm hydroxyl đƣợc hình thành cùng với sự phục hồi trạng thái ban đầu
của tyrosin trong trung tâm hoạt động.
Sự thủy phân đƣợc bắt đầu bằng sự phân ly của phân tử H2O: H+ đƣợc hút
tới nitơ của nhóm imidazol của His, nhóm OH- đƣợc tự do và tấn công liên kết ester

Khóa 2013 – 2015

9


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

đƣợc hình thành tạm thời của acetylserin. Quá trình này giải phóng phân tử acetate.

H+ vốn liên kết tạm thời với nitơ ở imidazol đƣợc giải phóng và gắn trở lại O- của
Ser. Trạng thái ban đầu của cả ba gốc amino acid trong trung tâm hoạt động đƣợc
phục hồi. Choline và acetate đƣợc giải phóng ra khỏi trung tâm bởi khoảng cách
giữa các gốc chức năng đó. Sự thủy phân ACh đƣợc diễn ra từ phản ứng liên hiệp
của tất cả các nhóm chức ở vị trí xúc tác trong trung tâm hoạt động. Tiến trình phản
ứng chịu ảnh hƣởng bởi khoảng cách giữa các gốc axit amin chứa các nhóm chức
năng đó (hình 1.6).

Hình 1.6. Mô hình trạng thái trung gian tƣơng tác giữa chất truyền thần
kinh acetylcholine với enzyme AChE [86]
Các nghiên cứu cũng cho thấy phản ứng diễn ra một cách bình thƣờng nếu
nhóm imidazol nằm cách nhóm COO- của acetyl 0,5nm và nếu gốc tyrosin nằm
cách Ser 0,25 nm.
1.2.

Tổng quan về các phƣơng pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase

1.2.1. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase trên thế giới
Acetylcholinesterase đƣợc phát hiện trong nhiều cơ thể sinh vật từ bậc
thấp tới bậc cao nhƣ nhuyễn thể, sò, cá, ngan, gà, thỏ, chuột, ngựa, bò...và ở ngƣời
[39, 60, 82]. Trong cơ thể, AChE không chỉ có ở mô thần kinh mà còn có ở các mô
khác nhƣ: mô cơ,...và trong huyết thanh, hồng cầu [10].
Do có nhiều ứng dụng trong đời sống, trên thế giới, AChE đƣợc nghiên
cứu tách chiết từ rất sớm. Để đạt đƣợc độ tinh sạch và hoạt độ phù hợp cho các mục
đích khác nhau, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tinh sạch enzyme từ các

Khóa 2013 – 2015

10

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

nguồn khác nhau. Các phƣơng pháp tinh sạch đều dựa trên cơ sở tách chiết protein.
Một trong các phƣơng pháp thông dụng nhất là sử dụng phƣơng pháp kết tủa phân
đoạn protein nhằm thu đƣợc chế phẩm enzyme thô, sau đó sử dụng sắc ký để tinh
sạch loại enzyme mong muốn [27]. Chế phẩm enzyme có độ sạch cao đƣợc thu
nhận từ các nguồn khác nhau và đã có chế phẩm bán trên thị trƣờng. Ban đầu,
enzyme AChE đƣợc tách chiết từ một số loài cá nhƣ cá đuối điện Porpedo
marmorata [19], cá chình điện Electrophorus electricus [76]. Hiện nay AChE dạng
hòa tan ở chuột đã đƣợc tinh sạch bởi phƣơng pháp sắc ký ái lực sử dụng
trimethylamineophenyl liên kết với Sepharose thông qua axit succinic và
diaminodipropylamine và có hoạt độ riêng là 2,2 U/mg [50, 76].
Sử dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch AChE từ gan cừu với cột
concanavalin A-Sepharose 4B và cột edrophonium Sepharose 6B. Kết quả tinh sạch
thu đƣợc chế phẩm AChE có một hoạt độ riêng là 21 U/mg với độ sạch 842 lần
[44]. AChE từ Channa micropeltes cũng đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên
procainamide–Sephacryl S-1000. Chế phẩm AChE thu đƣợc có hoạt độ riêng là
793,6 U/mg hiệu suất 91,12% [53]. Cũng bằng sắc ký ái lực, AChE từ Puntius
javanicus đƣợc tinh sạch có hoạt độ riêng 1,92 U/mg, độ sạch 8,48 lần. Ji YS và tập
thể đã tinh sạch AChE ở não chim cút Nhật Bản bằng sắc ký ái lực trên
concanavalin A-Sepharose và edrophonium-Sepharose. Chế phẩm thu đƣợc có hoạt
độ riêng là 2500 U/mg protein với độ sạch tăng 10416 lần [41].
Một trong những phƣơng pháp tinh sạch AChE đƣợc sử dụng nhiều nhất
là tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Sephadex kết hợp với sắc ký trao đổi ion DEAEcellulose. AChE từ Oreochromis aurea hay AChE từ mầm đậu cô ve (P. Vulgaris)
đƣợc tinh sạch bằng sắc ký lọc gel có hoạt độ riêng lần lƣợt là 20,6 U/mg và 31,5
U/mg độ sạch tƣơng ứng tăng là 139 lần và 39,3 lần [78, 81]. Tinh sạch AChE ở các
phần khác nhau của ấu trùng Philosamia ricini bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-100

thu đƣợc chế phẩm AChE ở phần đầu có hoạt độ riêng cao nhất là 16,2 ± 0,2 U/mg
[4]. AChE từ não thỏ đƣợc tinh chế qua sắc ký cột sephadex G - 50 và sắc ký trao

Khóa 2013 – 2015

11


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

đổi ion qua cột CM-cellulose có hoạt độ riêng là 5 U/mg với độ sạch 166 lần [51].
Tinh sạch AChE từ hồng cầu ngƣời sử dụng 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine thu
đƣợc với hiệu suất 23,5%, với hoạt độ riêng là 9,2 EU/mg (endotoxin units/mg
protein) [33].
Gần đây, AChE thu nhận từ cá điện và hồng cầu ngƣời đƣợc tinh sạch
bằng sắc ký ái lực và kỹ thuật DNA tái tổ hợp nên chế phẩm enzyme thu đƣợc có
hoạt độ riêng rất cao. Ở Isarel, bằng cách sử dụng phối hợp sắc ký trao đổi ion và
sắc ký ái lực, Fisher và cộng sự đã thu đƣợc chế phẩm AChE ở hồng cầu ngƣời có
hoạt độ riêng 4572 U/mg [29].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase ở Việt Nam
AChE bắt đầu đƣợc nghiên cứu từ năm 1960 ở Trƣờng Đại học Y Hà Nội,
Học viện Quân y 103 và một số đơn vị nghiên cứu khoa học khác. Kết quả nghiên
cứu của các cơ sở này mới chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát ảnh hƣởng của các loại
hóa chất, độc tố tới hoạt độ của AChE lên động vật và con ngƣời. Dựa vào sự thay
đổi hoạt độ AChE trong máu để chẩn đoán một số bệnh về gan và nhiễm độc thuốc
trừ sâu [2].
Bộ thuốc thử KIT-B, KIT-BM đã đƣợc Binh chủng Hóa học – Bộ Quốc
Phòng tổ chức nghiên cứu chế thử và thử nghiệm. Hiện nay, bộ thuốc thử này đã

đƣợc sản xuất để thay thế bộ thuốc thử của Liên bang Nga nhờ có tính năng tƣơng
đƣơng. Một thành phần quan trọng trong bộ thuốc thử này chính là enzyme
cholinesterase (ChE).
Viện Hóa học – Môi trƣờng Quân sự bắt đầu đi vào nghiên cứu ChE với
mục đích khảo sát nguồn nguyên liệu, xác lập quy trình tách chiết ChE tạo chế
phẩm phục vụ cho việc phòng chống chiến tranh hóa học. Kết quả bƣớc đầu trong
các công bố đã xác lập đƣợc quy trình xác định hoạt độ ChE và quy trình tách chiết
enzyme này ở dạng đông khô từ huyết thanh ngựa, chế phẩm thu đƣợc có hoạt tính
xấp xỉ 130 U/mg protein. Tuy nhiên quy trình tách chiết này rất phức tạp và hiệu
suất thu hồi ChE là chƣa cao, vì vậy việc sản xuất các kit thử nói trên còn gặp nhiều

Khóa 2013 – 2015

12


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

khó khăn [1].
Tác giả Lê Minh Trí đã tiến hành tinh sạch AChE từ huyết thanh của ngan
và ốc bƣơu vàng bằng phƣơng pháp sắc ký cột CM - cellulose và sắc ký cột DEAE cellulose, bƣớc đầu đã xác định đƣợc hoạt độ của AChE ở huyết thanh ngan là
1402,72 U/l và ở ốc bƣơu vàng là 686 ± 5 U/g [2, 3].
Ở Việt Nam, nhìn chung chƣa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất
AChE. Các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tách enzyme này từ
các nguồn tự nhiên, khảo sát các tính chất lý-hóa và hoạt tính sinh học của chúng.
Ngoài ra, việc sử dụng AChE ở Việt Nam vẫn còn hạn chế do nguồn cung chƣa đủ
và thiếu ổn định.
Việc tách chiết ChE bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế

nhất định về hiệu suất, hoạt độ riêng và đặc biệt là việc sử dụng các phƣơng pháp
hiện đại rất khó có thể tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nƣớc ta hiện
nay. Ngoài ra, việc tinh sạch AChE từ tự nhiên có những nhƣợc điểm nhƣ sau:
+ Độ ổn định thấp, phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu.
+ Khó sản xuất với quy mô lớn đo hiệu suất thấp và không chủ động nguồn
nguyên liệu.
+ Quy trình phức tạp qua nhiều giai đoạn do đó enzyme thƣờng bị mất hoạt
tính cũng nhƣ bị mất qua các bƣớc tinh sạch.
1.3.

Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ của

enzyme acetylcholinesterase
Nhiệt độ và pH có ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt độ của enzyme. Nếu đƣa
nhiệt độ lên cao hơn nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm đi. Mỗi enzyme
có một pH tối ƣu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 - 2), hoặc rất kiềm (9,5 - 10).
Tuy nhiên, pH tối ƣu của đa số enzyme nằm trong khoảng giá trị trung tính (6 - 8).
Trong sản xuất chế phẩm AChE vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến những
yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme. Giống nhƣ các enzyme khác, AChE cũng
chịu ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố trong đó có nhiệt độ và pH. Vì vậy, việc nghiên

Khóa 2013 – 2015

13


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Đào Thị Hương Giang

cứu ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ, pH lên hoạt độ AChE nhằm tạo cơ sở cho
việc nghiên cứu cũng nhƣ sản xuất chế phẩm AChE lâu dài.
Tác giả Lê Minh Trí đã nghiên cứu nhiệt độ và pH tối ƣu của AChE tinh
sạch từ đối tƣợng ốc bƣơu vàng là 30oC và pH 7,5 [3].
Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt
độ, pH đến hoạt độ của enzyme AChE. Ví dụ AChE đƣợc tinh sạch từ Bungarus
sindanus có pH tối ƣu 8,5; nhiệt độ tối ƣu 45oC [5]. AChE tinh sạch từ Pardosa
astrigera và P. vulgaris hoạt động tối ƣu ở pH 7,5, nhiệt độ 30oC [52, 78]. Chế
phẩm AChE tinh sạch từ Channa micropeltes, Oreochromis aurea có pH và nhiệt
độ tối ƣu giá trị lần lƣợt là 7; 7,5 - 8; 30oC, 35 - 40oC [53, 81].
Tác giả A.Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ
lên hoạt độ của AChE tinh sạch từ Philosamia ricini. Kết quả cho thấy trong điều
kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm 25 ± 3oC, pH tối ƣu là 8 (AChE phần đầu và thể
mỡ). Tuy nhiên Philosamia ricini trong điều kiện stress nhiệt khoảng 7 ngày, pH
tối ƣu dao động 7 - 8 với AChE tinh sạch ở phần đầu, ở thể mỡ pH tối ƣu dao động
trong phạm vi lớn hơn 6 - 8. Có thể kết luận, AChE đƣợc tinh sạch từ Philosamia
ricini nuôi trong điều kiện stress nhiệt thay đổi theo hƣớng pH có tính axit [4].
Ngoài ra, tác giả Caio RD và tập thể đã khảo sát ảnh hƣởng của pH và
nhiệt độ lên hoạt độ AChE tinh sạch từ Colossoma macropomum sử dụng các đệm
citrate-HCl (2,5 - 4,5), citrate-phosphate (4 - 7,5), Tris-HCl (7,2 - 9) và nhiệt độ
thay đổi từ 5 đến 70oC trong 180 giây. Kết quả cho thấy AChE có nhiệt độ tối ƣu
45oC ở pH tối ƣu 7 - 8 [12].
1.4.

Ứng dụng của enzyme acetylcholinesterase
Với cơ chất đặc biệt là acetylcholine, AChE đƣợc ứng dụng trong các

lĩnh vực hoạt động thần kinh nhƣ sau:


Dựa vào tính chất ức chế của AChE, các nhà khoa học đã tổng

hợp đƣợc nhiều loại chất ức chế là những chất độc hóa học có tác dụng tới hệ
thần kinh sử dụng trong chiến tranh hoặc dùng làm thuốc trừ sâu BVTV. Các hợp

Khóa 2013 – 2015

14