Nghiên cứu chức năng của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (10.79 MB, 68 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------z--
Trần Quốc Đạt
NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4
LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ
BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI - 12/2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trần Quốc Đạt
NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4
LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ
BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số
: 8420101.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Trọng Tuệ
PGS. TS. Võ Thị Thương Lan
HÀ NỘI - 12/2019
LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện thành công luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.
Nguyễn Trọng Tuệ - Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội và PGS.TS.
Võ Thị Thương Lan – Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN
– những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và
kinh nghiệm quý báu, cho tôi những hành trang để bước vào nghề, bước vào sự
nghiệp nghiên cứu khoa học của mình. Họ cũng là những người thầy, người cô
mang đến cho tôi tình yêu và niềm đam mê khoa học, luôn nhắc nhở, bảo ban và
động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS Matsamitsu Yamaguchi và
nhóm nghiên cứu ruồi giấm tại Khoa Sinh học Ứng dụng, Học viện Công nghệ
Kyoto– người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và trao đổi ngắn hạn
tại Nhật Bản. Thầy cũng là người hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thu thập các dòng
ruồi giấm cần thiết cho nghiên cứu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết
bị để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, lãnh đạo Trung tâm Nghiên
cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học
tập và nghiên cứu.
Trong thời gian thực hiện luận văn, tôi cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp
đỡ và động viên của các anh chị thuộc nhóm nghiên cứu ứng dụng mô hình ruồi
giấm và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại
học Y Hà Nội.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè
đã luôn giúp đỡ, ủng hộ và động viên tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận
văn này.
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019
Học viên
Trần Quốc Đạt
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Trần Quốc Đạt, học viên cao học khoá 26, chuyên ngành Sinh học thực
nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội,
xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn
Trọng Tuệ và PGS.TS. Võ Thị Thương Lan
2. Công trình nghiên cứu này hoàn toàn mới không trùng lặp với bất kỳ công
trình nghiên cứu nào khác.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu chính xác, trung thực và khách
quan.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019
Học viên
Trần Quốc Đạt
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
MỤC LỤC
Mở đầu ........................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1
Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ..................................................... 3
1.1.1. Chẩn đoán ...................................................................................................... 4
1.1.2. Nguyên nhân .................................................................................................. 4
1.1.3. Điều trị ........................................................................................................... 6
1.2. Tổng quan về ruồi giấm ................................................................................... 7
1.2.1. Chu kỳ vòng đời ............................................................................................ 8
1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm ..................................................................................... 9
1.3. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu ............................................. 12
1.4. Hệ thống kiểm soát biểu hiện gen GAL4-UAS và ứng dụng trong nghiên cứu
mô hình ruồi giấm ..................................................................................................... 16
1.4.1. Hệ thống GAL4/UAS .................................................................................. 16
1.4.2. Phương pháp knockdown một gen bằng kỹ thuật RNAi và biểu hiện gen
knockdown bằng hệ thống GAL4/UAS ................................................................ 17
1.5. Họ gen ABC và gen ABCC4 ........................................................................... 18
1.5.1. Tổng quan về họ gen ABC ........................................................................... 18
1.5.2. Gen ABCC4 ................................................................................................. 19
1.6. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu rối loạn tự kỷ ...................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 22
2.2. Nguyên vật liệu, hoá chất và thiết bị .............................................................. 22
2.2.1. Nguyên vật liệu và hoá chất ........................................................................ 22
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 24
2.3.1 Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu hiện dABCC4 tại mô
não của ruồi ........................................................................................................... 24
2.3.2. Phương pháp đánh giá biểu hiện của protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm
bằng kỹ thuật western blotting .............................................................................. 26
2.3.3. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm bằng thí nghiệm leo trèo ........ 27
2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng tương tác xã hội ....................................... 28
2.3.5. Phương pháp đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay) .......... 29
2.3.6. Phương pháp đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm (viability assay) .................. 30
2.3.7. Xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ bằng phương pháp
nhuộm miễn dịch huỳnh quang ............................................................................. 31
2.3.8. Phân tích kết quả ......................................................................................... 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 36
3.1. So sánh mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm ...... 36
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
3.2. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm ....... 37
3.3. Kết quả đánh giá khả năng vận động và tương tác ở ruồi trưởng thành. ........... 40
3.4. Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm ................................................... 43
3.5. Kết quả xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ
(neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch
huỳnh quang .............................................................................................................. 46
3.6. Kết quả đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm ............................................................ 49
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 51
Tài liệu tham khảo ..........................................................................................................
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm ...................... 8
Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm.. ....................................................................... 9
Hình 3: Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai ....... 10
Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. ....... 11
Hình 5: Bảo tồn về mặt chức năng của các cơ quan trong hệ thần kinh (A) và hệ vận
động (B) giữa người và ruồi giấm ................................................................... 12
Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element. ............... 13
Hình 7: Hoạt động của hệ thống GAL4/UAS. ............................................................. 17
Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi). ...................................... 18
Hình 9: Sơ đồ cấu trúc và các vùng chức năng của protein ABC. ............................... 19
Hình 10: Sơ đồ miêu tả quá trình lai tạo các dòng ruồi giấm thí nghiệm và cơ chế hoạt
động của các thành phần trong con lai F1. ...................................................... 25
Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo ............................................ 27
Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm ....... 29
Hình 13: Thiết kế thí nghiệm xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ......................... 30
Hình 14: Cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction)ở ấu trùng ruồi giấm. ......... 32
Hình 15: Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm trong nghiên cứu. ........................................... 35
Hình 16: Mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm. ............. 36
Hình 17: Kết quả western blotting xác định mức độ biểu hiện của protein dABCC4 ở
mô não của ruồi giấm....................................................................................... 38
Hình 18: Thí nghiệm hành vi tương tác xã hội trên ruồi giấm trưởng thành. .............. 41
Hình 19: Kết quả thí nghiệm leo trèo xác định khả năng vận động của ruồi giấm
trưởng thành ở thời điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi................. 42
Hình 20: Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ............................................ 44
Hình 21: Kết quả phân tích nhịp thức-ngủ ở ruồi giấm ............................................... 45
Hình 22: Kết quả phân tích cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) của
ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ........................ 47
Hình 23: Kết quả xác định mật độ protein BRP tại vùng hoạt động trước synap ở ấu
trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. .............. 48
Hình 24: Biểu đồ đánh giá tỷ lệ sống của ruồi giấm. ................................................... 50
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ
viết tắt
Chú thích Tiếng Anh
Chú thích Tiếng Việt
ABCC4
ATP-binding cassette subfamily C
member 4
Thành viên số 4 phân lớp C của
protein bám ATP
ASD
Autism Spectrum Disorder
Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ
ATP
Adenosine Triphosphat
BRP
Brurchpilot
dsRNA
double stranded RiboNucleic Acid
DLG
Disc-large
HRP
Horseradish Peroxidase
HL3
hemolymph-like 3 saline
IR
Inverted Repeat
kDal
kilo Dalton
NBD
Nucleotide Binding Domain
Vùng bám nucleotide
NGS
Normal goat serum
Huyết thanh dê
NMJ
Neuromuscular-junction
Mối nối thần kinh cơ
PBS
Phosphat Buffer Saline
PFA
Paraformandehide
RISC
RNA induced silencing complex
Phức hệ gây bất hoạt RNA
RNAi
RNA interference
RNA can thiệp
RT-PCR
Reverse transcription – Polymerase
Chain Reaction
Phản ứng PCR sử dụng enzyme
phiên mã ngược
TMD
Transmembrane Domain
Vùng xuyên màng
UAS
Upstream Activation Sequence
Trình tự hoạt hóa thượng nguồn
MSSR
Subsynap Reticulum
Vùng dưới synap
RNA mạch đôi
Enzyme củ cải ngựa
Trình tự lặp-đảo
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
Mở đầu
Theo tiêu chuẩn DSM-IV (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders – 5th Edition), tự kỷ là tình trạng rối loạn hành vi nghiêm trọng, nằm trong
nhóm các rối loạn phát triển lan tỏa (pervasive developmental disoders). Gần đây, rối
loạn phổ tự kỷ và tự kỷ là tên gọi chung cho toàn bộ các thể bệnh này. Bệnh đặc trưng
bởi tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm những khiếm khuyết trong tương
tác xã hội, phát triển ngôn ngữ và kỹ năng giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp
đi lặp lại. Do mang đồng thời nhiều triệu chứng nên còn được gọi là rối loạn phổ tự kỷ
(autism spectrum disorder - ASD). Bệnh được phân loại gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn
Asperger, rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ và rối loạn phát triển lan tỏa không
đặc hiệu khác. Việc nghiên cứu căn bệnh này ở mức độ phân tử và tế bào cũng trở nên
khó khăn đối với các nhà khoa học bởi tính phức tạp và trở ngại trong việc lựa chọn,
xây dựng mô hình thực nghiệm. Hầu hết các nghiên cứu cơ bản đều dừng lại ở mức độ
in vitro, tập trung vào việc phát hiện đột biến gen được cho là liên quan đến bệnh mà
chưa đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ in vivo.
Mô hình ruồi giấm chuyển gen mang lại những giá trị to lớn trong nghiên cứu
bệnh học phân tử với rất nhiều ưu điểm như: vòng đời ngắn, sinh trưởng nhanh, bản đồ
hệ gen đã giải mã chi tiết, có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người, ít hạn
chế pháp lý đối với các thử nghiệm, dễ tạo dòng, dễ chuyển gen và biểu hiện protein
ngoại lai. Cấu trúc và chức năng của hệ cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hoá…được bảo tồn
giữa ruồi giấm và người, do đó ruồi giấm biến đổi gen thực sự là mô hình lý tưởng để
nghiên cứu các bệnh lý ở người đặc biệt là các bệnh lý thần kinh.
Trên thế giới, đã có nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm để xác định mối liên
quan giữa đột biến một số gen với bệnh tự kỷ bằng việc giảm biểu hiện của các gen
này (knockdown) tại hệ thần kinh, đồng thời phân tích ảnh hưởng của gen liên quan
đến các biểu hiện hành vi, khả năng vận động, khả năng sống sót, các thay đổi về nhịp
sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh NMJ ruồi giấm. Một nghiên cứu gần đây
khi knockdown gen ABCA13 (ATP-binding cassette subfamily A member 13) – một
gen thuộc họ ABC có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển lipid, ion, vitamin, các
chất hữu cơ và một số phân tử thuốc qua màng tế bào đã cho thấy sự giảm tương tác rõ
1
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
rệt giữa các cá thể trong quần thể ruồi giấm. Ruồi bị rối loạn giấc ngủ và cấu trúc thần
kinh cơ bị biến đổi. Kiểu hình ghi nhận được trên mô hình này tương tự như triệu
chứng rối loạn tự kỷ ở người. Bên cạnh đó, đột biến gen ABCA13 cũng đã được chứng
minh là có liên quan đến rối loạn tự kỷ trên mô hình khỉ thực nghiệm. Như vậy, họ
gene ABC đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng
của hệ thần kinh ở động vật. Để tiếp nối hướng nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu của
chúng tôi đã lựa chọn nhắm vào gen đích ABCC4, một gen cũng nằm trong họ gen
ABC tuy nhiên chức năng của nó liên quan đến hệ thần kinh và ảnh hưởng đến rối loạn
tự kỷ lại chưa được biết đến và cũng chưa có một nghiên cứu nào trên mô hình động
vật xác định được vai trò sinh bệnh học của gen này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến
hành đề tài ‘Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng
mô hình ruồi giấm’ với hai mục tiêu chính: (1) knockdown gen ABCC4 trên mô hình
ruồi giấm và (2) phân tích các biểu hiện hành vi và cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ
trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ.
Đây là hướng tiếp cận hoàn toàn mới, sẽ góp phần làm sáng tỏ vai trò không chỉ
của gen ABCC4 mà còn cho thấy chức năng mới của họ gen ABC trong cơ chế phân tử
của bệnh, đồng thời cung cấp một mô hình tiềm năng và kinh tế cho những nghiên cứu
thử nghiệm và sàng lọc thuốc.
2
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 . Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ
Rối loạn phổ tự kỷ (Autism Spectrum Disoders – ASD) là một bệnh lý rối loạn
về phát triển thần kinh phức tạp ở trẻ em được giả thuyết do sự phơi nhiễm với các
chất độc hoặc do thay đổi về những yếu tố di truyền [5]. Bệnh được phân loại bao
gồm: rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ, rối loạn Asperger, rối loạn phát triển lan
toả không đặc hiệu và hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy… [72]. Những rối loạn về
hành vi thường phát triển trong những năm đầu tiên của cuộc đời. Đây là căn bệnh
đang có xu hướng phát triển với một tốc độ đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà
còn trên toàn thế giới. Theo số liệu thống kê năm 2012, thế giới có khoảng 62/10 000
người bị mắc hội chứng rối loạn tự kỷ. Trước đó, nhiều nghiên cứu khảo sát toàn diện
về tỷ lệ mắc bệnh từ khu vực Tây Thái Bình Dương đến Nhật Bản và Trung Quốc.
Năm 2000, tỷ lệ mắc tự kỷ dao động từ 2,8/10000 đến 94/10000 với giá trị trung bình
là 11,6 /10 000. Chỉ có một nghiên cứu về hội chứng này ở khu vực Đông Nam Á,
được thực hiện ở Indonesia vào năm 1992; ước tính tỷ lệ mắc tự kỷ là 11,7/10 000
[23]. Công bố năm 2014 của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ- CDC khi điều tra
trên 11 bang của Mỹ cho thấy trung bình cứ 59 trẻ ở độ tuổi 8 tuổi thì có 1 trẻ bị hội
chứng tự kỷ. Tỷ lệ này có thể khác nhau giữa các bang (khoảng từ 13.1 đến 29.3 trên
1.000 trẻ em 8 tuổi) và thay đổi theo giới tính và chủng tộc/sắc tộc. Bé trai có nguy cơ
mắc tự kỷ cao gấp từ 4 -5 lần so với bé gái [72].
Tại Việt Nam, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ ngày càng tăng lên. Cụ thể, tại
Bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ trong năm 2008 là 450 trẻ,
năm 2009 là 963 trẻ, con số này vào năm 2010 lên tới 1792 trẻ [2]. Nghiên cứu của
Hoàng Văn Minh và cs năm 2019 về tỷ lệ mắc tự kỷ ở nhóm trẻ 18-30 tháng tuổi ở
Miền Bắc Việt Nam là 75,2/10 000 trẻ, cao hơn so với thống kê giai đoạn 2013-2014.
Cũng trong nghiên cứu này, tác giả còn chỉ ra tỷ lệ mắc rối loạn tự kỷ cao hơn ở những
trẻ em sống trong môi trường đô thị. Mức độ đô thị hoá ngày càng tăng dẫn đến trẻ có
nguy cơ mắc bệnh cao hơn [29].
3
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
1.1.1. Chẩn đoán
Về mặt chẩn đoán, trong khoảng thời gian dài tranh luận và sửa đổi, các nhà
tâm thần học đã đi đến thống nhất và mô tả hoàn chỉnh các tiêu chí trong hai bảng
phân loại bệnh quốc tế là “The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
– 5th Edition” (DSM-V) và “Autism Spectrum Diagnostic Observation Schedule”
(ASD-OC) [27], [31]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự thiếu hụt và bất
thường ở ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành
vi có tính lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện ít nhất ba
dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành
vi và có phản ứng quá mức, hoặc dưới mức với các tác động từ môi trường [27]. Một
số biểu hiện khác như động kinh, tăng động giảm chú ý, lo âu, trầm cảm cũng được sử
dụng làm tiêu chuẩn chẩn đoán. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng
giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm
khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập
khuôn. Trẻ không có hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Những biểu hiện
này thường đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [59]. Đây cũng là
một trong những tiêu chí quan trọng để chẩn đoán hội chứng rối loạn tự kỷ.
1.1.2. Nguyên nhân
Ngày nay, có nhiều giả thuyết khác nhau về nguyên nhân gây ra hội chứng rối
loạn tự kỷ như: cấu tạo não bất thường, thiếu cân bằng về kích thích tố, dị ứng, di
truyền, nhiễm độc thuỷ ngân, căn nguyên tâm lý hoặc tổn thương trong khi sinh …
Tuy nhiên, các nhà khoa học hiện đang quan tâm đến yếu tố về gen và di truyền. Yếu
tố này chiếm khoảng 10-20% số ca bệnh và đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh
học của rối loạn tự kỷ với nhiều hướng tiếp cận khác nhau như xác định số bản copy
của biến thể di truyền, xác định đột biến đơn gen, phân tích đa hình thái đơn nucleotid
và mối liên quan của gen trong toàn bộ genome [8].
Kết quả của nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome (whole-genome
sequencing) và phân tích toàn bộ vùng mã hoá (whole-exome) đã xác định được nhiều
gen có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [34], [54], [66], [82]. Những gen này có
chức năng và vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như: phiên mã và tái cấu trúc sợi
4
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
nhiễm sắc, tổng hợp và phân giải protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào,
và hình thành các synap thần kinh [78]. Bên cạnh đó, còn có các gen mã hoá cho
protein tham gia vào quá trình tổng hợp và phân giải protein như mTOR, UBE3A,
PAM. Việc thay đổi trong cách sắp xếp của các protein cấu tạo nên khung xương tế
bào cũng là một trong những nguyên nhân được nhắc đến trong cơ chế sinh bệnh học
của hội chứng này. Quá trình định vị các protein ở đúng vị trí của nó có vai trò trong
việc tạo liên kết và sự kết dính giữa các tế bào, thụ thể trên bề mặt tế bào và là kênh
dẫn truyền tín hiệu giữa các synap thần kinh. Các gen liên quan đến quá trình này bao
gồm SHANK, NBEA, ANK3 [10], [53], [85].
Biến đổi di truyền ngoại gen cũng được đề cập đến là một trong những yếu tố
có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [24], [67]. Những thay đổi này ảnh hưởng
đến quá trình và mức độ biểu hiện gen, thay vì ảnh hưởng trực tiếp lên chính trình tự
DNA. Trong đó, methyl hoá DNA là một ví dụ điển hình nhất trong việc tái cấu trúc
sợi nhiễm sắc và bất hoạt quá trình phiên mã. Một số biến đổi được chứng minh gần
đây nhất như sự methyl hoá dưới mức của gen PRRT1, hay sự methyl hoá quá mức của
gen FAM181A, CHFR. Đột biến trên gen POGZ – mã hoá cho protein tham gia quy
định cấu trúc dị nhiễm sắc, hay đột biến gen mã hoá cho protein H3K9 tham gia vào
quá trình methyl hoá histon H3 đã được xác định là có liên quan đến rối loạn tự kỷ
[10], [25], [40]. Yếu tố môi trường cũng được xem là tác nhân thúc đẩy sự biểu hiện
của biến đổi di truyền ngoại gen, gây nên hội chứng rối loạn tự kỷ tạm thời [74].
Ở mức độ di truyền học, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ở các cặp sinh đôi
cùng trứng, nếu một trong hai trẻ mắc tự kỷ thì nguy cơ mắc bệnh ở trẻ còn lại là 36%95%. Tỷ lệ này ở các cặp trẻ không sinh đôi cùng trứng chỉ là 0-30% [28]. Anh chị em
ruột của những trẻ tự kỷ cũng có 2-8% nguy cơ mắc bệnh, con số này tăng lên 12%20% nếu những đứa trẻ đó có dấu hiệu của hai trong ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi. Bệnh
có xu hướng biểu hiện rõ nét hơn ở những bệnh nhân có bất thường mức độ nhiễm sắc
thể. Khoảng 10% trẻ mắc hội chứng rối loạn tự kỷ có kèm theo hội chứng Down hoặc
hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy [21].
Cha mẹ có tiền sử rối loạn tâm thần, tâm thần phân liệt hoặc rối loạn cảm xúc
cũng có nguy cơ sinh con mắc bệnh [36]. Ngoài ra, tuổi của cha mẹ cũng có thể trở
thành yếu tố nguy cơ. Trẻ được sinh ra từ cha mẹ lớn tuổi có nguy cơ mắc bệnh cao
5
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
hơn [22]. Trẻ sinh thiếu tháng (dưới 33 tuần tuổi) hoặc thiếu cân (dưới 2,5kg) cũng có
nguy cơ mắc bệnh cao gấp hai lần trẻ bình thường. Những thai nhi bị phơi nhiễm với
thuốc trừ sâu như chlorpyrifos có liên quan đến sự giảm trọng lượng và chiều dài cơ
thể đồng thời có nguy cơ chậm phát triển tâm lý và mắc hội chứng rối loạn tự kỷ cao
hơn [41], [61]. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học gần đây cũng chỉ ra rằng, phụ nữ mang
thai (đặc biệt trong tuần đầu hoặc tuần thứ 2 của thai kỳ) bị nhiễm virus hoặc vi khuẩn
sẽ thúc đẩy việc kích hoạt hệ miễn dịch và có nguy cơ sinh con mắc các bệnh lý rối
loạn phát triển thần kinh cao hơn 13% so với trường hợp không bị nhiễm [55]. Quá
trình kích hoạt hệ miễn dịch này ở thai phụ có liên quan đến sự tăng tiết cytokines tại
các vị trí viêm thần kinh và xuất hiện những bất thường trong biểu hiện protein ở vùng
synap. Điều này là cơ sở của sinh bệnh học rối loạn tự kỷ.
1.1.3. Điều trị
Hiện nay, việc điều trị rối loạn tử kỷ bao gồm 2 hướng: dùng thuốc và không
dùng thuốc. Các phương pháp điều trị bằng thuốc chủ yếu sử dụng các nhóm thuốc có
tác dụng kích thích thần kinh, chống loạn thần không điển hình, thuốc chống trầm
cảm, thuốc đối kháng thụ thể alpha-adregenic và N-methyl-D-aspartate (NMDA),
thuốc ức chế cholinesterase, thuốc chống động kinh [4]. Các loại thuốc này nằm trong
nhóm được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh lý thần kinh. Tuy nhiên, tính an toàn,
hiệu quả và khả năng dung nạp của chúng đối với trẻ tự kỷ cần được kiểm chứng thêm
bằng các nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng, chưa kể tới việc những thuốc này chỉ có
khả năng cải thiện một số triệu chứng cơ bản.
Với hướng điều trị không sử dụng thuốc bao gồm các phương pháp điều trị bổ
trợ và điều trị thay thế [12]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phối hợp các giác quan,
yoga, châm cứu và sử dụng phương pháp trị liệu bằng âm nhạc, trị liệu hành vi. Bên
cạnh đó, việc bổ sung các hormone như oxytocine, vasopressin hay omega-3, vitamin
và các dược chất có nguồn gốc thiên nhiên, hay việc bổ sung dinh dưỡng vào chế độ
ăn uống cũng là một trong những cách thức hỗ trợ điều trị bệnh [12], [46].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về rối loạn tự kỷ chủ yếu tập trung vào dịch tễ
học, xã hội học và tâm lý học, chú trọng vào phương pháp giúp trẻ tự kỷ hoà nhập
cộng đồng, phục hồi chức năng và giảm thiểu các tổn thương não [1], [3]. Trong khi
6
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
đó, các nghiên cứu về cơ chế phân tử, sinh bệnh học còn rất hạn chế. Đặc biệt, chưa có
nghiên cứu nào xây dựng được mô hình động vật thực nghiệm cho bệnh tự kỷ, phục vụ
nghiên cứu ở mức độ in-vivo.
1.2.
Tổng quan về ruồi giấm
Ruồi giấm (tên khoa học là Drosophila melanogaster) là sinh vật được sử dụng
trong lĩnh vực di truyền học với lịch sử nghiên cứu hơn 100 năm. Nó được nhà di
truyền học người Mỹ T.H. Morgan sử dụng trong nghiên cứu của mình từ những năm
đầu thế kỷ XX. Ngày nay, ruồi giấm là loài được sử dụng phổ biến trong các phòng thí
nghiệm di truyền. Nó được coi là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất
trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử, hay các vấn đề của sinh học cơ
bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hoá. Ruồi giấm được coi là mô hình tuyệt vời
để thiết lập trong phòng thí nghiệm với các đặc tính và ưu điểm sau:
Hệ gen đơn giản và đã được lập bản đồ chi tiết, dễ dàng so sánh, tra cứu các gen
có chức năng tương đồng với người
Có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người
Ít hạn chế về mặt pháp lý và vấn đề đạo đức với các thử nghiệm
Dễ tạo dòng, chuyển gen, biểu hiện protein ngoại lai
Có vòng đời ngắn (khoảng 30 ngày) (Hình 2), đây là lợi thế cho các nghiên cứu
giải mã quy trình sinh học phức tạp như lão hoá, bệnh liên quan đến các thế hệ,
phả hệ
Ruồi giấm chỉ có 4 cặp nhiễm sắc thể, do vậy việc thao tác, phân tích, sàng lọc
di truyền trở nên dễ dàng
Tuy chúng có một cơ thể nhỏ bé nhưng cấu trúc cơ thể lại hoàn chỉnh, tạo lợi
thế trong nghiên cứu về chuyển hoá và dinh dưỡng
Hiểu rõ được quá trình phát triển từ phôi đến ấu trùng. Do đó có lợi thế trong
nghiên cứu tế bào gốc và ung thư
Chi phí thấp, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm dễ tạo ra quần thể lớn, có tiềm
năng trong sàng lọc dược chất và thuốc.
7
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm [60].
(A)Tủ lưu giữ, (B) Ống nghiệm nuôi ruồi, (C) Chọn cá thể, (D, E) Dùng CO2 làm ruồi ngủ.
Hiện nay trên thế giới có nhiều trung tâm bảo tồn các dòng ruồi biến đổi gen
dành cho nghiên cứu, trong đó phải kể đến các trung tâm lớn nhất bao gồm trung tâm
Bloomington, Indiana, Mỹ; DGRC của Học viện Kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản; NIG-FLY
thuộc viện di truyền quốc gia Nhật Bản; DSSC ở đại học California, Hoa Kỳ; VDRC
của Viena, Australia; TRiP thuộc trường Y của Đại học Harvad, Hoa Kỳ….Tại các
trung tâm này, rất nhiều các dòng ruồi đã được biến đổi gen, chúng được tạo mã và
kèm theo là các thông số biến đổi di truyền. Các phòng thí nghiệm có thể nhận được
dòng ruồi biến đổi gen mà họ quan tâm từ các trung tâm này với kinh phí rất nhỏ.
Ngược lại, bất kỳ các nghiên cứu nào tạo ra các nguồn gen mới đều có thể gửi tới các
trung tâm này để duy trì và cung cấp cho các nhà nghiên cứu khác trên thế giới. Các
trung tâm này là nơi cung cấp nguồn ruồi chuyển gen và cũng là nơi trao đổi với các
nhà khoa học để tạo thêm nhiều dòng ruồi nghiên cứu khác nhau. Nếu ở người, toàn bộ
thông tin chi tiết về hệ gen đều có thể tìm thấy ở cơ sở dữ liệu thuộc Trung tâm thông
tin Công nghệ sinh học Quốc Gia Hoa Kỳ NCBI [86] thì đối với ruồi giấm cũng có
một cơ sở dữ liệu Flybase phục vụ việc tra cứu thông tin di truyền [87]. Điều này giúp
các nhà nghiên cứu dễ dàng trao đổi, tìm hiểu thông tin và theo đuổi các nghiên cứu
dựa trên cơ sở dữ liệu khoa học đã công bố.
1.2.1. Chu kỳ vòng đời
Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu trùng, nhộng và
ruồi trưởng thành. Ruồi cái dài khoảng 3mm và đẻ khoảng 750- 1500 trứng trong suốt
vòng đời. Trứng sau khi được thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24 giờ. Các
phôi sẽ trải qua liên tiếp các thay đổi để trở thành ấu trùng bậc một, bậc hai và bậc ba
8
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
(tương ứng với một, hai và ba ngày tuổi). Giai đoạn ấu trùng được đặc trưng bởi sự
tiêu thụ thức ăn trong khoảng 5 ngày trước khi phát triển thành nhộng. Sau khoảng 4
ngày nhộng sẽ lột xác phát triển thành ruồi trưởng thành. Do vậy, chỉ mất khoảng 10
ngày để thu được ruồi trưởng thành từ phôi ở nhiệt độ 25 ℃ [57]. Tuổi thọ trung bình
của ruồi giấm khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ 29 ℃là khoảng 30-40 ngày.
Thụ tinh
Ruồi giấm
trưởng thành
Nhộng
2,5-3 ngày
3,5-4,5 ngày ở
giai đoạn nhộng
Vòng đời
của ruồi giấm
Ấu trùng
ngày 3
1 ngày
Phôi
1 ngày
Ấu trùng
ngày 1
1 ngày
Ấu trùng
ngày 2
Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm. Trứng sau thụ tinh sẽ trải qua các giai đoạn ấu
trùng ngày 1, ngày 2 và ngày 3, sau đó phát triển thành giai đoạn nhộng sau khoảng 2,5 đến
3 ngày rồi nở thành ruồi trưởng thành sau khoảng 3,5 đến 4,5 ngày. Ruồi trưởng thành có
thời gian sống khoảng 50-60 ngày [57].
1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên
4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể
giới tính (XX, XY) [57]. Do cặp nhiễm sắc thể thứ 4 rất nhỏ và chứa ít gen nên
thường được bỏ qua, và chỉ tập trung vào ba cặp nhiễm sắc thể còn lại. Theo đó,
quy cách viết kiểu gen của ruồi giấm cũng sẽ chỉ biểu thị ba cặp nhiễm sắc thể theo
thứ tự: nhiễm sắc thể giới tính; nhiễm sắc thể số 2; nhiễm sắc thể số 3. Các nhiễm
sắc thể ngăn cách nhau bởi dấu “;”. Các allen tương đồng được phân cách bằng một
9
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
đường gạch ngang. Ví dụ như: ruồi đực mang gen vestigial ở dạng dị hợp tử biểu
hiện kiểu hình cánh ngắn sẽ có kiểu gen
NSTsố 1
#
$
;
&' (
(
; .
(
NSTsố 2
Hình 3 : Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai di
truyền. P: thế hệ bố mẹ; F1: thế hệ con lai; w: gen white quy định kiểu hình mắt trắng; vg:
gen vestigial quy định kiểu hình cánh ngắn; B: gen Bar quy định giảm kích thước mắt; “+”:
gen kiểu dại (wildtype) [62].
Bằng cách so sánh hệ gen của người và ruồi giấm, các nhà nghiên cứu có thể
hiểu rõ hơn về cấu trúc, chức năng các gen trên người. Ngoài ra, việc so sánh cũng
cung cấp bằng chứng cho nghiên cứu di truyền tiến hóa giữa các sinh vật.
Với việc hiểu rõ về cấu trúc bộ gen, các thao tác di truyền cũng dễ dàng được thực
hiện như:
- Đưa một gen gây bệnh vào bộ gen của ruồi giấm, biểu hiện và nghiên cứu chức
năng của nó
- Loại bỏ một gen ra khỏi bộ gen của ruồi, từ đó xem xét vai trò của gen này như
thế nào, gây bệnh gì, ảnh hưởng đến sự phát triển ra sao
- Hoặc đồng thời bất hoạt 1 gen và biểu hiện một gen khác có chức năng thay
thế nhằm chứng minh vai trò và chức năng của các gen đó
- Dễ dàng gây đột biến….
- Đa phần các dòng ruồi chuyển gen đều có thể lưu trữ trong ống nghiệm cho các
mục đích ứng dụng lâu dài.
10
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
Tuy ruồi giấm chỉ là một côn trùng nhỏ, nhưng có tổ chức đa bào hoàn chỉnh về
mặt cấu trúc, và có sự tương đồng cao về mặt chức năng khi so sánh với các hệ cơ
quan của người như hệ thần kinh, hệ vận động (Hình 5). Sự tương đồng thể hiện ở
hình thái, cấu trúc cơ thể (Hình 4). Cơ thể của con người và ruồi được chia thành các
phân đoạn. Khi quan sát từ bên ngoài, sự phân chia này có thể không rõ ràng. Tuy
nhiên, khi quan sát cách sắp xếp các phân đoạn dây thần kinh xuất phát từ tuỷ sống
của con người (một cặp trên mỗi phân đoạn) hoặc xem các đốt sống trong xương sống
của người như một phân đoạn, có thể thấy sự phân chia rõ ràng trong từng phần của cơ
thể. Các phân đoạn này được tổ chức thành các đơn vị cấu trúc lớn hơn. Ở người và
ruồi, có thể phân biệt được đầu, ngực và bụng. Mặc dù phần phụ của hai loài khác
nhau (2 cánh tay và 2 chân so với 6 chân và 2 cánh) nhưng chúng có chung nguyên tắc
là nằm ở những vị trí nhất định và gắn với các phân đoạn cơ thể cụ thể. Xét riêng trên
hệ thần kinh, ở người và ruồi đều tồn tại hệ thống thần kinh trung ương (central
nervous system) ở phần đầu và thần kinh tuỷ sống ở phần thân. Cùng là đơn vị chức
năng nhỏ nhất, các tế bào thần kinh có chung hệ thống gen/protein chức năng và cấu
trúc bởi các synap. Cả hai loài đều có sự phân chia các vùng chức năng ở não tương tự
nhau như vùng thị giác, vùng khứu giác, vùng tiếp nhận-xử lý-lưu trữ thông tin và
vùng vận động [60].
Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. Sự tương
đồng thể hiện ở cách sắp xếp từng phần của cơ thể, cách phân chia hệ thống thần kinh, chức
năng từng cơ quan trong hệ vận động [60].
11
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
não
Tuỷ
sống
Thần
kinh
lưng
Thần
kinh
phân
nhánh
A)
B)
Hình 5: Bảo tồn về mặt chức năng của các cơ quan trong hệ thần kinh (A) và hệ vận
động (B) giữa người và ruồi giấm [60].
Với cấu trúc hoàn thiện như vậy, ruồi giấm được ứng dụng rộng rãi trong
nghiên cứu các bệnh thoái hoá thần kinh như Alzheimer, Huntington's, Parkinson hay
một số bệnh di truyền hiếm gặp như Charcot-Marrie-Tooth (CMT), hội chứng xơ cứng
teo cơ một bên (Amyotrophic lateral sclerosis – ALS) …
1.3.
Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu
Bằng việc sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, Thomas Morgan – cha
đẻ của mô hình này đã phát hiện ra quy luật di truyền và đặt nền móng cho di truyền
học hiện đại. Với bề dày lịch sử nghiên cứu hàng trăm năm, mô hình ruồi giấm đã
chứng tỏ được khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học hiện đại
như mô phỏng bệnh lý của người (bệnh thoái hoá thần kinh, rối loạn chuyển hoá, ung
thư . . .), nghiên cứu chức năng của gen, tương tác giữa các gen, các biến đổi di truyền,
12
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
xác định các con đường tín hiệu trong bệnh học phân tử, thử nghiệm và sàng lọc dược
chất, xác định độc tố môi trường…Nhiều mô hình ruồi giấm mô phỏng bệnh lý dựa
trên các cơ chế phân tử gây bệnh đã được xây dựng bằng nhiều phương pháp. Theo đó,
các gen gây bệnh có thể được chèn vào hệ gen của ruồi giấm thông qua vectơ chuyển
gen. Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất là sử dụng plasmid P-element (Hình 6).
Gen mã hoá cho
transposase
Plasmid hỗ trợ
Plasmid
chuyển gen
Vi tiêm
Ruồi trưởng thành
mang plassmid
DNA genome của ruồi giấm
Biol 202 Genetics, 2013 Lecture 23
Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element. Phương pháp
sử dụng hai plasmid; một plasmid mang gen chuyển và gen quy định màu mắt nằm giữa hai
đoạn trình tự P-element, plasmid còn lại mang gen mã hoá cho enzyme transposase. Hai
plasmid này được đồng chuyển vào hệ gen bằng phương pháp vi tiêm vào phôi của ruồi giấm.
Ruồi giấm mang gen chuyển được sàng lọc bằng marker màu mắt [88].
Bên cạnh phương pháp chuyển gen, mô hình ruồi giấm bệnh lý còn có thể được
tạo lập bằng cách tác động lên các gen/protein ở ruồi có mức độ tương đồng cao với
gen/protein của người. Sự tương đồng về trình tự axit amin mã hoá, đặc biệt là trình tự
ở từng vùng cụ thể trong cấu trúc cho thấy tính bảo tồn cao về chức năng của protein ở
hai loài.
Việc bảo tồn lượng lớn các gen và con đường dẫn truyền tín hiệu giữa người và
ruồi, cũng như sự phát triển của não ruồi, đã củng cố thêm cho việc sử dụng ruồi giấm
để tạo lập mô hình các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson, Alzheimer,
Huntington… [38], [75], [76]. Ở mô hình ruồi giấm biểu hiện bệnh Parkinson, người
13
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
ta tiến hành giảm biểu hiện gen duch (một gen tương đồng với UCH-L1 ở người) trên
các tế bào thần kinh sinh dopamine. Mô hình này biểu hiện triệu chứng suy giảm khả
năng vận động và mất tế bào thần kinh sinh dopamine ở cả hai giai đoạn ấu trùng và
ruồi trưởng thành [75]. Các đặc điểm trên tương tự như triệu chứng của bệnh
Parkinson ở người. Nghiên cứu của Mizuno và cs năm 2010 cũng dùng ruồi giấm
chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên
quan [50]. Đối với bệnh Alzheimer, mô hình ruồi giấm cũng được sử dụng để nghiên
cứu cơ chế bệnh sinh; từ đó mô phỏng lại kiểu hình. Một số mô hình có thể kể đến như
mô hình ruồi giấm chuyển gen mã hoá cho protein gây bệnh như b-amyloid, Tau [76].
Ngoài lợi thế về các bệnh di truyền, gần đây mô hình ruồi giấm còn được ứng
dụng trong nghiên cứu bệnh ung thư. Các nghiên cứu này mô phỏng lại sự thay đổi của
các tế bào biểu mô như mất tính phân cực của tế bào, gián đoạn các con đường tín hiệu
(con đường tín hiệu JNK, PI3K/TOR, …) [49]. Việc kích hoạt gen ung thư để tạo khối
u ác tính có thể được thực hiện trên ruồi. Ngoài ra, người ta còn có thể cấy ghép mô
ung thư trên ruồi, hoặc từ ấu trùng sang ruồi trưởng thành và đánh giá khả năng sinh
ung thư của các mô đột biến; tại đây các tế bào có khả năng tăng sinh và tạo khối u
mới [65].
Năm 1946, giải Nobel Y học được trao cho nhà khoa học Hermann Joseph với
nghiên cứu chứng minh tia X có khả năng làm đột biến DNA và các đột biến này có
thể di truyền sang các thế hệ sau, nghiên cứu của ông thực hiện trên ruồi giấm. Từ ý
tưởng nghiên cứu đó mà ruồi giấm đã được sử dụng trong nghiên cứu các độc tố môi
trường ảnh hưởng đến sự biển đổi di truyền sau này. Ruồi có thể được nuôi trong điều
kiện nhân tạo để đánh giá ảnh hưởng của tác động môi trường lên sức khoẻ hay nhằm
nghiên cứu khả năng chịu đựng hoặc phục hồi của ruồi mang gen nghiên cứu…Một
công bố gần đây nhất năm 2017 của nhóm tác giả Robert R. H. Anholt đã cho ruồi
giấm sống trong môi trường bị phơi nhiễm các kim loại nặng là chì và cadmium [84].
Nghiên cứu đã chỉ ra các alen liên quan đến khả năng đề kháng với chì và/hoặc
cadmium, ngoài ra họ cũng cho thấy đa hình nucleotide đơn (SNPs) có liên quan đến
sự thay đổi khả năng đề kháng với cả kim loại nặng cũng như SNPs có liên quan đến
sự kháng thuốc cụ thể đối với mỗi loại.
14
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
So với các mô hình khác, mô hình ruồi giấm có một số nhược điểm bao gồm
khoảng cách tiến hóa xa với người, sức sống yếu, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên
ngoài và bên trong (như việc chèn ngẫu nhiên các gen mục tiêu); việc các mô nhỏ cũng
gây một phần khó khăn cho phân tích [32].
Tuy nhiên, mô hình ruồi giấm cũng mang nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên
cứu. Cụ thể, ruồi giấm là đối tượng đã được hiểu biết rõ về kiểu hình, tập tính, chu kì
sống, thông tin di truyền và hình thái giải phẫu; các công cụ thao tác phục vụ cho việc
chuyển gen, gây đột biến, giảm biểu hiện (knockdown) hay biểu hiện vượt mức gen
cũng đa dạng và phổ biến [11]. Đây là sinh vật có vòng đời ngắn, số lượng nhiều, phù
hợp cho các thí nghiệm có nhu cầu số lượng mẫu lớn. Các thí nghiệm trên ruồi có thể
cho thấy đồng thời sự thay đổi ở mức độ cơ thể (hình thái, hành vi, kiểu hình vận
động), mô và tế bào. Bên cạnh đó, chi phí cho việc tiến hành nghiên cứu trên mô hình
ruồi, tính tương đối, sẽ thấp hơn một vài mô hình khác như tế bào hay chuột. Về bộ
gen ruồi giấm, độ tương đồng giữa ruồi và động vật có vú ở mức độ nucleotide và
trình tự protein là 40%, con số này có thể lên đến 80 – 90% hoặc cao hơn nếu xét trên
các vùng chức năng được bảo tồn. Ước tính rằng, 75% gen bệnh ở người có gen tương
đồng trên ruồi [62]. Ruồi có hệ thần kinh vận động tương đối hoàn thiện và hoạt động
vận động phức tạp. Não ruồi trưởng thành chứa hơn 100.000 neuron, điều khiển nhiều
loại hành vi bao gồm nhịp sinh học, thức - ngủ, học tập, ghi nhớ, ăn uống, hành vi ve
vãn, giao phối và điều hướng bay [47]. Đáp ứng của hệ thần kinh trung ương ở não
ruồi với nhiều loại thuốc cũng tương tự như ở động vật có vú [15]. Việc bảo tồn lượng
lớn gen và các con đường dẫn truyền tín hiệu giữa người và ruồi, cũng như sự phát
triển của não ruồi, đã củng cố thêm cho việc sử dụng ruồi giấm để tạo lập mô hình các
bệnh lý thần kinh, trong đó có rối loạn tự kỷ.
Một số công cụ di truyền đã được phát triển để có thể khai thác tiềm năng ứng
dụng mô hình ruồi giấm vào nghiên cứu. Trong đó, hệ thống điều hòa biểu hiện gen
GAL4-UAS, hay sự kết hợp của hệ thống này với kỹ thuật RNAi (RNA interference,
RNA can thiệp) là một trong những công cụ quan trọng trong các nghiên cứu chức
năng gen và tạo mô hình bệnh trên ruồi giấm.
15
Luận văn thạc sĩ khoa học
Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm
1.4. Hệ thống kiểm soát biểu hiện gen GAL4-UAS và ứng dụng trong
nghiên cứu mô hình ruồi giấm
1.4.1. Hệ thống GAL4/UAS
Năm 1993, Brand và Perrimon lần đầu tiên sử dụng hệ thống GAL4/UAS có
nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevisiae trong việc định hướng biểu hiện các
gen ở ruồi giấm. Từ đó hệ thống này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu trên ruồi.
Hệ thống GAL4/UAS sử dụng 2 dòng ruồi chính (Hình 7). Một dòng mang gen
mã hoá cho protein GAL4 dưới sự kiểm soát của promoter định hướng mô (dòng
driver). Tuỳ vào vị trí muốn biểu hiện mà người ta lựa chọn dòng driver mang
promoter đặc hiệu mô như elav cho biểu hiện protein ở não, gmr cho biểu hiện protein
ở mắt, hay pnr cho biểu hiện protein ở cánh… Một dòng khác chứa gen đích được điều
hòa bởi trình tự UAS (upstream activator sequence) gắn trước nó. Thông thường, khi
các dòng ruồi chuyển gen này sống độc lập với nhau thì gen đích không được biểu
hiện. Điều này đặc biệt thuận lợi trong việc nghiên cứu các protein có tính độc như các
protein kích hoạt quá trình apoptosis; tránh việc biểu hiện thường xuyên một protein
ngoại lai có khả năng gây độc và làm giảm sức sống của các dòng ruồi chuyển gen,
gây trở ngại lớn cho nghiên cứu.
Trong thí nghiệm, 2 dòng ruồi được lai với nhau để tạo dòng con lai mang cả 2
trình tự gene gal4 và ‘UAS-gene đích’. Khi đó, dưới tác động của promoter định
hướng mô, protein GAL4 sẽ được biểu hiện tại các tế bào (mô) mong muốn. Trong các
tế bào (mô) này, GAL4 bám lên vùng trình tự UAS nằm phía trước gen đích, hoạt hóa
sự phiên mã của gen đích. Việc sử dụng hệ thống này giúp cho việc biểu hiện
gen/protein đích tại các mô xác định, tránh biểu hiện tại quá nhiều mô gây giảm mạnh
sức sống của các dòng ruồi, cũng như giúp việc khảo sát chuyên biệt tại tế bào (mô)
cần quan tâm.
16
