nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan đến quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện gen và bất hoạt rna (rna interference)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP








BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HỢP TÁC KH&CN
VIỆT NAM-CỘNG HÒA PHÁP


NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA INTERFERENCE)


Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ QUỲNH MAI

7825
26/3/2010



HÀ NỘI – 2009




BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP


CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM – CỘNG HÒA PHÁP

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ðỀ TÀI/DỰ ÁN
NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ
PHIÊN MÃ LIÊN
QUAN ðẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA interference)

Chủ nhiệm ñề tài/dự án: Cơ quan chủ trì ñề tài/dự án:
(ký tên) (ký tên và ñóng dấu)

TS. Lê Quỳnh Mai PGS. TS. Lê Huy Hàm

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
(ký tên) (ký tên và ñóng dấu khi gửi lưu trữ)









Hà Nội – 2009


BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 200


BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ðỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên ñề tài/dự án: Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan
ñến quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA ( RNA interference)

Mã số ñề tài, dự án:
Thuộc: Chương trình hợp tác Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Cộng hòa Pháp


2. Chủ nhiệm ñề tài/dự án:
Họ và tên: Lê Quỳnh Mai
Ngày, tháng, năm sinh: 01/12/1980 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên. Chức vụ:
ðiện thoại: Tổ chức:
+844 37544711
Nhà riêng: Mobile:
Fax: E mail:

Tên tổ chức ñang công tác: Viện Di truyền Nông nghiệp
ðịa chỉ tổ chức: Km2, Phạm Văn ðồng, Từ liêm, Cầu giấy, Hà Nội.
ðịa chỉ nhà riêng: Số nhà 11B, ngõ 27, phố Võng Thị, phường Bưởi, Quận
Tây Hồ, Hà Nội.
3. Tổ chức chủ trì ñề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì ñề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp
ðiện thoại:
+844 37544711
Fax: 844 37540984

E-mail:
Website:
ðịa chỉ: Km2, Phạm Văn ðồng, Từ liêm, Cầu giấy, Hà Nội.
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Lê Huy Hàm
Số tài khoản: 301.01.035.4
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Từ Liêm, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản ñề tài: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
4. Chủ nhiệm ñề tài ñối tác nước ngoài
Họ và tên: Pascal Gantet
Học hàm, học vị, chuyên môn: Giáo sư
Chức danh khoa học: Giáo sư trường ðH Montppellier 2, Pháp
ðiện thoại cơ quan: +33 (0) 67 61 65 44
Fax: 33 (0) 67 61 56 05
E-mail:


II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1. Thời gian thực hiện ñề tài/dự án:
- Theo Hợp ñồng ñã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 ñến tháng 12/ năm 2009.
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 ñến tháng 12/năm 2009.

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.250 tr.ñ, trong ñó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH:1.250 tr.ñ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.ñ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi ñối với dự án (nếu có): …………

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế ñạt ñược

Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.ñ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.ñ)
Ghi chú
(Số ñề nghị
quyết toán)
1 01/2008 – 400 01/2008 – 12/ 379,5
12/2008 2008
2 01/2009 – 12/
2009
850 01/2009 – 12/
2009
766,55


c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
ðối với ñề tài:
ðơn vị tính: Triệu ñồng
Theo kế hoạch Thực tế ñạt ñược
Số
TT
Nội dung
các khoản chi

Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao ñộng
(khoa học, phổ
thông)
350 350 0 315,56 315,56 0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
500 500 0 497,825

497,825

0
3 Thiết bị, máy móc
4 Xây dựng, sửa chữa
nhỏ

5 ðoàn ra 202 202 0 201,912

201,912

0
6 ðoàn vào 64 64 0 46,5 46,5 0
7 Chi khác 134 134 0 99,879 99,879

Tổng cộng
1.250 1.250 0 1.146,1 1.146,1 0
- Lý do thay ñổi (nếu có):

ðối với dự án:
ðơn vị tính: Triệu ñồng
Theo kế hoạch Thực tế ñạt ñược
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Thiết bị, máy móc
mua mới

2 Nhà xưởng xây
dựng mới, cải tạo

3 Kinh phí hỗ trợ công
nghệ

4 Chi phí lao ñộng
5 Nguyên vật liệu,
năng lượng

6 Thuê thiết bị, nhà
xưởng

7 Khác

Tổng cộng
- Lý do thay ñổi (nếu có):

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện ñề tài/dự án:
(Liệt kê các quyết ñịnh, văn bản của cơ quan quản lý từ công ñoạn xác ñịnh nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí, hợp ñồng, ñiều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện
nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì ñề tài, dự án (ñơn, kiến nghị ñiều chỉnh nếu có)
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1 Quyết ñịnh số 355/Qð-
BKHCN
Ngày 10 tháng 3 năm
2008.
Về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác quốc tế
về khoa học và công nghệ theo nghị ñịnh thư bắt
ñầu thực hiện từ năm 2008

2 Quyết ñinh số
3152/Qð-BKHCN
Ngày 27 tháng 12 năm
2007
Về việc thành lập Tổ thấm ñịnh ñề tài khoa học
và công nghệ theo Nghị ñịnh thư.

3 Quyết ñinh số
2530/Qð-BKHCN

Ngày 31 tháng 10 năm
2007
Về việc thành lập Hội ñồng khoa học và công
nghệ cấp Nhà nước thẩm ñịnh chuyển ngành xem
xét nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ
theo Nghị ñinh thư năm 2008.

4 Hợp ñồng: 2008/Hð-
NðT
Ngày 19 tháng 5 năm
2008
Hợp ñồng thực hiện hợp tác quốc tế về khoa học
và công nghệ theo nghị ñịnh thư.

5 Quyết ñịnh số
2267/Qð-BKHCN
Ngày 14 tháng 10 năm
2008
Quyết ñịnh Về việc thay ñổi Chủ nhiệm ñề tài
nhiệm vụ Nghị ñịnh thư với cộng hòa Pháp


4. Tổ chức phối hợp thực hiện ñề tài, dự án:
Số
TT
Tên tổ chức
ñăng ký theo
Thuyết minh
Tên tổ chức ñã
tham gia thực

hiện
Nội dung
tham gia chủ
yếu
Sản phẩm
chủ yếu ñạt
ñược
Ghi chú*

1
2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

5. Cá nhân tham gia thực hiện ñề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện ñề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không
quá 10 người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
Tên cá nhân ñăng
ký theo Thuyết
minh
Tên cá nhân ñã
tham gia thực hiện

Nội dung
tham gia
chính
Sản phẩm
chủ yếu ñạt

ñược
Ghi
chú*
1
Lê Quỳnh Mai Lê Quỳnh Mai Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

2
ðỗ Năng Vịnh ðỗ Năng Vịnh Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

3
Hà Thị Thúy Hà Thị Thúy Nội dung 1 Quy trình tái
sinh, chuyển
gen.

4
Nguyễn Văn Toàn Nguyễn Văn Toàn Nội dung 1 Quy trình tái
sinh, chuyển
gen.

5
Trần Ngọc Thanh Trần Ngọc Thanh Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

6
Khổng Ngân Giang Khổng Ngân Giang Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

7
Nguyễn Văn Khiêm Nguyễn Văn Khiêm Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

8
Nguyễn Thành ðức Nguyễn Thành ðức Nội dung 2 Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen

9
Pascal Gantet Pascal Gantet Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

10
Jean-Christophe
Breitler
Jean-Christophe
Breitler
Nội dung 1 Các vector
chuyển gen

- Lý do thay ñổi ( nếu có):




6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số

TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm, tên tổ chức hợp tác, số
ñoàn, số lượng người tham
gia )
Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm, tên tổ chức hợp tác, số
ñoàn, số lượng người tham
gia )
Ghi
chú*
1 Trung tâm quốc tế nghiên cứu
phát triển nông nghiệp (CIRAD)
chuyển giao các vật liệu,
phương pháp, các dòng lúa
chuyển gen, ñào tạo cán bộ cho
phía Việt Nam trong khoảng
thời gian 2008 – 2009.
Trung tâm quốc tế nghiên cứu
phát triển nông nghiệp (CIRAD)
ñã chuyển giao các vật liệu và
các dòng lúa chuyển gen siêu
biểu hiện và bất hoạt gen các
yếu tố phiên mã.
ðào tạo 01 tiến sĩ, tập huấn các
thực tập sinh ngắn hạn tại trung
tâm CIRAD.

2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm )
Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian,
kinh phí, ñịa ñiểm )
Ghi chú*
1
2

- Lý do thay ñổi (nếu có):

8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, ñiều tra
khảo sát trong nước và nước ngoài)
Thời gian
(Bắt ñầu, kết thúc
- tháng … năm)
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc ñánh giá chủ yếu)

Theo kế
hoạch
Thực tế ñạt
ñược
Người,
cơ quan
thực hiện
1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo các
cây lúa chuyển gen siêu biểu
hiện các yếu tố phiên mă ở rễ
2008 – 2009 2008 – 2009 Viện DTNN
và CIRAD
lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi
gây bất hoạt các gen này.
2 Xác ñịnh các gen của các yếu tố
phiên mă có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng bộ rễ lúa
2008 – 2009 2008 – 2009 Viện DTNN
và CIRAD
3 Nghiên cứu thiết kế các gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt
các gen của các yếu tố phiên mã
nghiên cứu.
2008 – 2009 2008 – 2009 Viện DTNN
và CIRAD
4 Chuyển các plasmids thu ñược
vào các callus lúa thông qua vi
khuẩn A.tumefaciens
2009 2009 Viện DTNN
và CIRAD

5 Nội dung 2: Chọn lọc, phân
tích, ñánh giá các cây lúa
chuyển gen
2009 2009 Viện DTNN
- Lý do thay ñổi (nếu có):

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ðỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN ñã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ
yếu
ðơn
vị ño
Số lượng
Theo kế
hoạch
Thực tế
ñạt ñược
1 Phương pháp thiết kế
vector mang gen
nghiên cứu
Phương
pháp
1 1 1
2 Phương pháp thiết kế
vector mang các
RNAi tương ứng của

các gen nghiên cứu,
biểu hiện ñặc hiệu ở
lúa
Phương
pháp
1 1 1
3 Quy trình chuyển gen
các yếu tố phiên mã
hệ rễ vào lúa thông
qua vi khuẩn
Agrobacterium
Quy
trình
1 1 1
4 Dòng lúa chuyển gen Dòng 1-2 1-2 2
có khả năng kháng
hạn
5 Phương pháp ñánh
giá biểu hiện gen ở
hệ rễ của các cây
chuyển gen ở mức ñộ
kiểu hình
Phương
pháp
1 1 1
- Lý do thay ñổi (nếu có):

b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần ñạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế
ñạt ñược
Ghi chú

1

- Lý do thay ñổi (nếu có):

c) Sản phẩm Dạng III:
Yêu cầu khoa học
cần ñạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo
kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược
Số lượng, nơi
công bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1 Bài báo quốc tế: Giang N. Khong,

Frédérique Richaud, Yoan Coudert,
Pratap k. Pati, Carole Santi, Christophe
Périn, Jean-christophe Breitler,
Donaldo Meynard, Do n. Vinh,
Emmanuel Guiderdoni, Pascal Gantet
(2008). “Modulating Rice Stress
Tolerance by Transcription Factors”
01 01 01 bài
Tạp chí:
Biotechnology
and Genetic
Engineering
Reviews - Vol.
25, 381-404
- Lý do thay ñổi (nếu có):

d) Kết quả ñào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp ñào tạo, Chuyên
ngành ñào tạo
Theo kế hoạch Thực tế ñạt
ñược
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Thạc sỹ 01 01 2010
2 Tiến sỹ 01 01 2010
- Lý do thay ñổi (nếu có):

ñ) Tình hình ñăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền ñối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
ñăng ký
Theo
kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1

2



- Lý do thay ñổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ñã ñược ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Tên kết quả
ñã ñược ứng dụng
Thời gian
ðịa ñiểm

(Ghi rõ tên, ñịa
chỉ nơi ứng
dụng)
Kết quả
sơ bộ
1
2

2. ðánh giá về hiệu quả do ñề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức ñộ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình ñộ
công nghệ so với khu vực và thế giới…)
- Lần ñầu tiên triển khai hướng nghiên cứu mới về cơ chế bất hoạt gen thông qua
RNAi ở Việt Nam. Cung cấp tài liệu, dữ liệu và kỹ năng thực hành có giá trị
cho mở rộng ứng dụng cơ chế RNAi trong bất hoạt gen ñích ở các cơ thể sống
nhân thực khác.
- Phương pháp RNAi có thể gây bất hoạt gen ñã biết trình tự gen nhằm nghiên
cứu chức năng của gen trong chương trình nghiên cứu chức năng gen
(Functional genomics).
- Phương pháp RNAi ứng dụng trong nghiên cứu ñiều khiển hoạt hoá gen (làm
mất hoạt tính gen (knockout) hoặc làm giảm hoạt tính gen (Knock-down).
- Phương pháp xác ñịnh gen, phân lập gen, thiết kế vectors, chuyển các gen siêu
biểu hiện các yếu tố phiên mã liên quan ñến kháng hạn và cấu trúc rễ lúa
(MADS box genes ) lần ñầu tiên sẽ ñược nghiên cứu có khả năng cho phép tạo
giống lúa kháng hạn và các yếu tố stress ở cây trồng.
- Phương pháp RNAi ñã ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của
nông nghiệp, thuỷ sản, y học v.v
- Cập nhật kịp thời những kiến thức hiện ñại về sinh học phân tử của RNAi
trong nghiên cứu cơ bản, trong ñào tạo ðại học và sau ðại học.

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do ñề tài, dự án tạo ra so với các
sản phẩm cùng loại trên thị trường…)
- ðề tài có thể mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng mới ở nước ta.
- Cung cấp các dòng cây chuyển gen có triển vọng kháng hạn, giảm chi phí sản
xuất và thiệt hại mùa màng do hạn hoặc các nhân bất lợi khác.

3. Tình hình thực hiện chế ñộ báo cáo, kiểm tra của ñề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,
người chủ trì…)
I Báo cáo ñịnh kỳ
Lần 1:
Nội dung 1: Nghiên cứu
tạo các cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện các
yếu tố phiên mã ở rễ lúa
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.

01/2008 –
12/2008
- ðã phân lập ñược RNA tổng số từ
mẫu rễ lúa xử lí kháng hạn và cây ñối

chứng.
- ðã sinh tổng hợp các cDNA tương
ứng từ RNA phân lập từ rễ lúa:
cDNA của gen OsNAC1 (Os06);
OsMADS56 (Os10), OsMADS26
(Os08).
- ðã xác ñịnh ñược 4 gen của các yếu
tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng bộ rễ lúa:
OsNAC1 (Os06g46270);
OsMADS25 (Os04g23910);
OsMADS26 (Os08g02070);
OsMADS56 (Os10g39130).
Lần 2:
Nội dung 1: Nghiên cứu
tạo các cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện các
yếu tố phiên mă ở rễ lúa
01/2009 –
12/2009
- ðã thiết kế 6 cặp mồi ñặc hiệu và
tách dòng các cDNA tương ứng.
ðã thiết kế thành công các vector
pDONR207 mang các gen của các
yếu tố phiên mã OsNAC1;
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.

Nội dung 2: Chọn lọc,
phân tích, ñánh giá các
cây lúa chuyển gen

OsMADS26; OsMADS56.
- ðã thiết kế thành công vector
pC5300.OE mang gen nghiên cứu
OsMADS26.
- ðã xác ñịnh và tạo ñược 7 ñoạn
GST khác nhau từ các cDNA tương
ứng: OsNAC1; OsMADS26;
OsMADS25; OsMADS56
- ðã thiết kế thành công 2 vector gây
bất hoạt gen OsMADS26 mang 01
trong 02 trình tự ñích khác nhau
(GST1 và GST2) với vector gốc là
vector RNAi: pANDA.
- ðã xây dựng thành công mô hình
tái sinh cây lúa invitro phục vụ công
tác chuyển gen quan tâm.
- ðã xây dựng thành công quy trình
chuyển gen với các vector siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
- ðã chọn lọc và ñánh giá các dòng
lúa chuyển gen siêu biểu hiện và bất
hoạt

II Kiểm tra ñịnh kỳ
Lần 1

III Nghiệm thu cơ sở
……


Chủ nhiệm ñề tài
(Họ tên, chữ ký)






Lê Quỳnh Mai
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và ñóng dấu)


LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài nghiên cứu “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố
phiên mã liên quan ñến quá trình phân hóa của rễ lúa bằng phương pháp gây siêu
biểu hiện và bất hoạt RNA (RNA interference)” chủ nhiệm ñề tài xin chân thành
cảm ơn tới:
- Bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
- Lãnh ñạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
- Lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp.
- Lãnh ñạo phòng thí nghiệm Trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật.
- Các nhà nghiên cứu thuộc trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông
nghiệp (CIRAD).
- Cùng toàn bộ những người tham gia thực hiện ñề tài.

ðã ủng hộ, tạo ñiều kiện thuận lợi về mọi mặt tài chính, hành chính, trang thiết
bị và nhân lực cho việc thực hiện và hoàn thành ñề tài trong thời gian quy ñịnh.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2010
Chủ nhiệm ðề tài



TS. Lê Quỳnh Mai

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC CÁC BẢNG 5
I. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11
1.1. Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh trưởng của
cây lúa 11
1.2. Nghiên cứu xác ñịnh hệ gen liên quan ñến khả năng kháng hạn ở cây trồng
15
1.3. Khám phá ra các gen “hàng ñầu” tham gia vào việc cải thiện khả năng
kháng hạn của thực vật thông qua các thành tựu chuyển gen 16
1.4. Vai trò của các yếu tố phiên mã trong việc ñiều khiển biểu hiện của gen
phản ứng với hạn 18
1.5. Biểu hiện của các yếu tố phiên mã phụ thuộc hàm lượng ABA nội bào
trong ñiều kiện hạn hán 19
1.6. Giới thiệu chung về ñối tác cùng nghiên cứu trong ñề tài 20
1.7. Mục tiêu của ñề tài 22

1.8. Các nội dung nghiên cứu trong nước 23
1.8.1. Nghiên cứu tạo ra các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố
phiên mã ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen này. 23
1.8.2. Phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen 24
1.9. Các nội dung và kế hoạch hợp tác với ñối tác nước ngoài 24
1.10. Kế hoạch thực hiện 26
CÁC NỘI DUNG CHÍNH CẦN THỰC HIỆN 28
II. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
2.1. VẬT LIỆU 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.2.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng của bộ rễ lúa 30
2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA từ các mẫu khác nhau như lá non, thân
và rễ cây lúa. 31
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu thiết kế cặp mồi ñặc hiệu 32
2.2.4. Sinh tổng hợp cDNA tương ứng từ RNA ñược phân lập từ mẫu rễ lúa.
33
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

2
2.2.5. Nghiên cứu thiết kế các vector siêu biểu hiện và bất hoạt gen ñích
quan tâm 34
2.2.6. Phương pháp xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả cao cho các
giống lúa kháng hạn. 40
2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào
callus lúa 41
2.2.8. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ kiểu hình 43
2.2.9. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ sinh lý 44

III. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46
3.1. Nghiên cứu tạo các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố phiên mã
ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen nghiên cứu. 46
3.1.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng bộ rễ lúa 46
Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 47
3.1.2. Nghiên cứu thiết kế các gen RNAi có khả năng gây bất hoạt các gen
của các yếu tố phiên mã nghiên cứu. 56
3.1.3. Chuyển các plasmid thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien 62
3.2. Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen 71
3.2.1. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình 71
3.2.2. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý 75
3.2.3. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình 79
3.2.4. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý 83
3.3. Các kết quả ñạt ñược với sự hợp tác của trung tâm CIRAD, Pháp 87
3.3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen OsMADS26 (ORF8) và số lượng copy
TDNA trong các dòng lúa biến nạp với vector PC5300.OE thế hệ T0 và T1
bằng Southern blot 87
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của GST1 và GST2 và số lượng copy T-DNA
trong các dòng lúa biến nạp với vector gây bất hoạt gen pANDA thế hệ T0 và
T1 bằng Southern blot 90
3.3.3. Phân tích biểu hiện của gen OsMADS26 (ORF8) trong các dòng lúa
biến nạp với vector PC5300.OE hoặc pANDA bằng kỹ thuật northern blot 92
IV. CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT VÀ ðÁNH GIÁ KẾT QUẢ ðỀ TÀI 94
4.1. KẾT QUẢ KHOA HỌC 94

4.2. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG VÀ ðÀO TẠO NHÂN LỰC 97
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

3
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99
5.1. KẾT LUẬN 99
5.2. KIẾN NGHỊ 100
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 101

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

4
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT


2.4-D: Dichlorophenoxy Acetatic acid
DNA-T: DNA transfer
AS: Acetosyringone
bp: cặp base
BSA: Bovine Serum Albumin
cDNA: complementary DNA
DEPC: Diethylpyrocacbonte
DNAg: hệ gen DNA
dNTPs: deoxy nucleotid triphosphat
E.coli: Escherichia coli
EDTA: Axit ethylene dinitriotet acetic
GST: Gene Sequence Target
hpRNA: hairpin RNA (RNA dạng kẹp tóc)
Hpt: Hygromycin
Kb: Kilobase

LB: Môi trường Luria-Bertani
ORF: Open reading frame
PCR: Polymerase Chain Reaction
pH: Potential Hydrogen
RNAi: Axít ribonucleic interference
RNase: ribonuclease
RT: Reverse transcription
SDS: sodium dodecyl sulfate
TAE: tris-acetate-EDTA
Taq: Thermus aquaticus polymerase
TE: Tris-EDTA
Tm: Nhiệt ñộ bắt cặp
UV: ultra-violet
v/p: vòng/phút

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

5
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 47
Bảng 3.2. Các ñoạn GST thuộc các gen yếu tố phiên mã khác nhau 59
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4-D (mg/l) ñến khả năng tạo mô sẹo từ hạt lúa
(giống Nipponbare) 62
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn hydrate carbon 63
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng ñộ agar 64
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh64
Bảng 3.7. Kết quả tái sinh của giống nipponbare trên môi trường tối ưu 65

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

6
DANH MỤC CÁC HÌNH



Hình 3.1. A: Rễ cây lúa phát triển sau 10 ngày, B: Mẫu tách chiết RNA từ rễ lúa 46
Hình 3.2. Ảnh kiểm tra gắn ñoạn gen Os06 (OsNAC1) và Os10 (OsMADS56) vào
vector tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn 49
Hình 3.3. Ảnh kiểm tra gắn ñoạn gen Os04 (OsMADS25) vào vector tách dòng
bằng cắt enzyme giới hạn 50
Các giếng 1→ 4 đều cho thấy ñã gắn thành công ñoạn gen nghiên cứu vào vector
tách dòng. 50
Hình 3.4. Ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân ñoạn gen Os06 (A) và Os08 (B),
Os10 (C) nhờ phản ứng RT-PCR 51
Hình 3.5. Sơ ñồ ñặc ñiểm vector pDONR207 52
Hình 3.6. Ảnh ñiện di kiểm tra ñoạn trình tự gắn vào vector pDONR207 53
Hình 3.7. Sơ ñồ cấu trúc vector siêu biểu hiện pC5300 54
Hình 3.8. Ảnh ñiện di kiểm tra ñoạn trình tự gắn vào vector pC5300 55
Hình 3.9. Sơ ñồ thiết kế vector pC5300 siêu biểu hiện gen OsMADS26 55
Hình 3.10. Ảnh ñiện di kiểm tra nhân các ñoạn GST bằng PCR 59
Hình 3.11. Sơ ñồ thiết kế vector RNAi (vector pANDA) và cấu trúc RNA kẹp tóc
tạo thành trong thực vật 61
Hình 3.12. Hệ thống tái sinh giống Nipponbare 66
Hình 3.13. Quá trình tạo callus lúa giống Nipponbare tạo vật liệu cho chuyển gen
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 67
Hình 3.15. Chọn lọc các callus sau khi ñồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens68
Hình 3.15. Tái sinh và nhân các dòng lúa chuyển gen 69
Hình 3.16. Thử khả năng nảy mầm của hạt lúa chuyển gen trên môi trường có
kháng sinh Hygromycin 70

Hình 3.17. Hình thái rễ sau thay ñổi từ 2 ñến 7 ngày tuổi 71
Hình 3.18. Hình thái bộ rễ lúa ở các dòng chuyển gen khác nhau (7 ngày tuổi) 72
Hình 3.19. So sánh mật ñộ rễ của các dòng lúa chuyển gen 73
Hình 3.20. So sánh tính hướng trọng lực của các dòng lúa chuyển gen 74
Hình 3.21. ðiện di kiểm tra chất lượng RNA tách chiết trên gel Agarose 1% 75
Hình 3.22: Mức ñộ biểu hiện của gen OsMADS26 ở các bộ phận khác nhau của cây
lúa và trong ñiều kiện stress áp suất thẩm thấu và mặn. 76
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

7
Hình 3.23. So sánh sự sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) 77
Hình 3.24. So sánh chiều cao thân của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) 78
Hình 3.25. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng siêu biểu hiện gen 79
Hình 3.26. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng gât bất hoạt gen 80
Hình 3.27. Sự tăng trưởng chiều cao cây của các dòng bất hoạt gen OsMADS26 81
Hình 3.28. So sánh số nhánh tạo thành của dòng bất hoạt gen với cây ñối chứng 81
Hình 3.29. Thời gian ra hoa của các dòng lúa chuyển gen 82
Hình 3.30. Hình thái bộ rễ lúa sau thu hạt của các dòng lúa chuyển gen 83
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 84
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 85
Hình 3.32. So sánh hàm lượng diệp lục (Pi) của các dòng lúa chuyển gen gây siêu
biểu hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 86
Hình 3.33. Mô hình minh họa thí nghiệm southern blot 88
Hình 3.34. Sơ ñồ cắt enzyme giới hạn cho thí nghiệm southern blot 89

Hình 3.35. Kết quả lai các dòng DNA trên màng với mẫu dò ORF8 89
Hình 3.36. Xác ñịnh số lượng bản sao trong các dòng cây bằng mẫu dò HPT 90
Hình 3.37. Sơ ñồ cắt enzyme giới hạn cho thí nghiệm southern blot 91
Hình 3.38. Kết quả lai các dòng DNA với mẫu dò GST ñặc hiệu và HPT 91
Hình 3.39. Ảnh kết quả lai các dòng RNA khác nhau tách chiết từ cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện với các mẫu dò ORF8 92
Hình 3.40. Ảnh kết quả lai các dòng RNA khác nhau tách chiết từ cây chuyển gen
bất hoạt với các mẫu dò GST1 và GST2 93

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

8
LỜI MỞ ðẦU


Thực vật là những sinh vật không dễ biến ñổi và chúng phải thích nghi với
ñiều kiện sống bất lợi của môi trường chủ yếu bằng ñiều khiển sự sinh trưởng
và phát triển của chúng cùng với sự thay ñổi về mặt sinh lý và sinh hóa. Các
nhân tố phiên mã ñiều khiển sự biểu hiện gen ñể phản ứng trước các tín hiệu
của môi trường và sinh lý. Một nhân tố phiên mã ñược mã hóa bởi một gen
ñơn ñộc nhưng ñiều khiển sự biểu hiện của nhiều gen khác dẫn ñến sự hoạt
hóa của một phức hợp các cơ chế và do vậy là mục tiêu ở mức ñộ sinh học
phân tử ñể cải tiến khả năng chống chịu của cây trồng với các ñiều kiện sống
khắc nghiệt. Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực quan
trọng nhất. Do ñó, cây lúa ñã và ñang ñược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm.
ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng nhanh
hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo. ðối với các nước ñang
phát triển, hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng
nghiêm trọng tới sản lượng cây trồng; việc nghiên cứu tạo ra các giống lúa
chịu hạn tốt và ổn ñịnh vẫn là biện pháp tối ưu trong tình hình hiện nay.

Việc xác ñịnh những gen chìa khóa tham gia vào quá trình phân nhánh bộ
rễ ở cây lúa có thể cho phép sử dụng các chỉ thị phân tử vào việc chọn lọc
những tính trạng cấu trúc bộ rễ lúa phù hợp với khả năng chịu hạn của lúa.
Mục tiêu của dự án là nghiên cứu chức năng của một số gen mã hóa một số
yếu tố phiên mã ở rễ lúa và vai trò của các yếu tố này trong sự hình thành
hình thái bộ rễ lúa. ðề tài phải giải quyết một loạt các vấn ñề kỹ thuật mới
trong ñó ñáng kể nhất là công nghệ RNAi. Công nghệ này lần ñầu tiên ñược
nghiên cứu ở nước ta.
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

9
ðề tài “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan ñến
quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA (RNA interference)”, ñược thực hiện trên cơ sở hợp tác
khoa học với nhóm nghiên cứu “Phát triển và thích nghi của cây lúa”
(DAR) của UMR 1098 “Phát triển và thích nghi của thực vật” thuộc CIRAD
(Trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông nghiệp, Pháp). Mục tiêu của
ñề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn ñề sau: i) Xác ñịnh 1-2
gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và chức năng bộ rễ ở
lúa; ii) Nghiên cứu thiết kế 1-2 vector mang gen siêu biểu hiện và mang gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt gen của các yếu tố phiên mã nghiên cứu; iii)
Nghiên cứu quy trình chuyển các gen nghiên cứu vào lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens; và iv) Phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen
bằng phương pháp sinh học phân tử và kiểu hình.
ðề tài ñã thực hiện ñầy ñủ các nội dung nghiên cứu và thu ñược những
kết quả chính như sau:
- Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và
chức năng của bộ rễ lúa: Xác ñịnh ñược bốn gen có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng của bộ rễ lúa. ðó là: OsNAC2, OsMADS25,
OsMADS26 và OsMADS56.

- Nghiên cứu thiết kế các gen RNAi có khả năng gây bất hoạt các gen
của các yếu tố phiên mã nghiên cứu: Thiết kế ñược các vector pC5300
mang gen siêu biểu hiện và vector pANDA mang gen RNAi có khả
năng gây bất hoạt các gen của các yếu tố phiên mã nghiên cứu.
- Chuyển các plasmids thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa
Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

10

thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Nghiên cứu tối ưu hóa hệ thống tái
sinh in vitro ở lúa thích hợp cho việc tái sinh callus chuyển gen.
- Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen: Phân tích, ñánh
giá các dòng cây chuyển gen siêu biểu hiện hoặc bất hoạt gen
OsMADS26 ở mức ñộ kiểu hình và ở mức ñộ sinh lý.

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

11

I. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU



1.1. Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh
trưởng của cây lúa
Lúa là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu cho hơn một nửa dân số thế
giới trong ñó có 17 nước thuộc châu Á và Thái Bình Dương
(
Theo thông báo của

FAO (năm 2005), 6-20% trong tổng sản lượng lương thực hàng năm của cả
thế giới (tương ñương với khoảng 120 tỉ USD) bị thất thoát do những tác nhân
phi sinh học như: hạn, lạnh, mặn, lũ lụt…ðối với các nước ñang phát triển,
hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng nghiêm
trọng tới sản lượng cây trồng. Chỉ tính riêng cho vùng nhiệt ñới, hàng năm ñã
có tới 20 triệu tấn lương thực bị mất mát do khô hạn gây ra. Ở Việt Nam, diện
tích canh tác lúa khoảng 4,36 triệu ha, trong ñó có 2,2 triệu ha là ñất thâm
canh, chủ ñộng tưới tiêu nước, còn lại hơn 2,1 triệu ha là ñất canh tác lúa có
những khó khăn: hạn, mặn, úng [31].
Nước thường xuyên ñược coi là nguồn năng lượng dồi dào ở những khu
vực có ñộ ẩm cao như ðông Nam Á trong ñó có Việt Nam, tuy nhiên nay ñã
trở thành một nhân tố hạn chế trong sản xuất nông nghiệp [14]. Trong những
năm vừa qua, hạn hán kéo dài xảy ra ở một số vùng thuộc ñồng bằng sông
Cửu Long và miền Trung Việt Nam làm giảm mực nước của các con sông
dẫn ñến việc nước biển tràn vào các kênh tưới tiêu, năng suất lúa trong những
khu vực bị hạn hán này ñã bị giảm từ 20 - 60%. Việc sản xuất lúa gạo ở ðông
Nam Á cũng như ở Việt Nam cần phải bắt kịp với sự bùng nổ dân số của khu