Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật polymerase chain reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo - cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 30

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Hòa

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT POLYMERASE
CHAIN REACTION TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM ÂM
ĐẠO - CỔ TỬ CUNG DO Chlammydia trachomatis TẠI
BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN

Hà Nội, Năm 2011


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis. .........................................................................3
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis ...............................6
1.2.1. Nuôi cấy ...........................................................................................................6
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) .................7
1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA) .. 8
1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs). ... 8

1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nƣớc .............10
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................10
1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................18
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................23
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................23
2.1.1. Đối tƣơ ̣ng nghiên cƣ́u ....................................................................................23
2.1.2. Thời gian nghiên cứu. ....................................................................................23
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................23
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U .......................................................................23
2.2.1. Phƣơng pháp chọn mẫu và cỡ mẫu ................................................................ 23
2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm .......................................................................................24
2.2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ...............................................................................24
2.2.2.2. Xử lý mẫu .................................................................................................24
2.2.2.3. Tách chiết ADN .......................................................................................25
2.2.2.4. Tối ƣu hóa phản ứng PCR ........................................................................25
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR ......................................................29
2.2.2.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng .........................................................30
2.2.2.7. Xác đinh
̣ tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo ,
cổ tƣ̉ cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình t ừ tháng 4 đến tháng 10
năm 2011 ...............................................................................................................31
2.2.2.8. Điê ̣n di, phân tích kế t quả ........................................................................31
2.2.3. Xƣ̉ lý số liê ̣u ...................................................................................................32
54


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................33
3.1. Tố i ƣu hóa phản ƣ́ng PCR phát hiê ̣n Chlamydia trachomatis .............................33
3.1.1. Nồng độ MgCl2 ..............................................................................................33
3.1.2. Nồng độ mồi ..................................................................................................35

3.1.3. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi .......................................................................37
3.1.4. Số chu kỳ........................................................................................................40
3.2. Độ nhạy của kỹ thuật PCR...................................................................................43
3.3. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR .............................................................................44
3.4. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR ..............................................................44
KẾT LUẬN ..................................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................50

55


DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis……………………...3
Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis………………………………..4
Hình 1.3. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở một số nƣớc Châu Âu……………………10
Hình 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2…….34
Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6…….35
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ mồi KL5/KL6……………………..36
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ mồi KL1/KL2……………………..36
Hình 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2………………...38
Hình 3.6. Ảnh diện di kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6………………..38
Hình 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ƣu thời gian gắn mồi KL5/KL6……………….39
Hình 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ƣu thời gian gắn mồi KL1/KL2…………….….40
Hình 3.9. Ảnh diện di kết quả tối ƣu chu kỳ phản ứng……………………………40
Hình 3.10. Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần trên vi khuẩn C. trachomatis……43

Hình 3.11. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm…………………………..…45
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất……………………………..…41
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR lần thứ nhất…………………….….42
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR lần 2…………………………………….…42

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR lần 2……………………………….43
Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm C.trachomatis…………………………………….45
Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi………………………………..46
Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực……………………………….47

56


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

C. trachomatis

Chlamydia trachomatis

DFA

Direct Fluorescent Antibody

EIAs

Enzyme Immuno Assays

LPS

Lipopolysaccharide

MOMP

Major Outer Membrane Protein

NAATs

Nucleic Acid Amplication Tests

PCR

Polymerase Chain Reaction

TPHA

Treponema Pallidum Hemagglutination Assay

58


MỞ ĐẦU
Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà
các nƣớc trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục. Viêm
đƣờng sinh dục do Chlamydia trachomatis đƣợc coi là bệnh lây truyền qua đƣờng tình
dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thƣờng gây viêm niệu đạo,
viêm cổ tử cung. Tuy nhiên nế u không điề u tri ̣có thể dẫn đế n các biế n chƣ́ng

nhƣ

viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh do tổn thƣơng ống
dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao.
Tổ chức Y tế thế giới ƣớc tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
Chlamydia trachomatis đƣợc phát hiện mới [34]. Bệnh do Chlamydia trachomatis hay
gặp ở những ngƣời trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ.
Các nghiên cứu mới đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu

Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi,
tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 2000-2005 [15, 18].
Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đây vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia
trachomatis mới đƣợc chú ý. Một vài nghiên cứu đƣa ra tỷ lệ khoảng 30% các trƣờng
hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đƣờng âm đạo bất thƣờng là do Chlamydia
trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đƣờng sinh dục là
có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, ngƣời bệnh
hoàn toàn không biết mình nhiễm vi khuẩn [2,9].
Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ngƣời ta thƣờng dùng xét nghiệm
nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis. Tuy
nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình
vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài.
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật
sinh học phân tử đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các
vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain
Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu
đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán
1


khác. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân.
Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công
tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứ ng
dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia
trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu:
- Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi
khuẩn Chlamydia trachomatis.
- Xác đi ̣nh được tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo,
cổ tử cung.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis.
Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp
Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9].
Về hình thái khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu
hoặc hình bầu dục, kích thƣớc khác nhau, là vi khuẩn Gram âm có màng là
lipopolisaccharide. Vì thiếu một số enzyme tổng hợp các hợp chất cao năng sử dụng
cho tế bào, vi khuẩn này phải ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót
bên ngoài tế bào.
Hệ gen của Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide
với 894 trình tự mã hóa cho protein.

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis
( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains
among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol. 15.(9))
Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa 7 đến 10 bản sao của plasmid có
kích thƣớc 7.5 kb. Trình tự nucleotide của plasmid là trình tự bảo thủ cao (có dƣới 1%
nucleotide thay thế), chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá các gen và
các kháng nguyên. Mặc dù chức năng của plasmid còn chƣa xác định hết nhƣng trình

3


tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong tế bào chứng tỏ nó có vai trò quan trọng
đối với vi khuẩn C.trachomatis.
C.trachomatis đƣợc chia thành 15 loại tuýp huyết thanh khác nhau bao gồm:

Tuýp huyết thanh (A-K), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia và L2a. Trong đó tuýp A, B, Ba và C
gây bệnh mắt hột. Tuýp D, E, F, G, H, I, J và K gây bệnh viêm đƣờng sinh dục. Tuýp
L1, L2 và L3 gây bệnh lympho hạt, một bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu ở bẹn
[2,9].
Chu kỳ phát triển của C.trachomatis trong bào tƣơng tế bào kéo dài 48-72 giờ
[34]. Vòng đời của C.trachomatis gồm 2 giai đoạn: Thể cơ bản và thể lƣới.
- Thể cơ bản (Elementary Body- EB) là những tế bào tròn có đƣờng kính
khoảng 0.3m, nhân đậm. Thể này xâm nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào.
- Thể lƣới (Reticulate Body- RB): Sau khi xâm nhập vào tế bào C.trachomatis
chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thể lƣới (đƣờng kính 1m), sinh sản theo hình
thức phân đôi kiểu trực phân khoảng 2-3 giờ một lần. Sau đó thể lƣới lại chuyển thành
thể cơ bản và giải phóng khỏi tế bào thông qua hình thƣ́c ngoại tiế t bào (exocytosis).
Thông thƣờng mỗi thể lƣới giải phóng 100-1000 thể cơ bản rồi tiếp tục xâm nhập vào
các tế bào mới.

Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek).
4


Đường truyền bệnh:
Vi khuẩn C.trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả
năng sống sót ngoài tế bào nên đƣờng truyền chủ yếu là đƣờng tình dục hoặc lây từ mẹ
sang con khi ngƣời mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis.
Khả năng gây bệnh:
C.trachomatis có khả năng gây nên 2 bệnh chính ở ngƣời: Bệnh mắt hột và
bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, trong đó bệnh sinh dục tiết niệu do nhiều tuýp (D,
E, F, G, H, I, J và K) gây ra, tăng nhanh số lƣợng ngƣời mắc.
Trẻ sơ sinh có thể bị mắc bệnh viêm kết mạc hoặc viêm phổi do C.trachomatis
nếu bị lây từ mẹ.
Ở phụ nữ

Có tới 75% phụ nữ không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và triệu chứng nếu
có cũng không điển hình [3], nên việc chẩn đoán và sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn
thuần dựa vào triệu chứng lâm sàng hoàn toàn không khả thi. Cho đến khi có biểu hiện
viêm vùng chậu hoặc khi bệnh nhân khám vô sinh phát hiện có tổn thƣơng ống dẫn
trứng thì C.trachomatis đã gây biến chứng khó phục hồi. Vì vậy cần thiết phải có
những phƣơng pháp chẩn đoán chính xác và phù hợp giúp phát hiện C.trachomatis
nhằm ngăn chặn những hậu quả mà nó gây ra.
Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis có thể gây viêm âm đao, cổ tử cung và niệu
đạo. Các biến chứng thƣờng gặp ở bệnh nhân nhiễm C.trachomatis mạn tính bao gồm:
- Tắc vòi trứng ở phụ nữ: Một trong những nguyên nhân gây tắc vòi trứng là
do viễm nhiễm ở vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vòi trứng do
C.trachomatis.
- Chửa ngoài tử cung: Nguyên nhân viêm nhiễm vòi trứng do C.trachomatis
khiến phôi thai tắc ngay tại điểm hẹp. Phôi thai lớn dần lên, đến một mức nào đó sẽ
phá vỡ các mạch máu nơi nó đậu lại trên vòi trứng, gây chảy máu dữ dội trong ổ bụng,
có thể làm thai phụ tử vong nhanh chóng. Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ
nhiễm C.trachomatis bị chửa ngoài tử cung.
5


- Viêm vùng chậu: Phần lớn, viêm vùng chậu do vi khuẩn lậu và C.trachomatis
gây ra. Viêm vùng chậu là một bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới
40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, trong số đó có 20%
bị vô sinh làm ảnh hƣởng không nhỏ tới chất lƣợng cuộc sống.
- C.trachomatis có thể kết hợp cùng với HPV (Human papilloma virus) – một
virus gây u nhú có khả năng đƣa đến ung thƣ cổ tử cung.
Ở nam giới
Ở nam giới triệu chứng lâm sàng của nhiễm C.trachomatis càng mờ nhạt hơn,
biểu hiện đầu tiên là viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi là viêm niệu đạo
không do lậu, sau đó có thể dẫn đến viêm mào tinh hoàn. Tại túi tinh, vi khuẩn gây độc

cho tinh trùng, làm giảm số lƣợng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất lƣợng
giảm xuống. Đây chính là lý do gây vô sinh nam.
Tuy nhiên, vì C.trachomatis lây qua đƣờng tình dục nên nam giới nhiễm bệnh
nếu không đƣợc phát hiện và điều trị sẽ là nguồn tái nhiễm cho bạn tình. Ngoài ra, một
số nghiên cứu còn cho thấy C.trachomatis ở nam giới có khả năng bám vào tinh trùng
và theo tinh trùng đi qua cổ tử cung lên ống dẫn trứng, giúp phát tán C.trachomatis
trong vòi trứng của phụ nữ.
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32]
1.2.1. Nuôi cấy
Để phát hiện C.trachomatis, ngƣời ta có thể dùng biện pháp nuôi cấy để chờ vi
khuẩn gia tăng số lƣợng. C.trachomatis không phát triển ngoài tế bào sống đƣợc nên
không thể nuôi cấy theo phƣơng pháp thƣờng dùng mà phải tiến hành nuôi cấy trên
các tế bào nhƣ McCoy hoặc Hela 229, tế bào nhau thai...
- Đối với bệnh mắt hột, ngƣời ta lấy nang bằng cách nạo các nang rồi cấy vào
các tế bào nhau thai ngƣời để phát hiện các hạt vùi trong nguyên sinh chất của tế bào.
- Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới);
chất tiết cổ tử cung, âm đạo (nữ giới) nuôi cấy trong môi trƣờng có chứa tế bào
McCoy hoặc Hela 229 ở 370C- 5% CO2. Quan sát tính chất xâm nhiễm sau 48 giờ nuôi
6


cấy và phát hiện C.trachomatis bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể
đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) hoặc
protein màng (major outer membrane protein- MOMP).
Xét nghiệm này đƣợc đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong nhóm xét nghiệm vì có
độ đặc hiệu rất cao (100%), cho phép lƣu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát hiện
chủng kháng thuốc. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là đòi hỏi thời gian dài, phải
bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, đội ngũ
cán bộ thành thạo về nuôi cấy tế bào. Bên cạnh đó xét nghiệm này có độ nhạy thấp
(70-85%), thấp hơn so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests–

NAATs) [32].
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays– EIAs)
Phƣơng pháp này dựa trên phản ứng hóa miễn dịch giúp phát hiện kháng
nguyên LPS của C.trachomatis bằng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đƣợc đánh dấu
bằng enzyme, phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hóa enzyme chuyển cơ chất
không màu thành có màu, phát hiện đƣợc bằng phản ứng tạo màu hay đo bằng quang
phổ kế.
Khi mẫu xét nghiệm đƣợc thêm vào màng, kháng nguyên của C.trachomatis sẽ
gắn với kháng thể đƣợc phủ sẵn trên màng. Sau đó bổ sung kháng thể đặc hiệu với
C.trachomatis liên kết với kháng nguyên đã đƣợc bắt giữ bởi kháng thể trên màng.
Dung dịch enzyme đƣợc thêm vào sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu của
C.trachomatis. Bƣớc tiếp theo là rửa để loại bỏ các thành phần không gắn với màng.
Bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzyme vào màng. Nếu có kháng nguyên, cơ chất phản
ứng với enzyme tạo sự thay đổi màu sắc phát hiện và đo đƣợc bằng máy quang phổ kế.
Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn
còn sống, rẻ tiền hơn nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải. Tuy vậy nó có
nhƣợc điểm là không sử dụng đƣợc với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp
và âm đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các mẫu này, đƣợc sử dụng sàng lọc
quần thể có tỷ lệ dƣơng tính thấp (≤ 5%) [32]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp hơn
NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào.

7


1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody- DFA)
Phƣơng pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu đƣợc đánh
dấu huỳnh quang để phát hiện trực tiếp kháng nguyên vỏ LPS hay kháng nguyên mã
hóa protein màng MOMP.
Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập, mẫu đƣợc đánh dấu tên và địa chỉ bệnh nhân. Sau
đó, mẫu đƣợc phết nhẹ nhàng lên lam kính và đƣợc cố định ngay lập tức bằng

methanol. Sau khi đƣợc làm khô trong không khí từ 2 đến 3 phút, lam kính đƣợc vận
chuyển đến phòng thí nghiệm, nhuộm bằ ng kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu
với C.trachomatis. Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có trong mẫu. Tiếp
đó là bƣớc rửa để loại bỏ những kháng thể không liên kết. Quan sát dƣới kính hiển vi
huỳnh quang, mẫu dƣơng tính C.trachomatis dạng cơ bản màu xanh táo tƣơng phản
với màu đỏ đất của tế bào.
Xét nghiệm áp dụng đƣợc cho nhiều loại mẫu khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn
còn sống, đòi hỏi kỹ năng xét nghiệm vừa phải, thích hợp chẩn đoán trên các đối tƣợng
có nguy cơ cao. Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào
nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ
kháng thể để kết hợp, kính hiển vi huỳnh quang chất lƣợng tốt. Kỹ thuật này không
thích hợp cho số lƣợng mẫu lớn và đối tƣợng có nguy cơ thấp, độ nhạy thấp hơn
NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào [32].
1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs).
NAATs là kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học để
phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm, độ nhạy trên 90%,
độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật NAATs có ƣu điểm là có thể áp
dụng ở những nơi không có khả năng nuôi cấy, xét nghiệm không đòi hỏi vi khuẩn còn
sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày).
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là xét nghiệm có
độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho sự phát hiện C.trachomatis [21]. Nhiều
nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm
chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
8


sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch quế t cổ tử cung hoă ̣c trong mẫu nƣớc tiể u của bệnh
nhân với các cặp mồi trên plasmid, trên gen mã hóa protein màng hoặc trên rRNA.
Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể giảm độ nhạy do sự có mặt các chất ức chế có trong
mẫu hoặc không đủ độ nhạy để phát hiện mẫu chứa quá ít dạng cơ bản của vi khuẩn C.

trachomatis. Do vậy có thể tạo ra sản phẩm âm tính giả. Theo Saiki và cộng sự (1985)
[23], để phát hiện 25 ng DNA trên gel agarose nhuộm ethidium bromide sau 35 chu kỳ
khuếch đại từ 10 phân tử ban đầu ở mẫu cần hiệu quả khuếch đại cao hơn 90%.
Nested PCR là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay vì một cặp mồi nhƣ kỹ thuật
PCR cổ điển. Cặp mồi thứ hai đƣợc thiết kế nằm trong đoạn gen mà cặp mồi thứ nhất
khuếch đại. Quá trình chạy PCR lần đầu không khác gì PCR thông thƣờng. Sản phẩm
của phản ứng PCR lần đầu sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai cùng với cặp
mồi thứ hai. Kết quả sau hai lần PCR thu đƣợc sản phẩm đặc hiệu hơn nhiều. Kỹ thuật
này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện vi khuẩn ở mật độ rất thấp mà các phƣơng
pháp thông thƣờng khó có thể phát hiện đƣợc (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây đƣợc
xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm do
độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó. Theo Pamela Cribb và cộng sự (2002) [22], xét
nghiệm này có thể phát hiện DNA tƣơng ứng với nhỏ hơn 10 dạng cơ bản (EB) của vi
khuẩn C.trachomatis trong hỗn hợp phản ứng, cho phép phát hiện kết quả âm tính giả
và đáp ứng đƣợc với sự thay đổi ở các phòng thí nghiệm khác nhau.
Mẫu đƣợc xử lý để tách DNA của C.trachomatis. Các thành phần của phản ứng
PCR đƣợc thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl2. Các primer liên kết
với DNA đích đặc hiệu của C.trachomatis. Enzym Taq polymerase kéo dài mỗi trình
tự DNA sử dụng các nucleotide tự do để tạo trình tự DNA bổ sung. Quá trình khuếch
đại này xảy ra khi hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ trong máy luân nhiệt. Mỗi chu kỳ làm
tăng số lƣợng DNA đích theo hàm mũ. Sau khi khuếch đại, sản phẩm lần 1 đƣợc sử
dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm đƣợc
điê ̣n di trên gel agarose 1%, nhuô ̣m ethidium bromide và phân tić h trên hê ̣ thố ng chu ̣p
ảnh gel .
Xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên mẫu nƣớc tiểu
(độ nhạy của mẫu này thấp hơn mẫu dịch phết), nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ
quan hô hấp và âm đạo.
9

Xét nghiệm này độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với nuôi cấy tế
bào, có ƣu điểm là có thể áp dụng ở những nơi không có khả năng nuôi cấy , không đòi
hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày) [13, 17]. Nhƣợc điểm
của xét nghiệm này là yếu tố ngoại nhiễm cao, tuy vậy có thể tránh bằng cách sử dụng
đầu côn lọc và dùng enzyme uracil- N- glycosylase trong phản ứng.
1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nƣớc
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Số ngƣời
nhiễm
trên
100.000

Năm

Hình 1.3. Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở một số nước Châu Âu
Theo ECDC năm 2009 [15], tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis ở một số nƣớc
Châu Âu thay đổi từ năm 1998 đến năm 2007. Ở Thụy Điển và Phần Lan, nơi những
nghiên cứu đƣợc tiến hành từ đầu những năm 90, tỷ lệ này giảm ở đầu những năm 90
(tƣơng tự với tỷ lệ các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục khác ở Châu Âu) do sự thay
đổi thói quen sinh hoạt tình dục và mối lo từ hiểm họa AIDS. Tỷ lệ này tăng lên từ
năm 1995. Tại Anh và Đan Mạch, tỷ lệ này tăng dần theo mỗi năm, nguyên nhân có
thể do không đƣợc nghiên cứu từ đầu những năm 90, sử dụng các chẩn đoán có độ
nhạy cao hơn, đối tƣợng nghiên cứu nằm trong các nhóm có nguy cơ cao.
Theo một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này tại Châu Âu [20] cho thấy:
10


Phần Lan
Nghiên cứu 298 phụ nữ tuổi từ 18 đến 40, từ năm 1977 đến năm 1980 tại một

trung tâm y tế sinh viên tại Đại học Helsinki. Những phụ nữ trên đƣợc chăm sóc y tế
về các biện pháp tránh thai, vấn đề nội tiết và vô sinh hoặc đã đƣợc kiểm tra dịch phết
cổ tử cung định kỳ (đối với bệnh nhân có triệu chứng). Các xét nghiệm đƣợc sử dụng
là nuôi cấy dịch niệu đạo và dịch phết cổ tử cung. Bỏ qua mô tả về cách lựa chọn, tỷ lệ
đáp ứng, lý do đáp ứng và loại trừ. Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis là 6%.
Thụy Điển
Nghiên cứu thứ nhất (Persson et al., 1991) liên quan đến 306 phụ nữ tuổi từ 12
đến 25 (trung bình 22 tuổi) tại một phòng khám thai từ năm 1989 và 1990. Nuôi cấy
đƣợc sử dụng làm phƣơng pháp xét nghiệm, tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis là 6%.
Nghiên cứu thứ hai (Svensson et al., 1994) đã so sánh hai nhóm phụ nữ nghiên cứu
vào năm 1991- 1992. Nhóm A bao gồm 751 học sinh trung học với độ tuổi 16 đến 20
năm (trung bình 18 tuổi). Các tỷ lệ đáp ứng là 77%. Nhóm B bao gồm 619 phụ nữ đến
khám tại phòng khám kế hoạch hóa gia đình thanh thiếu niên và độ tuổi phù hợp với
nhóm A. Cả hai nhóm đã đƣợc thử nghiệm bằng cách sử dụng xét nghiệm EIA. Tỷ lệ
dƣơng tính C.trachomatis là 2% trong nhóm A và 6% trong nhóm B.
Vương quốc Anh
Nghiên cứu đƣợc tiến hành đầu tiên (Smith et al., 1991) liên quan đến 197 phụ
nữ tuổi từ 19 đến 58 (trung bình 30 tuổi) tại một phòng khám soi cổ tử cung. Nghiên
cứu cho thấy không có sự khác biệt giữa phụ nữ có dịch phết cổ tử cung bình thƣờng
và bất thƣờng. Bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung đƣợc sử dụng để nuôi cấy. Tỷ lệ
dƣơng tính C.trachomatis là 12%. Nghiên cứu thứ hai (Thompson và Wallace, 1994)
liên quan đến 287 phụ nữ từ 15 tuổi đến 40. Các mẫu dịch phết cổ tử cung đã đƣợc xét
nghiệm bằng kỹ thuật DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ nhỏ hơn 30 tuổi là
3.5% (5/145). Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis chung là 1.7%. Nghiên cứu thứ ba
(Hopwood và Mallinson, năm 1999) đánh giá trên các phụ nữ 16 đến 25 tuổi bằng xét
nghiệm DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis là 3.9%. Nghiên cứu thứ tƣ (Kirkwood et
al., 1999) nghiên cứu phụ nữ độ tuổi nhỏ hơn 20 tại phòng khám kế hoạch hóa gia
đình. Các mẫu đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Cỡ mẫu là 97 với 65 phụ nữ đến từ
11

thành phố. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này ở phụ nữ thành phố là 3% và thị trấn nông thôn
12.5%. Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis tổng thể là 6.2%.
Sự phổ biến của C.trachomatis phụ nữ không có triệu chứng ở Châu Âu dao
động từ 1.7 đến 17% tùy thuộc vào bối cảnh và quốc gia. Tỷ lệ dƣơng tính C.
trachomatis là 6% ở phụ nữ sử dụng biện pháp tránh thai và 4% với đối tƣợng phụ nữ
xét nghiệm dịch phết cổ tử cung [15].
James B. Mahony và cộng sự (1992) nghiên cứu tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis
ở nam giới ở những địa điểm đƣợc lựa chọn tại Hoa Kỳ [18]. Sự sàng lọc phụ thuộc
một phần vào chi phí sàng lọc C.trachomatis cũng nhƣ phƣơng pháp sàng lọc. Sàng
lọc ở những địa điểm có tỷ lệ nam giới dƣơng tính cao sẽ nâng cao chất lƣợng chƣơng
trình kiểm soát C.trachomatis. Đánh giá các chƣơng trình sàng lọc vi khuẩn này trong
số những ngƣời đàn ông không có triệu chứng tại các phòng khám từ năm 1995 đến
tháng 6 năm 2007, thông qua PubMed thu đƣợc kết quả: Tỷ lệ dƣơng tính trung bình
tổng thể là 5.1%. Mức cao nhất đƣợc quan sát thấy ở nam giới thử nghiệm tại các cơ
sở giam giữ trẻ vị thành niên (7.9%) và ngƣời lớn (6.8%), ở ngƣời da đen (6.7%), 1519 tuổi (6.1%) và 20-24 tuổi (6.5%). Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis trên nam giới cao ở
những địa điểm nhất định.
C.trachomatis là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến nhất ở Canada
[27]. Có gần 63.000 trƣờng hợp nhiễm C.trachomatis đƣợc báo cáo vào năm 2004, con
số cao nhất kể từ khi vi khuẩn này đƣợc đề cập vào năm 1990. Tỷ lệ nhiễm
C.trachomatis ở Canada đã tăng hơn 70% từ năm 1997. Tuy nhiên, những con số này
đánh giá thấp gánh nặng thực sự của bệnh nhƣ một số bệnh nhiễm trùng (40% đến
70% các bệnh nhiễm trùng) là không có triệu chứng nên không bị phát hiện. Có một sự
khác biệt giới tính trong tỷ lệ nhiễm C.trachomatis, phụ nữ chiếm hơn hai phần ba các
trƣờng hợp đƣợc báo cáo vào năm 2004. Trong khi số lƣợng các bệnh nhiễm trùng
C.trachomatis báo cáo ở phụ nữ cao hơn nam giới, tỷ lệ lây nhiễm đang gia tăng nhanh
hơn ở nam giới. Từ năm 1997, tỷ lệ ở nam giới nhiều hơn gấp đôi, từ 59 đến 129.5 trên
100.000 ngƣời, trong khi tỷ lệ ở phụ nữ tăng ít hơn một nửa, từ 168 đến 263 trên
100.000. Sự chênh lệch giới tính có thể một phần là do số phụ nữ đƣợc sàng lọc vi
khuẩn C.trachomatis lớn hơn. Việc cải thiện công nghệ chẩn đoán có thể sử dụng mẫu

nƣớc tiểu để xét nghiệm dự đoán sẽ làm tăng số lƣợng đàn ông kiểm tra. Tỷ lệ thanh
12


thiếu niên nhiễm C.trachomatis cũng không tƣơng xứng, gần 70% của tất cả các
trƣờng hợp đƣợc báo cáo xảy ra ở tuổi từ 15 đến 24 trong nghiên cứu. Trong năm
2004, tỷ lệ nhiễm trong thanh thiếu niên từ 15 đến 19 tuổi là 847 trên 100.000. Tỷ lệ là
1.087 trên 100.000 trong độ tuổi 20-24. Các vùng lãnh thổ phía Bắc nói riêng phải
chịu tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao, trung bình năm 2003 là gần 8 lần so với toàn
quốc. Nunavut có tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao nhất ở Canada vào năm 2003 (2.520
trên 100.000) trên 13 lần mức trung bình toàn quốc [27].
Năm 2004 ở Trinidad và Tobago bằng phƣơng pháp nested multiplex PCR với
các cặp mồi HO1, HO3, Chlam5/Chlam3, KL1/KL2 và Gon 5/Gon 3, các tác giả đã
phát hiện đồng thời hai loại vi khuẩn lậu và C.trachomatis trong mẫu nƣớc tiểu của
phụ nữ mang thai [19]. Các mẫu nƣớc tiểu đƣợc thu thập từ tháng 3 đến tháng 9 năm
2004 từ 273 phụ nữ mang thai khỏe mạnh ở các phòng khám tƣ nhân và bệnh viện. Tất
cả phụ nữ mang thai có mặt trong phòng khám tại thời điểm lấy mẫu đã đƣợc mời
tham gia. 15-20 ml mẫu nƣớc tiểu đầu dòng đƣợc thu thập, bảo quản ở 4°C, vận
chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, và bảo quản ở -20°C cho đến khi
DNA đƣợc tách chiết (trong vòng hai tháng). DNA từ nƣớc tiểu đƣợc chuẩn bị bằng
cách sử dụng Chelex 100 (Sigma Chemical Co, St Louis, Hoa Kỳ). Phản ứng PCR thứ
nhất và nested multiplex PCR đƣợc tối ƣu hóa ở các nồng độ MgCl2 1.5; 2 và 3 mM, ở
nhiệt độ thay đổi từ 45°C đến 65°C (sử dụng máy Gradient Master Cycler Eppendorf)
với mồi phát hiện vi khuẩn lậu hoặc C.trachomatis. Để tránh nhiễm, sử dụng bốn
phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị mẫu và PCR lần 1, một tạo phản
ứng nested PCR và một phòng điện di. Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di trên gel
agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát. Phản ứng PCR đầu tiên dùng 0.2
mM mỗi loại dNTP; 3 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi HO1, HO3, Chlam5 (5'CATTATGT-CGGAGTCTG-AGC- 3’), Chlam3 (5'-GGATGACTCAAGGAATAGTCG- 3’), 1 µl Internal Amplification Control (IAC), 0.4 pmol/µl mồi IAC (5'TGTTTGACAGCTTATCAT), 5 µl DNA mẫu, 0.5 U Taq polymerase, và nƣớc khử
ion đến 25 µl với chu trình nhiệt 94°C/15s, 60°C/30s, 72°C/60s, 40 chu kỳ. Phản ứng
nested PCR chứa 0.2 mM mỗi loại dNTP; 2 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi KL1,

KL2, Gon5 (5'-GTTCT-TGACGCTCC-ATATCG- 3’) và Gon3 (5'-ACGAGGCATTGAAGCAAAGC- 3’); 0.4 pmol/µl IAC; 1 µl sản phẩm PCR lần 1; 0.5 U Taq
polymerase, nƣớc khử ion đến 25 µl, chu trình nhiệt 94°C/15s, 58.5°C/30s,72°C/30s,
13


40 chu kỳ. Kết quả ở PCR lần 1 là 21 mẫu dƣơng tính C.trachomatis và 1 mẫu nhiễm
cả C.trachomatis và lậu. Kết quả phản ứng nested multiplex PCR thu đƣợc mẫu dƣơng
tính C.trachomatis là 57 mẫu (20.9%), trong đó 5 mẫu nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên.
Kết quả này chứng tỏ multiplex nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn hẳn
phản ứng PCR đơn.
Farhad B. Hashemi, Babak Pourakbari và Javad Zaeimi Yazdi [16] nghiên cứu
tổng cộng 123 phụ nữ đã kết hôn (tuổi từ 20-55) với triệu chứng viêm cổ tử cung đến
khám tại phòng khám sản phụ khoa của bệnh viện Mirza Kouchek Khan ở Tehran,
Iran, từ giữa tháng 12/2004 đến tháng 6/2005, chủ yếu do đau vùng chậu và (hoặc) tiết
dịch âm đạo. Tất cả những phụ nữ điều trị kháng sinh trong vòng ba tuần trƣớc khi đến
khám đƣợc loại trừ khỏi nghiên cứu. Ngƣời tham gia đồng ý hoàn thành một bảng câu
hỏi về nhân khẩu học và lịch sử bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục trƣớc khi kiểm tra
cổ tử cung. Sau khi loại bỏ chất nhầy cổ tử cung, mẫu dịch cổ tử cung đƣợc thu thập,
lƣu trữ ở -20°C. DNA chiết xuất bằng DIAtom Prep100 kit (IsoGene Inc, Moscow,
Nga) và bảo quản tại -20°C cho đến khi sử dụng. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn 377
bp của cryptic plasmid với chu trình nhiệt: 94°C/3.5 phút; (94°C/30s, 52°C/30s,
72°C/3 phút) x 30 chu kỳ trong 25 μl đệm phản ứng PCR (bao gồm 10 mmol/l Tris,
pH 8,3; 50 mmol/l KCl; 2.5 mmol/l MgCl2 và 0.1% gelatin); 0.2 mmol/l mỗi loại
dNTP; 2.5 U Taq DNA polymerase, và 0.5 μmol/µl mỗi loại mồi BP1 (5’AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3’) và BP2 (5’-TTCTGGCCAAGAATTATCC-3’).
Tỷ lệ nhiễm trùng sinh dục do C.trachomatis trên phụ nữ đã kết hôn ở Iran là 17%
(cao hơn tỷ lệ 7% báo cáo tại nƣớc này vào đầu những năm 1980). Mặc dù các bệnh
nhân trong nghiên cứu không phải là đại diện chung dân số (bao gồm cả phụ nữ không
có triệu chứng), hiện tại tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao hơn so với tỷ lệ 4-11% tại
Slovenia, Hà Lan, Colombia, Canada, và Hoa Kỳ. Sự khác biệt tỷ lệ trong nghiên cứu
này so với gần đây báo cáo từ Tehran có thể liên quan đến sự cải thiện độ nhạy của xét

nghiệm cũng nhƣ đối tƣợng bệnh nhân và các mẫu phân tích. Kết quả cần đƣợc khẳng
định bởi cỡ mẫu lớn hơn.
Theo các công trình nghiên cứu của Gaydos CA, Svensson LO [20], tần suất
nhiễm C.trachomatis cao gặp ở đối tƣợng trẻ dƣới 25 tuổi, có lẽ do nam nữ thanh niên
các nƣớc Châu Âu thƣờng có quan hệ tình dục tự do ngoài hôn nhân, vì vậy họ dễ mắc
các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục trong đó có nhiễm C.trachomatis. Tỷ lệ nhiễm
14


vi khuẩn này ở ngƣời lớn tại Nam Thái Bình Dƣơng là 73%, Papua New Guinea là
20%, Nhật Bản 7%, Senegan 7%.
Một nghiên cứu của Achchhe L Patel và cộng sự [11] trƣờng đại học y khoa
Indiana, Ấn Độ sử dụng các phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn C.trachomatis nhƣ
Roche Amplicor test, DFA và PCR. Trong suốt quá trình nghiên cứu (2003–2009), tỷ
lệ bệnh nhân nhiễm C.trachomatis dao động từ 24.0% đến 30.0%. Các phụ nữ hành
nghề mại dâm ở Surat, Ấn Độ, có tỷ lệ dƣơng tính (xét nghiệm bằng PACE2 test) là
8.5%, trong khi ở Ahmedabad, tỷ lệ này tăng gấp đôi. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm
C.trachomatis trong quần thể nghiên cứu ở thủ đô của Ấn Độ chỉ chiếm 4.0% mặc dù
tỷ lệ mắc bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục là 36.5%. Tỷ lệ này tƣơng tự với các
nghiên cứu trên bệnh nhân ở Azerbaijan 3.1% và Bangladesh 3.4%. Tỷ lệ nhiễm cao
đƣợc đề cập ở Manila 23.3%, Cebu, Philippines 37.0% và 14.0% ở Nicaragoa [11] .
Anahita Jenab và cộng sự (năm 2008) [12] nghiên cứu giá trị chẩn đoán PCR và
ELISA trên vi khuẩn C.trachomatis ở phụ nữ không có triệu chứng và triệu chứng tại
Isfahan, Iran nhằm xác định sự hiện diện của C.trachomatis bằng phản ứng chuỗi
trùng hợp polymerase (PCR) và ELISA. Mẫu đƣợc thu thập sau khi có sự đồng ý bằng
văn bản từ 80 bệnh nhân khám phụ khoa tại bệnh viện Shahid Beheshti ở Isfahan, Iran.
Bệnh phẩm đƣợc thu thập từ 80 phụ nữ, 22 ngƣời trong số họ không có triệu chứng và
58 ngƣời có triệu chứng. 58 phụ nữ có triệu chứng khác nhau, từ 20-60 tuổi (có nghĩa
là 36.3 ± 8.8 năm) và 22 phụ nữ không có triệu chứng khác nhau, từ 19 đến 56 tuổi (40
± 10.5 năm). Tất cả các phụ nữ này đƣợc kiểm tra lâm sàng kỹ lƣỡng. Độ tuổi trung

bình của phụ nữ ở cả hai nhóm là 37.5 ± 9.4 năm. Những ngƣời đã dùng kháng sinh
trong vòng 4 tuần qua đƣợc loại trừ khỏi nghiên cứu. Các mẫu đã đƣợc kiểm tra bằng
phƣơng pháp PCR đƣợc thiết kế để phát hiện C.trachomatis bằng cặp mồi KL1, KL2
trên cryptic plasmid của vi khuẩn này. Huyết thanh IgG và IgA kháng thể kháng
C.trachomatis sử dụng phát hiện bằng phƣơng pháp ELISA. Một tăm bông chứa dịch
phết cổ tử cung của mỗi bệnh nhân đƣợc đặt vào một lọ nhựa 15 ml có chứa 5 ml dung
dịch đệm (PBS) vô trùng và lƣu trữ ở -70ºC cho đến khi tách chiết DNA. Ngoài ra,
5ml máu ngoại vi đƣợc thu thập từ mỗi bệnh nhân để điều tra huyết thanh học. Kit
ELISA đƣợc sử dụng trong nghiên cứu rất cụ thể để phát hiện C.trachomatis và không
có bất kỳ phản ứng chéo nào với các các loài khác của Chlamydia. Do đó, nó chỉ cho
phép phát hiện các kháng thể kháng C.trachomatis trong mẫu, tức là IgG, IgA. Phát
15


hiện C.trachomatis bằng phƣơng pháp PCR: Để phát hiện sự hiện diện của
C.trachomatis trong mẫu dich phết cổ tử cung, đoạn gen 241 bp trên plasmid vi khuẩn
đã đƣợc khuếch đại nhờ cặp mồi KL1 (5’-TCCGGAGCGAGTACGAAGA-3’) và
KL2 (5’-AATCAATGCCCGGGATT GGT-3’). Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên 5
μl chiết xuất DNA mẫu trong một hỗn hợp phản ứng cuối cùng là 25 μl. Hỗn hợp phản
ứng cuối cùng có 3 mM MgCl2, 0.28 mM dNTP, 16 pmol của mỗi loại mồi và 1 U Taq
polymerase. Chu trình nhiệt đã đƣợc thực hiện nhƣ sau: (94ºC/1 phút, 55ºC/1 phút,
72ºC/1 phút) × 40 chu kỳ, 72ºC trong 8 phút. Các sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng
điện di trên gel agarose 1.5%. Kết quả: tỷ lệ nhiễm C.trachomatis khi xét nghiệm bằng
phƣơng pháp PCR là 27.2% ở phụ nữ không có triệu chứng và 18.9% trên đối tƣợng
có triệu chứng. Kiểm tra huyết thanh học đƣợc thực hiện trên tất cả các mẫu cho kết
quả nhiễm C.trachomatis là 29.4% và 17.6% tƣơng ứng [12].
Theo CDC, số các trƣờng hợp chẩn đoán đã gia tăng đến 19% ở đàn ông và
25% ở phụ nữ giữa năm 2008 và 2009. Theo một điều tra mới đây với quy mô lớn, các
bệnh gây nên bởi C.trachomatis có thể có một vai trò quan trọng trong nguy cơ sinh
non. Hơn 4000 phụ nữ có thai đã tham dự vào điều tra này bằng bảng câu hỏi và lấy

mẫu nƣớc tiểu xét nghiệm C.trachomatis bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR). Kết
quả có 4% các phụ nữ dƣơng tính với vi khuẩn này [15]. Mặc dầu có tính đến những
yếu tố khác (tuổi dƣới 21, nhiều bạn tình), nhƣng nguy cơ sinh non, sinh con từ 35
tuần thai nghén ở các trƣờng hợp nhiễm trùng do C.trachomatis cao gấp đôi. Vì vậy,
điều tra phát hiện các phụ nữ có nguy cơ và sử dụng thuốc kháng sinh thích hợp trong
thời kỳ thai nghén sẽ cho phép làm giảm nguy cơ này. Nhiễm C.trachomatis có xu
hƣớng ngày càng tăng, tỷ lệ phát hiện tại Mỹ năm 1987 là 50.8 ca (trong 100.000 dân);
đến năm 2007 là 370.2 ca. Chi phí dành cho điều trị khoảng 3 tỷ USD/năm [18].
Hầu hết các phƣơng pháp khuếch đại phát hiện C.trachomatis trong mẫu dịch
niệu đạo, cổ tử cung và nƣớc tiểu đã chứng minh là có độ nhạy cao hơn so với nuôi
cấy tế bào hoặc các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên (Black 1997). Các phƣơng
pháp hiện đang có sẵn, chẳng hạn nhƣ Amplicor CT PCR, Roche phát hiện sản phẩm
khuếch đại bằng cách sử dụng peroxidase (HRP). Các phƣơng pháp thƣơng mại có lợi
thế quan trọng, nhƣng chi phí cao, không thích hợp với nhiều phòng thí nghiệm. Một
số phƣơng pháp khuếch đại phi thƣơng mại cũng đƣợc mô tả. Hầu hết bao gồm một
16


phản ứng PCR đơn có sản phẩm đƣợc phân tích dựa vào sản phẩm điện di trên gel
agarose và nhuộm với ethidium bromide. Tuy nhiên phƣơng pháp này giảm độ nhạy
do các chất ức chế có trong các mẫu lâm sàng. Ngay cả trong trƣờng hợp không có
chất ức chế, phản ứng PCR có thể không đủ nhạy để phát hiện mẫu có chứa số lƣợng
quá ít thể cơ bản (EB) của C.trachomatis.
Theo nghiên cứu của Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini và Esteban Serra [22],
phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 và KL1/KL2) làm
mồi có trình tự bổ sung với các đoạn nằm trên cryptic plasmid của C.trachomatis và
sau hai vòng khuếch đại tạo ra một sản phẩm cuối cùng 241 bp. Ban đầu, phản ứng
đầu tiên đã đƣợc chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 50 µl có chứa 10 mM Tris (pH 9,0),
50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 5 nmol mỗi loại dNTP, 20 pmol mỗi mồi KL5 (5TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGTCCTTCCTAAAAGAG-CTA-3) và
1.25 U Taq polymerase (Promega). Sau 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở

55°C, và 1 phút ở 72°C và một bƣớc kéo dài trong 7 phút ở 72°C; 1 µl sản phẩm của
phản ứng PCR đầu tiên đã đƣợc chuyển sang một ống phản ứng thứ hai với cùng thành
phần ngoại trừ mồi là 20 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAGTTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3) đã đƣợc thêm vào
hỗn hợp phản ứng, và 35 chu kỳ mới đƣợc thực hiện. Các sản phẩm đƣợc phân tích bởi
điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide. Độ nhạy của nested PCR đƣợc
xác định bằng cách sử dụng số lƣợng DNA của C.trachomatis giảm dần. Khảo nghiệm
đã có thể phát hiện DNA tƣơng ứng với một EB trong phản ứng. Tuy nhiên, độ nhạy
theo thử nghiệm lâm sàng có thể thấp hơn do chất ức chế PCR bị loại bỏ không hoàn
toàn trong quá trình tách chiết DNA. Các kết quả độ nhạy trong thực nghiệm khác
nhau dao động từ 1 đến 10 thể cơ bản (EB) mỗi phản ứng. Để tìm những điều kiện tốt
nhất cho các xét nghiệm, thử nghiệm nồng độ khác nhau cho các thành phần của phản
ứng, khối lƣợng và số chu kỳ khuếch đại. Kết quả tối ƣu đạt đƣợc với phản ứng PCR
đầu tiên trong 30 µl thể tích cuối cùng, có chứa 2.5 nmol dNTP mỗi loại, KL5/KL6 6
pmol mỗi mồi và 25 chu kỳ, tiếp theo với 50 µl của hỗn hợp phản ứng thứ hai và 35
chu kỳ. Cuối cùng, để xác định xem phản ứng có là một thử nghiệm chung xác định
C.trachomatis hay không, các thí nghiệm tiến hành bằng cách sử dụng các mẫu khác
để xét nghiệm. Kiểm tra cho thấy độ nhạy tƣơng tự đối với mẫu nƣớc tiểu, dịch niệu
đạo, dịch nhày mũi họng, và bệnh phẩm từ mắt. Kết quả cho thấy nested PCR đối với
17


phát hiện của C.trachomatis trong các mẫu lâm sàng là rất nhạy, có thể phát hiện ít
hơn 10 EB mỗi phản ứng trong các mẫu sinh học khác nhau; loại bỏ đến mức thấp nhất
việc phát hiện các kết quả âm tính giả bằng cách sử dụng một kiểm soát nội bộ khuếch
đại; đủ mạnh để đối phó với các điều kiện thay đổi trong các phòng thí nghiệm khác nhau.
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một số nghiên cứu trong cộng đồng cho thấy tỷ lệ
nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ thay đổi từ 18% đến 32.5%, trong đó một số yếu tố
nguy cơ đƣợc nhận diện nhƣ số bạn tình, độ tuổi bắt đầu quan hệ tình dục, tiền căn
bệnh phụ khoa.

Năm 1995, khảo sát tỷ lệ hiện mắc bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đƣợc Vụ
Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình của Bộ Y Tế thực hiện ở Việt
Nam [29]. Đối tƣợng là các phụ nữ đến khám tại Trung Tâm Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em
và Kế Hoạch Hóa Gia Đình thành phố Hồ Chí Minh trong 10 tuần gồm 812 phụ nữ ở
độ tuổi 15 đến 39. Chẩn đoán bệnh lậu dựa trên nuôi cấy và xác nhận bằng một xét
nghiệm kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho N.gonorrhoea. Sự hiện diện của
C.trachomatis đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên (IDEIA)
trong bệnh phẩm nội mạc cổ tử cung. TPHA đƣợc thực hiện cho tất cả các mẫu máu để
tìm bệnh giang mai. Tỷ lệ bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phát hiện đƣợc ở giang
mai 0.5%, lậu 0.7% và C.trachomatis 2.5%.
Một nghiên cứu cắt ngang về nhiễm HIV và các yếu tố nguy cơ ở phụ nữ mại
dâm tại phía nam Việt Nam đã đƣợc Nguyễn Thị Thanh Thủy, Võ Tuyết Nhung,
Nguyễn Văn Thục, Trƣơng Xuân Liên và Hạ Bá Khiêm thực hiện vào 1995-1996 [24].
Tổng cộng 968 phụ nữ mại dâm ở thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và An Giang
đƣợc làm xét nghiệm. Các xét nghiệm bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đƣợc thực
hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoeae, ELISA (Sanofi, Organon) để phát hiện
nhiễm HIV đƣợc xác nhận bằng Western Blot, TPHA cho giang mai, DIF cho
C.trachomatis và ELISA HBsAg cho HBV. Tỷ lệ hiện mắc của các bệnh lây truyền
qua đƣờng tình dục đƣợc phát hiện là 40.4% cho giang mai, 3.3% cho lậu, 5.8% cho
C.trachomatis, 5.2% cho HIV và 9% cho HBV.

18


Trong thời gian từ tháng 2/1998 đến 3/1999, các tác giả đã khảo sát 415 phụ nữ
từ 15-49 tuổi có gia đình đang sống tại huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh [3].
Các đối tƣợng đƣợc chọn một cách ngẫu nhiên, nếu có đủ điều kiện nghiên cứu thì lập
danh sách theo phƣơng pháp ngẫu nhiên đơn, sau đó gửi thƣ mời đối tƣợng đến trạm y
tế xã khám phụ khoa và lấy mẫu. Cách xử lý bệnh phẩm cũng nhƣ cách đọc kết quả
đƣợc tuân theo quy trình hƣớng dẫn của bộ xét nghiệm do Bio Merieux cung cấp. Kết

luận dƣơng tính với C.trachomatis khi có hơn 10 thể phát huỳnh quang trên quang
trƣờng với vật kính 40; bệnh phẩm âm tính khi không có thể C.trachomatis phát huỳnh
quang và ít nhất phải có hơn 50 tế bào thƣợng bì trên bề mặt của giếng. Kết quả 75
nguời có hiện diện của C.trachomatis trên bệnh phẩm phết cổ tử cung, nhƣ vậy tần
suất lƣu hành của viêm cổ tử cung do C.trachomatis là 18.07%.
Tỷ lệ viêm cổ tử cung do C.trachomatis ở phụ nữ đi khám phụ khoa là 32.5%
của Trần Thị Lợi tiến hành năm 1999 [8].
Năm 2001-2002, Huỳnh Thị Trọng, Nguyễn Quốc Chinh và Nguyễn Văn Tú đã
thực hiện một nghiên cứu cắt ngang với phƣơng pháp chọn mẫu xác suất với cỡ mẫu
để xác định tỷ lệ hiện mắc các nhiễm khuẩn đƣờng sinh sản dƣới của 2234 phụ nữ đã
kết hôn, ở lứa tuổi mang thai, sống tại thành phố Hồ Chí Minh [25]. Các xét nghiệm
đƣợc thực hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoea, Smart Check Chlamydia cho
C.trachomatis. Tỷ lệ hiện mắc lậu là 0.2%, C.trachomatis là 0.6%,
Năm 2002-2003, Ủy Ban Dân Số, Gia Đình và Trẻ Em Việt Nam – Cục Phòng Chống
AIDS Bộ Y Tế và Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu bệnh
lây truyền qua đƣờng tình dục ở phụ nữ mãi dâm tại 5 tỉnh biên giới Lai Châu, Quảng
Trị, Đồng Tháp, An Giang và Kiên Giang [26]. Có tất cả 703 phụ nữ mãi dâm của 5
tỉnh tham gia vào nghiên cứu cắt ngang này. Xét nghiệm bệnh lậu và C.trachomatis
qua mẫu nƣớc tiểu bằng kỹ thuật Roch Amplicor. Tỷ lệ mắc lậu, C.trachomatis,
lậu/C.trachomatis tại Lai Châu 2.0%, 1.0%, 27.3%; Quảng Trị 1.0%, 12.9%, 32.7%;
Đồng Tháp 4.7%, 11.4%, 16.0%; An Giang 7.0%, 10.7%, 11.3% và Kiên Giang 4.0%,
13.4%, 24.4%.
Năm 2003, Trung tâm phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) cùng Viện Da Liễu
trung ƣơng tiến hành một cuộc điều tra về tỷ lệ lƣu hành STI/HIV của các nhóm quần
19


thể dân cƣ khác nhau tại 5 tỉnh của Việt Nam [29]. Nhiễm C.trachomatis đƣợc phát
hiện bằng phản ứng PCR và tỷ lệ mắc là 9% trong nhóm tân binh tại Hà Nội và 0.5-5%
trong nhóm bệnh nhân đến phòng khám bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục. Trong

nhóm phụ nữ có thai, tỷ lệ mắc C.trachomatis từ 1.5% đến 5.8%.
Năm 2003, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và Văn Phòng Phòng Chống
AIDS cùng Trung Tâm Phòng Chống Bệnh Xã Hội Sóc Trăng nghiên cứu về bệnh lây
truyền qua đƣờng tình dục ở 395 phụ nữ mại dâm của tỉnh Sóc Trăng [29]. Các kỹ
thuật đƣợc sử dụng để xét nghiệm lây truyền qua đƣờng tình dục là PCR (Amplicor
CT/NG, Roch, 2002) để tìm N.gonorrhoea và C.trachomatis trong nƣớc tiểu. Tỷ lệ
hiện mắc lậu, C.trachomatis, lậu/C.trachomatis là 14.9%, 48.4%, 54.9%.
Tần suất nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên
cứu và đã có một số số liệu ban đầu ghi nhận tỉ lệ nhiễm C.trachomatis ở một số đối
tƣợng trong cộng đồng nhƣ phụ nữ đang mang thai, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, cũng nhƣ
ở những đối tƣợng nguy cơ cao nhƣ phụ nữ đến khám phụ khoa và phụ nữ vô sinh do
tắc ống dẫn trứng. Tần suất nhiễm C.trachomatis thay đổi theo từng tác giả, từng
nhóm đối tƣợng, tuy vậy đều thống nhất trong khoảng 20 – 40% ở đối tƣợng trong
cộng đồng [1]. Điểm chung của các nghiên cứu trên là sử dụng kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp để tìm kháng nguyên, xác định tình trạng hiện đang nhiễm
C.trachomatis.
Lần đầu tiên tại Việt Nam, xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis đƣợc sử
dụng nhƣ một xét nghiệm sàng lọc. Đối tƣợng nghiên cứu là tất cả các trƣờng hợp điều
trị vô sinh có chỉ định thực hiện thủ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) tại khoa Hiếm
muộn, bệnh viện Từ Dũ trong thời gian từ 20/2/2004 đến 20/7/2004 [31]. Bệnh nhân
đƣợc tƣ vấn về tình hình nhiễm C.trachomatis trong cộng đồng, khả năng nhiễm bệnh
của bản thân và ảnh hƣởng của nhiễm C.trachomatis lên hiệu quả điều trị. Bệnh nhân
cũng đƣợc tƣ vấn về xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis và đồng ý tham gia
nghiên cứu. Khi đƣợc nhận vào nghiên cứu, bệnh nhân đã đƣợc ghi nhận về bệnh sử,
thăm khám lâm sàng, thực hiện những xét nghiệm cơ bản. Vào ngày thứ 2 hoặc 3 của
kỳ kinh, bệnh nhân đƣợc lấy máu thử kháng thể kháng C.trachomatis loại IgG và đƣợc
bắt đầu dùng toa thuốc kích thích phát triển nang noãn theo phác đồ chuẩn tại khoa.
Quy trình thực hiện thủ thuật TTNT đƣợc tiến hành theo phác đồ chuẩn tại khoa Hiếm
20