Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội – Năm 2015


Luận văn thạc sĩ

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Nguyên Thành,
Thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực
hiện luận văn này. Thầy cũng chính là tấm gƣơng đầy nhiệt huyết, say mê
nghiên cứu khoa học giúp tôi tiếp cận, trau dồi kiến thức mới từ đó có thể
định hƣớng, giải quyết các vấn đề trong quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Trần Văn Tuấn cùng các thầy, cô
giáo trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình
giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trƣờng.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng nhận đƣợc rất nhiều sự
quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa
sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu
viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và làm việc tại Trung tâm.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích
lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015
Học viên

Đặng Thị Kim Anh

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ............................................................................... 3
1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ......................................................... 4
1.2.1. Phân loại enzyme phytase .......................................................................... 4
1.2.2. Nguồn phytase........................................................................................... 6
1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE ................................................................................... 7
1.3.1. Trong chăn nuôi ......................................................................................... 7
1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm ...................................................................... 8
1.3.3. Trong công nghiệp giấy ............................................................................. 8
1.3.4. Trong cải tạo đất........................................................................................ 9
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate .............................. 9
1.4. CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÕNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI.................... 10
1.5. CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM........................................ 11
1.6. CấU TRÖC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A. NIGER
VÀ A. FUMIGATUS .................................................................................................... 13

CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18
2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................. 18
2.1.1. Hóa chất ................................................................................................... 18

2.1.2. Vi sinh vật ................................................................................................ 19
2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 21
2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................ 21
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp Mega-PCR......................................................................... 21
2.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel
Extraction ............................................................................................................... 22
2.2.3. Ghép nối plasmid ..................................................................................... 23
2.2.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt ........... 23
2.2.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid
Miniprep ................................................................................................................. 24
2.2.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến
nạp xung điện ......................................................................................................... 24
K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
2.2.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris ........................................... 25
2.2.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris ........................... 26
2.2.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE.............................................. 26
2.2.10. Xác định hoạt tính phytase .................................................................... 27
2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 ............................................... 29
2.2.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước ........... 29
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................... 29
3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE ........................................ 30
3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp
Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt ................................................................. 30
3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR ....................... 31

3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm ............................. 34
3.2. CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORIS ....... 38
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp
xung điện ................................................................................................................ 38
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris ........... 40
3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp ................................... 41
3.3. THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP ................. 42
3.4. XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP SAU
KHI CẢI BIẾN GEN .............................................................................................. 44
3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp .............................................. 44
3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp .......................... 45
3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp ...................................... 46
3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao ............................................................................................................ 47
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 50
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 52
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 60

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOX1

Alcohol Oxidase 1

APS

Ammonium Persulfate

BMGY

Buffered Glycerol Complex Medium

BMMY

Buffered Methanol Complex Medium

cDNA

complementary Deoxyribonucleic acid

CNTP

Công nghiệp thực phẩm

DNA

Deoxyribonucleic acid

EC

Enzyme Commission

FTU

Đơn vị hoạt tính phytase

HIV

Human Immunodeficiency Virus

IU

International Unit

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani medium
Northern Regional Research Laboratory

NRRL

(hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)
(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rpm

Revolutions per minute

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SSC

Saline Sodium Citrate

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA

TCA

Trichloroacetic acid

TEMED

Tetramethylethylenediamine

YPD

Yeast Extract-Peptone-Dextrose

YPDS

Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 19
Bảng 2.2. Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa
phyA ......................................................................................................................... 20
Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein ....................................................... 27
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm........................ 28
Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi
đĩa 24 giếng .............................................................................................................. 41

Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân
hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa ....................................................... 42

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen
phosphate (axit phytic) ............................................................................................. 3
Hình 1.2. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase......................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus............. 14
Hình 1.4. Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase
A. fumigatus.............................................................................................................. 16
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C .............................................. 18
Hình 2.2. Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản ............................................................. 22
Hình 3.1. Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA
.................................................................................................................................. 31
Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 32
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 33
Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào
vector pPICZαA ....................................................................................................... 34
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm
TAE ×0.5 .................................................................................................................. 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi
tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 ..................................................... 36

Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và
vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 .... 37
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 39
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5
vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện ................................ 39
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyAStop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 ........................................ 40
Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% ............. 43
Hình 3.12. Xác định pH tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin ....
.................................................................................................................................. 45
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin
.................................................................................................................................. 46
K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ

Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 47
Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 48

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu
của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ
cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn
liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn ... Axit phytic có
tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch
tiêu hóa của động vật.
Enzyme

phytase

(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate

phospho-

hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy
phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của
myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác
dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện
khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra
ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng.
Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ
nấm mốc Aspergillus niger. Phytase từ A. niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở
pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với
phytate cao, và bền với tác động của pepsin. Phytase từ A. niger có nhƣợc điểm là
kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt
tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.
Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc

cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của
phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu
trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Phytase
của A. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả
năng hồi tính. Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn
hồi” nhiệt của enzyme.
Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt
Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase,
đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên
K21-Sinh học thực nghiệm

1

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
cứu. Trong số đó, phytase từ A. niger đƣợc tách dòng và biểu hiện trên Pichia
pastoris. Giống nhƣ các phytase tự nhiên khác từ A. niger, enzyme thu nhận đƣợc
chƣa đảm bảo đƣợc tính bền nhiệt nhƣ mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài nghiên cứu: “Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc
Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao” nhằm cải thiện đặc tính công nghệ của enzyme tái tổ hợp. Để đạt
đƣợc mục tiêu trên, gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger đƣợc biến đổi bằng
Mega-PCR tạo 4 axit amin mới thay thế cho 4 axit amin trong cấu trúc protein nhằm
tăng độ bền vững đồng thời duy trì các đặc tính cơ bản về hoạt tính và pH hoạt động
của enzyme.

K21-Sinh học thực nghiệm

2

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1. Axit phytic và phytate
Axit phytic lần đầu tiên đƣợc Hartig tìm thấy năm 1855 ở dạng hạt nhỏ trong
hạt giống của một số loài thực vật và có kích thƣớc tƣơng đƣơng hạt tinh bột khoai
tây. Khi kiểm tra bằng phƣơng pháp thử iod, Hartig nhận thấy các hạt này không
phải là tinh bột và chứa chất dinh dƣỡng dự trữ cho sự nảy mầm của hạt [27, 28].
Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy hạt phytic và khẳng định
thành phần hóa học chính của nó là carbon, phospho và các ion kim loại và không
phải protein hay lipid. Chúng có tên là „phytin‟ do nguồn gốc từ thực vật và không
đƣợc phát hiện thấy ở thịt hay trong các sản phẩm từ sữa. Winterstein, Schulze và
Posternak đã chỉ ra rằng thủy phân phytin bằng axit sẽ giải phóng axit phosphoric
và inositol [66]. Năm 1914, Anderson đã mô tả cấu trúc phân tử của myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 – hexakis dihydrogen phosphate, đƣợc gọi là axit phytic [7]
(Hình1.1):

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakisdihydrogen
phosphate (axit phytic).
Phytate là muối của axit phytic là dạng dự trữ phospho và khoáng chất chủ yếu
của thực vật đặc biệt ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có dầu. Chúng chiếm
khoảng 75% tổng lƣợng phospho của hạt và thấp hơn ở các bộ phận khác của cây
nhƣ rễ, củ, chồi, với hàm lƣợng chỉ khoảng 0.1% [44, 45]. Trong quá trình nảy mầm
của hạt, phytate bị thủy phân tạo phospho vô cơ cùng với khoáng chất nhƣ canxi,
magiê là những chất cảm ứng cho quá trình nảy mầm và phát triển của cây con.
Điều này giải thích cho vai trò quan trọng của phytate trong quá trình chuyển hóa

của thực vật.

K21-Sinh học thực nghiệm

3

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
Với động vật, axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh nhờ khả
năng liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại nhƣ Ca2+,
Mg2+, Zn2+. Những liên kết này tạo phức hợp không hòa tan trong đƣờng tiêu hóa,
dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [17, 47]. Trong số các kim
loại, kẽm là nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hƣởng lớn nhất
bởi axit phytic. Axit phytic bổ sung vào thức ăn có thể làm giảm mạnh khả năng
hấp thụ ion Zn2+ và giảm trọng lƣợng của chuột [48]. Axit phytic còn tƣơng tác với
protein trong dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein. Liên kết giữa
protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của
protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dƣỡng của chúng. Hơn nữa, ngoài liên kết
với muối khoáng, protein, axit phytic còn tƣơng tác với các enzyme tiêu hoá nhƣ
trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những
enzyme này [20, 32, 55].
1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase)
Phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc
tác phản ứng thủy phân myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (phytate) thành
những gốc phosphate đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol
phosphate. Ở một số loài nấm, phytase có thể giải phóng myo-inositol tự do.
1.2.1. Phân loại enzyme phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme

Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại
phytase thành ba dạng bao gồm [75]:
Dạng 1: EC 3.1.3.8
Tên đề xuất: 3-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-3-phosphohydrolase
Tên khác: phytase, phytate-1-phosphatase, phytate-3-phosphatase,
phytate-6-phosphatase
Dạng 2: EC 3.1.3.26
Tên đề xuất: 4-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-4-phosphohydrolase
K21-Sinh học thực nghiệm

4

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
Tên khác: phytase, 6-phytase, phytate-6-phosphatase
Dạng 3: EC 3.1.3.72
Tên đề xuất: 5-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-5-phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-5-phosphatase
Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn
công. Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3 và
4-phytase (EC 3.1.3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 4; đây là hai dạng
phytase điển hình của vi sinh vật. Enzyme 5-phytase (EC 3.1.3.72) tấn công đầu
tiên vào nhóm phosphate số 5; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật.

Hình 1.2. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase: β-Propellar Phytase

(BPPhy), Protein tyrosine phytase (PTPhy), Purple Phosphatase Acid (PAPhy) và
Histidine Acid Phosphatase (HAPhy) [67].
Theo tính năng và cấu trúc, ngƣời ta còn chia phytase ra 4 nhóm nhƣ sau: (1) βPropellar Phytase (BPPhy): hoạt động ở pH kiềm và cần ion Ca2+ cho khả năng xúc
tác và bền nhiệt, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3); (2) Protein
tyrosine phytase (PTPhy): hoạt động ở pH axit, chứa nhóm xúc tác cysteine, sản
phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate; (3) Purple Phosphatase Acid
(PAPhy): chứa axit amin có gắn kim loại Fe2+ và Fe3+, Zn2+, Mg2+ hoặc Mn2+ ở
trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của enzyme này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ; (4)
Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): hoạt động ở pH thấp, chứa trình tự axit amin
bảo thủ: RH[GN]xRx[PAS] ở đầu N và HD ở đầu C (Hình 1.2). Các nhóm này khác
nhau về cấu trúc phân và cơ chế xúc tác cho phép chúng sử dụng axit phytic làm
K21-Sinh học thực nghiệm

5

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
nguồn cơ chất trong các môi trƣờng khác nhau. Trong đó, phytase của Aspergillus
niger

và Aspergillus fumigatus thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase đƣợc

nghiên cứu rộng rãi nhất.
1.2.2. Nguồn phytase
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ vi sinh vật, thực
vật và động vật.
Phytase từ vi sinh vật
Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở nấm mốc, đặc biệt ở các

loài thuộc chi Aspergillus. Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất
hơn 2000 chủng vi sinh vật để sản xuất phytase. Hầu hết các chủng sản sinh phytase
nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó
28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc
Mucor. Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về
loài A. niger [53]. Những nhóm nghiên cứu khác nhƣ Howson và Davis (1983),
Volfova và cs (1994) đã khẳng định rằng A. niger là loài có khả năng sản sinh
phytase ngoại bào tốt nhất [31, 65]. Một số phytase từ một số nấm men khác đã
đƣợc phát hiện nhƣ: Pichia anomala [64], Saccharomyces cerevisiae [59].
Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter
aerogenes, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp., Enterobacter sp. [25,
33, 52, 72]. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi
Bacillus và Enterobacter còn phytase từ E. coli lại là enzyme nội bào. Năm 2005,
Cheng và CS đã mô tả cấu trúc phytase dạng β ở loài ƣa lạnh Shewanella oneidensis
MR-1 nó có 30% peptide tƣơng đồng với trình tự phytase của Bacillus sp.. Đặc biệt,
với khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp phytase này có tiềm năng ứng dụng trong
nuôi trồng thủy sản, khi nhiệt độ thƣờng thấp hơn 30°C [12].
Phytase từ thực vật
Phytase đƣợc tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật. Phytase từ phấn hoa lily
hoạt động ở pH tối ƣu 8,0 và nhiệt độ tối ƣu 55 C [34]. Hegeman (2001) đã tìm ra
gen mã hóa phytase từ mầm đậu tƣơng [29]. Sự có mặt của phytase đƣợc tìm thấy
trong ngũ cốc, cây họ đậu và hạt có dầu [63] hoặc rau quả nhƣ: lê tàu và lá hành
K21-Sinh học thực nghiệm

6

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ

tƣơi [43]. Đặc biệt, một số loại hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch ...) có hoạt tính
phytase cao và có thể đạt trên 5000 IU kg-1.
Phytase từ động vật
Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động
vật dạ dày đơn [13]. Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn
không có vai trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate có trong thức ăn [66].
Một enzyme giống nhƣ phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong động vật nguyên
sinh Paramecium [24]. Cá vƣợc sọc lai có chứa phytase hoạt động ở pH tối ƣu 3,54,5 [21].
1.3. Ứng dụng của phytase
1.3.1. Trong chăn nuôi
Động vật nhai lại tiêu hóa đƣợc muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật
sống trong dạ cỏ tiết ra. Phospho vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ đƣợc khu hệ vi
sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn
nhƣ lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa phytate vì chúng không có hoặc
có rất ít phytase trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phospho cho cơ
thể vật nuôi, ngƣời ta đã bổ sung phospho vô cơ vào thức ăn. Điều này sẽ làm tăng
chi phí thức ăn và gây ra ô nhiễm phospho, đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy
sản. Ô nhiễm phospho xuất phát từ lƣợng dƣ thừa trong thức ăn hòa tan vào môi
trƣờng nƣớc, cộng với muối phytate không đƣợc tiêu hoá thải qua phân và đƣợc vi
sinh vật sống trong đất phân giải thành phospho vô cơ. Khi chất này dƣ thừa tạo
điều kiện thuận lợi cho các loài tảo sinh trƣởng, phát triển. Tảo phát triển quá mức
sẽ gây hiện tƣợng "nƣớc nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nƣớc
khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [2]. Khi bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng hấp thu phospho ngay trong
chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lƣợng chất này thải qua phân [4].
Nhiều nghiên cứu chứng minh phytase giúp giải phóng phospho khó tiêu trong
đƣờng tiêu hóa của động vật; tăng cƣờng khả năng hấp thu khoáng nhƣ Zn2+, Mg2+,
Fe2+ cải thiện khả năng tiêu hóa protein. Bổ sung phytase vào thức ăn cho gia cầm
K21-Sinh học thực nghiệm

7

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
giúp tăng trọng cơ thể, tăng vật chất khô của xƣơng, tăng sản lƣợng trứng và chất
lƣợng trứng [46]. Ngoài ứng dụng nổi trội cho vật nuôi, enzyme phytase còn có vai
trò rất quan trọng cho ngành thủy sản. Thử nghiệm phytase trên loài cá da trơn Châu
Phi (Clarias gariepinus) giúp tăng hiệu quả khả năng sử dụng phospho [62]. Cá hồi
Đại Tây Dƣơng (Salmo salar) khi cho ăn phytase đã kích thích sinh trƣởng và giảm
tác động kháng dinh dƣỡng của axit phytic lên khả năng tiêu hóa protein [49]. Bổ
sung phytase vào thức ăn có nguồn gốc thực vật cho cá trắm con (Labeo rohita)
kích thích sử dụng các loại khoáng và làm tăng tỷ lệ khoáng chất trong xƣơng [9].
Tác động tích cực của phytase còn đƣợc tăng thêm 3% khi bổ sung axit citric vào
thức ăn. Cá basa con (Pangasius pangasius) khi nuôi với khẩu phần chứa 35%
protein thô có bổ sung phytase cải thiện đƣợc tăng trọng, tăng vật chất khô và khả
năng sử dụng protein [19]. Những nghiên cứu khác về việc bổ sung phytase trong
ngành nuôi trồng thủy sản chỉ ra rằng phytase giúp tăng khả năng sử dụng phospho
sinh học, nitơ sinh học và các muối khoáng đồng thời giảm lƣợng phospho thải ra
môi trƣờng nƣớc [10, 41].
1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm
Anno và CS (1985) đã loại bổ sung thêm phytate vào sữa đậu nành bằng
cách sử dụng phytase từ lúa mỳ để thủy phân [8]. Bổ sung phytase từ nấm mốc
A. niger vào bột mỳ có chứa cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở
ngƣời [51]. Nhƣ vậy, vai trò quan trọng của phytase với thực phẩm dành cho con
ngƣời cũng khá rõ ràng. Phytase không những làm tăng khả năng tiêu hóa
protein mà còn tăng hấp thụ khoáng. Có lẽ trong tƣơng lai không xa, enzyme này
sẽ đƣợc dùng phổ biến nhƣ một chất phụ gia cho thực phẩm.
1.3.3. Trong công nghiệp giấy

Việc loại bỏ axit phytic rất quan trọng trong ngành công nghiệp giấy. Trƣớc
khi ứng dụng enzyme phytase, việc loại bỏ thành phần axit phytic đƣợc tiến hành
bằng con đƣờng hóa học. Phƣơng pháp này có mặt trái tạo ra những chất có khả
năng gây ung thƣ và những chất thải có độ độc cao. Trong khi đó ứng dụng công
nghệ enzyme để loại bỏ axit phytic trong thực vật sẽ giúp cải thiện môi trƣờng cũng
K21-Sinh học thực nghiệm

8

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
nhƣ góp phần vào sự phát triển của công nghệ sạch [37]. Những phytase bền ở nhiệt
độ cao thƣờng đƣợc sử dụng để phân giải axit phytic trong quá trình chế biến giấy.
1.3.4. Trong cải tạo đất
Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lƣợng
phospho hữu cơ trong đất [16]. Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho
thấy khả năng sinh trƣởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi
bổ sung phytase vào đất trồng [22]. Nghiên cứu này cũng mở ra một hƣớng trong
tƣơng lai có thể chuyển và biểu hiện gen phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng
giá trị phospho dễ tan trong đất.
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate
Một số myo-inositol phosphate có ứng dụng quan trọng trong dƣợc học.
Inositol phosphate và phospholipid có vai trò nòng cốt trong việc truyền tín hiệu
qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào [11]. Một số inositol
triphosphate đƣợc sử dụng để phòng tránh viêm khớp, bệnh hen, hoặc làm thuốc
giảm đau [56]. Este của inositol triphosphate đƣợc sử dụng làm chất ức chế chống
lại sự lây nhiễm các bệnh do nhóm retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [57]. Tuy
nhiên, việc tổng hợp bằng con đƣờng hoá học các myo-inositol phosphate này gặp

rất nhiều khó khăn vì qui trình đƣợc thực hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao
[11]. Từ khi phytase đƣợc phát hiện có hoạt tính thủy phân các myo-inositol
hexaphosphate thành các dẫn xuất khác nhau thì việc sản xuất myo-inositol tự do từ
myo-inositol phosphate đƣợc thực hiện bằng con đƣờng sinh học để thay thế
phƣơng pháp tổng hợp hóa học. Tổng hợp bằng con đƣờng sinh học mang tính đặc
hiệu, sản phẩm có độ tinh khiết cao, phản ứng diễn ra trong điều kiện "ôn hoà" hơn.
Việc

sản

trisphosphate,

xuất

D-myo-inositol-1,2,6-trisphosphate,

L-myo-inositol-1,3,4-trisphosphate

và

D-myo-inositol-1,2,5myo-inositol-1,2,3-

trisphosphate bằng con đƣờng thủy phân axit phytic nhờ phytase đã đƣợc nghiên
cứu và thực hiện [26, 60].

K21-Sinh học thực nghiệm

9

Đặng Thị Kim Anh

Luận văn thạc sĩ
1.4. Các nghiên cứu tách dòng biểu hiện phytase trên thế giới
Từ những năm 1990, Laboure và CS đã tinh sạch, mô tả đặc điểm của phytase
từ hạt ngô đang nảy mầm và gen mã hóa cũng đã đƣợc tách dòng từ cDNA [35].
Phytase có lợi cho tiêu hóa do khả năng phân giải Fe-phytate, Zn-phytate, tuy nhiên,
phytase của lúa mỳ bị mất tác dụng khi đun nấu ở nhiệt độ cao. Nhóm nghiên cứu
của Viện Khoa học Nông nghiệp Đan Mạch đã nhân giống thành công lúa mỳ biến
đổi gen khi chuyển gen phytase chịu nhiệt từ A. fumigatus. Phytase của chủng lúa
mỳ biến đổi gen bền nhiệt hơn và có hàm lƣợng tăng gấp 6 lần so với giống chƣa
biến đổi gen. Một số nghiên cứu tƣơng tự cũng đƣợc tiến hành trên lúa với nguồn
gen phytase của vi khuẩn [42], hoặc trong khoai tây với gen phyA từ nấm [61].
Craxton và CS (1997) đã tách dòng và biểu hiện một inositol polyphosphatase
phức tạp từ gan chuột (MIPP) có hoạt tính phytase. RNA thông tin của MIPP có
mặt trong tất cả các mô của chuột, nhƣng nó chỉ biểu hiện rõ nhất ở gan và thận
[15]. Chuột mang gen appA của E. coli biểu hiện phytase trong tuyến nƣớc bọt giúp
giảm lƣợng phytate trong phân từ 8,5-12,5% [71]. Lợn chuyển gen mang gen appA
của E. coli có khả năng tiết nƣớc bọt chứa phytase giúp giảm đến 60% lƣợng
phospho thải qua phân [23].
Vi sinh vật là đối tƣợng đƣợc sử dụng rộng rãi để biểu hiện phytase, với nhiều
nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa phytase trên các đối tƣợng vi sinh vật
khác nhau. Năm 2004, Xiong và CS đã chuyển gen có kích thƣớc 1347 bp của A
niger SK-57 vào P. pastoris và thu đƣợc 6,1 g protein tinh khiết trên 1 lít môi
trƣờng nuôi cấy, với hoạt tính 865 IU ml-1. Do quá trình glycosyl hoá nên phytase
tái tổ hợp thu đƣợc có kích thƣớc khác nhau (64, 67, 87, 110 và 120 kDa). Những
phân tích hóa sinh cho thấy enzyme này hoạt động tối thích ở pH 2,5 và 5,5, nhiệt
độ 60C [68]. Gen appA mã hóa enzyme phytase tách dòng từ Yersinia kristeensenii
đƣợc biểu hiện trên P. pastoris. Enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ƣu đạt 2656 U mg-1
ở nhiệt độ 55 °C trong điều kiện pH thấp khoảng 4,5. Hoạt tính của nó duy trì tốt

trong dải pH 1,5 – 11,0 còn khoảng 90%. Enzyme này cũng khá bền nhiệt, hoạt tính
còn lại là 46% sau khi bị biến tính ở 80 °C trong 10 phút [18].
K21-Sinh học thực nghiệm

10

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
Yan Wang và cộng sự (2007) đã nhân dòng và biểu hiện thành công enzyme
phytase từ chủng A. fumigatus WY-2 trên nấm men P. pastoris GS115. Enzyme tái
tổ hợp sau khi tinh chế có hoạt tính riêng đạt 51U mg-1 và có khối lƣợng phân tử
khoảng 88 kDa. Nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme này tƣơng ứng là 55 °C và pH
5,5. Khi ủ với pepsin trong vòng 2 giờ ở 37 °C theo tỷ lệ 0,1 (pepsin/phytase,
wt/wt), enzyme tái tổ hợp còn giữ đƣợc 90,1% hoạt tính [70]. Năm 2011, enzyme
phytase chịu nhiệt mới đƣợc tìm thấy từ A. aculeatus RCEF 4894 trong mẫu đất ở
Trung Quốc. Enzyme tái tổ hợp đƣợc mã hóa bởi gen kích thƣớc 1404 bp bao gồm
467 axit amin, hoạt tính sau khi biểu hiện trên P. pastoris đạt 3000 U ml-1 ở nhiệt độ
tối ƣu 55 °C. Hoạt lực của enzyme này chỉ mất khoảng 13,9% sau khi biến tính ở
90°C trong 10 phút và duy trì tốt trong dải pH 2,5 – 6,5 [74].
Năm 2013, Li và CS đã tách dòng thành công gen mà hóa phytase dài 1327 bp
từ Bacillus. Enzyme tái tổ hợp đƣợc sinh tổng hợp trên nấm men Pichia pastoris có
trọng lƣợng phân từ khoảng 53 kDa, pH hoạt động tối ƣu là 7,0 – 8,0. Sau khi xử lý
nhiệt 70 °C trong vòng 10 - 30 phút enzyme vẫn duy trì 80 – 62% hoạt tính [36].
Khi nghiên cứu trên nấm mốc Aspergillus niger, tác giả Mrudula đã tách dòng gen
mã hóa phytase và biểu hiện trên hai hệ thống biểu hiện của E. coli BL21 (DE3) sử
dụng T7 RNA promoter và Tac promoter. Kết quả phân tích hoạt tính cho thấy
enzyme này hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 50 °C và pH 6,5 [38]. Gen phytase tách
dòng từ Penicillium chrysogenum đƣợc chuyển vào tế bào trần Penicillium

griseoroseum PG63. Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cao hơn hẳn so với chủng gốc,
có pH tối ƣu là 5,0, duy trì hoạt tính trong dải pH 3,0 – 8,0 và nhiệt độ 70 – 80 °C
[14]. Phytase từ vi sinh vật có sự đa dạng cao nhất về khả năng công nghệ. Phytase
từ A. aculeatus có khả năng bền nhiệt [74], phytase từ A. fumigatus có khả năng bền
với pepsin [70], phytase từ Yersinia kristeensenii hoạt động tốt trong dải pH rộng
1,5 – 11,0 [18].
1.5. Các nghiên cứu về enzyme phytase ở Việt Nam
Với hiệu quả kinh tế rõ rệt trong chăn nuôi, phytase hiện đang đƣợc sử dụng
rộng rãi ở Việt Nam. Hầu hết các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi công nghiệp
đều sử dụng phytase trong thành phần dinh dƣỡng bổ sung cho vật nuôi. Nguồn
K21-Sinh học thực nghiệm

11

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
phytase đƣợc nhập chủ yếu từ Châu Âu và Trung Quốc. Trong số các enzyme,
phytase đƣợc nhập khẩu với lƣợng lớn nhất kể cả về giá trị và khối lƣợng. Chính vì
vậy, những nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập
khẩu đang đƣợc nhiều nhà khoa học trong nƣớc quan tâm. Nguyễn Thùy Châu từ
2007 - 2009 đã nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytase bằng hình
thức lên men bề mặt. Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng các chủng A. niger ATCC
9142 và A. ficcum NRRL 3135 từ bộ sƣu tập giống của Mỹ, A. niger NCIM,
Rhizopus microsporus từ Cộng hòa Séc và chủng A. niger DL1 phân lập từ Việt
Nam. Nhóm tác giả đã nghiên cứu qui trình lên men rắn sản xuất phytase ở qui mô
pilot. Theo đó, chủng sản xuất đƣợc lên men ở nhiệt độ 30C trong 7 ngày trên môi
trƣờng P3. Cơ chất sau lên men đƣợc tách chiết enzyme bằng dịch oxy già 5%,
enzyme thô đƣợc thu bằng ly tâm và tủa bằng cồn 96, sấy khô tạo chế phẩm VS1.

Khảo nghiệm tác động của chế phẩm trên gà cho thấy, 200 g chế phẩm VS1 bố sung
cho 1 tấn thức ăn có thể thay thế cho dicanxi phosphate trong khẩu phần thức ăn [1].
Ngoài việc ứng dụng các kỹ thuật lên men truyền thống, một con đƣờng khác
là sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất enzyme, đây là hƣớng đi hiện đại
phù hợp để sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp mà các nƣớc tiên tiến đã và đang
thực hiện. Hƣớng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời
lƣợng enzyme thu đƣợc dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên. Tại Việt
Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một số nghiên cứu tách dòng và tạo
phytase tái tổ hợp. Năm 2007, Đỗ Thị Ngọc Huyền đã tách dòng và thể hiện phyC
tái tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E. coli và thu đƣợc lƣợng enzyme tái tổ hợp ở
nồng độ 288 mg l-1, gấp 48 lần phytase từ chủng tự nhiên [3]. Năm 2008, Nguyễn
Văn Viết biểu hiện phyC tái tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E. coli BL21 (DE3) đạt
tổng năng suất phytase nội bào và ngoại bào là 92 IU ml-1 [5].
Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme Phytase tái
tổ hợp từ nấm men” của Bộ Công Thƣơng, nhóm nghiên cứu chúng tôi (Viện Công
nghiệp Thực phẩm) đã thực hiện thử nghiệm tách dòng gen mã hóa enzyme phytase
(phyA) từ Aspergillus niger XP và biểu hiện trên P. pastoris. Phytase tái tổ hợp thu
nhận đƣợc hoạt động tối ƣu ở pH 2,5 và pH 5,0, nhiệt độ 60C. Mức độ thể hiện sản
K21-Sinh học thực nghiệm

12

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
phẩm phytase ngoại bào đạt trên 1000 IU ml-1. Một trong những yếu điểm của
enzyme tạo đƣợc là tính bền nhiệt thua kém so với enzyme thƣơng phẩm [6, 40].
Những kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc về phytase là hết sức có
ý nghĩa. Đây cũng là động lực và cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát

triển, hoàn thiện tiến tới sản xuất phytase trong nƣớc.
1.6. Cấu trúc protein liên quan đến khả năng hồi tính của phytase từ A. niger
và A. fumigatus
Phytase ứng dụng trong chăn nuôi cần đảm bảo các yêu cầu nhƣ tính bền nhiệt
để xử lý ở 70 - 80 C trong quá trình ép viên, hoạt động tốt ở pH thấp trong điều
kiện dịch dạ dày của động vật, chống chịu đƣợc enzyme thủy phân protein nhƣ
pepsin, pancreatin để duy trì hoạt tính trong hệ tiêu hóa của vật nuôi. Một enzyme
nguyên bản khó có thể đồng thời đáp ứng các điều kiện công nghệ kể trên. Vì vậy
một hƣớng nghiên cứu mới đang đƣợc quan tâm, đó là nghiên cứu ảnh hƣởng của
cấu trúc không gian đến hoạt tính của enzyme phytase từ đó cải biến nguồn gen sẵn
có để sinh tổng hợp một enzyme đáp ứng đƣợc các yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao.
Năm 2007, Zhang và CS chỉ ra rằng liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu trúc
không gian của phân tử phytase từ A. fumigatus có vai trò rất quan trọng làm tăng
khả năng “đàn hồi” nhiệt. Đó là những liên kết mà phytase từ A. niger không có
đƣợc nên hoạt tính của enzyme này giảm hơn hẳn khi bị biến tính ở nhiệt độ cao.
Tác giả cũng khuyến cáo thay thế bốn vị trí axit amin của phytase từ A. niger theo
A. fumigatus sẽ làm tăng đáng kể hoạt tính của nó [73]. Theo quan điểm của Zhang
và CS, các nhà nghiên cứu sau đó đã thu đƣợc những kết quả thú vị khi tiến hành
cải biến gen mã hóa phytase từ chủng nấm mốc A. niger nhằm tăng tính bền nhiệt
của enzyme này [30, 39, 58, 69].
Phân tích cấu trúc của phytase chịu nhiệt cho ta cái nhìn sâu sắc về các tƣơng
tác trong phân tử góp phần duy trì sự ổn định cấu trúc, từ đó giúp cho các nhà
nghiên cứu tạo ra enzyme phytase có chất lƣợng tốt hơn. Cấu trúc phân tử của
phytase từ A. fumigatus bao gồm 435 axit amin trong đó gốc His59 đƣợc
phosphoryl hóa, liên kết với 6 phân tử N-acetylglucosamine và 614 phân tử nƣớc.
Giống nhƣ các enzyme thuộc họ Histidine acid phytase khác, enzyme thủy phân
K21-Sinh học thực nghiệm

13

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
phytate từ A. fumigatus cũng có trung tâm hoạt động đƣợc tạo bởi hai trình tự bảo
thủ RHGXRXP và HD nằm xa đầu N và C [73]. Và tƣơng tự nhƣ cấu trúc của
A. niger, enzyme này bao gồm một cấu trúc α/β lớn và một cấu trúc xoắn α nhỏ hơn
cùng với một trung tâm hoạt động tích điện dƣơng tƣơng đối lớn nắm ở vùng phân
cách giữa hai cấu trúc này (Hình 1.3 -A).

A

B

Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus [67].
A: Mô hình ba chiều của phytase A. fumigatus. Trung tâm hoạt động
phosphohistidine đƣợc hiển thị ở trung tâm của mô hình, sáu N-acetylglucosamine
tại sáu vị trí glycosyl hóa (Asn) đƣợc biểu thị bằng hình cầu và que màu trắng. Cấu
trúc α nhỏ đƣợc biểu thị màu tím, cấu trúc α/β lớn đƣợc biểu thị bởi các màu khác.
Năm liên kết disulfide đƣợc biểu thị màu lục lam. B: Mô hình mạng lƣới liên kết
hydrogen ở trung tâm hoạt động giúp ổn định phản ứng trung gian.
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy enzyme phytase bền nhiệt có thể đƣợc
thu nhận từ chủng nấm mốc A. fumigatus. Trên thực tế, enzyme này cũng không bền
với nhiệt độ cao nhƣng lại có một đặc tính đáng quý là có khả năng phục hồi lại cấu
trúc ban đầu sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ. Nhƣợc điểm lớn nhất của phytase từ
A. fumigatus là ít đƣợc kiểm chứng trong sản xuất phục vụ chăn nuôi và hoạt động
tối ƣu ở dải pH tƣơng đối cao (4,0 – 7,3). Tìm hiểu về khả năng hồi tính của
enzyme này, các nhà nghiên cứu đã chọn cấu trúc của phytase A. niger làm mô hình
so sánh để làm sáng tỏ vấn đề này. Nhìn chung, cấu trúc của hai enzyme có độ
tƣơng đồng khá cao, trong đó ba vùng cấu trúc có sự khác biệt đƣợc cho là yếu tố có

K21-Sinh học thực nghiệm

14

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
ảnh hƣớng lớn đến khả năng hồi tính của phytase A. fumigatus. Ba vùng này là
Glu35-Ser42, Gly163-Arg168, Arg248-Ser254. Vùng Glu35-Ser42 liên quan đến sự
thay thế gốc kỵ nƣớc bởi gốc axit dẫn đến khả năng tăng số lƣợng các tƣơng tác
hydro. Còn cấu trúc vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 liên quan đến các
tƣơng tác ion gây ra bởi gốc arginine [67].
Kết quả so sánh cấu trúc không gian vùng axit amin 35-42 của phytase từ
A. fumigatus so với A. niger cho thấy sự thay thế Ala35 bởi Glu35 có vai trò quan
trọng trong việc hình thành mạng lƣới liên kết hydro bao gồm 12 liên kết (Hình 1.4A, bên trái). Sự tƣơng tác giữa Glu35 và Ser42 tạo cấu trúc thòng lọng bền vững
thông qua các liên kết hydro. Ngƣợc lại, cấu trúc tại vùng này của phytase A. niger
chỉ có ba liên kết hydro (Hình 1.4-A, bên phải). Do vậy, mạng lƣới liên kết hydro
có thể là yếu tố quan trọng giải thích sự khác biệt về cấu trúc tại vùng axit amin 3542 giữa hai enzyme này. Tƣơng tự, sự thay thế Pro42 bởi Ser42 của phytase
A. fumigatus cũng đóng vai trò quan trọng. Gốc Ser42 không những tạo thêm các
liên kết hydro mà còn linh động hơn gốc Pro42 của phytase A. niger, tạo điều kiện
hình thành các tƣơng tác hydro rộng hơn của gốc Glu35. Điều này giúp chúng ta
hiểu thêm đƣợc tại sao sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, phytase của A. fumigatus
có thể khôi phục lại cấu trúc không gian của nó nhờ các liên kết hydro đƣợc phục
hồi dẫn đến hoạt tính của enzyme không bị ảnh hƣởng lớn nhƣ phytase của A. niger.
Hai liên kết cầu muối giữa hai vùng Gly163-Arg168 và Arg248-Ser254 đƣợc
tìm thấy ở enzyme phytase của A. fumigatus. Hai liên kết này đƣợc hình thành do
hai axit amin arginine 168 và 248 mà ở A. niger không có nên không tạo liên kết ion
ở hai vùng này. Cả hai gốc arginine cùng tƣơng tác với gốc aspartate 244 tạo nên
cấu trúc hộp có gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn. Các cấu trúc gắn mũ nhƣ vậy có

vai trò duy trì cấu trúc xoắn của các sợi oligopeptide, góp phần làm tăng sự ổn định
của protein. Do đó, việc thay thế gốc Glu168 của phytase A. niger bởi gốc Arg168
của A. fumigatus sẽ dẫn đến sự hình thành cấu trúc gắn mũ ở đầu C của chuỗi xoắn
α 140-161 đồng thời liên kết hydro giữa nguyên tử NH2 Arg168 tích điện dƣơng và
nguyên tử O Asp161 tích điện dƣơng cũng đƣợc hình thành (Hình 1.4-B, bên trái).
Tuy nhiên, axit amin ở vị trí 166 của phytase từ A. niger lại là axit amin kỵ nƣớc
K21-Sinh học thực nghiệm

15

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
proline làm cho cấu trúc của chuỗi chính bị bẻ gập vào trong vùng ƣa nƣớc, hạn chế
sự linh động của gốc này (Hình 1.4-B, bên phải). Một cấu trúc gắn mũ ở đầu C cũng
đƣợc tìm thấy ở vùng Val246-Gln254 nhờ tƣơng tác liên kết hydro giữa nguyên tử
NH1 Arg 248 và nguyên tử O Asp244 giúp ổn định chuỗi xoắn α 230-247 (Hình 1.4C).

Hình 1.4. Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase A.
fumigatus [67]. A. So sánh cấu trúc thòng lọng Glu35-Ser42 trên miền α/β của
phytase A. fumigatus (trái) và A. niger (phải). B. So sánh cấu trúc thòng lọng
Ala163-Ala168 trên miền α/β của phytase A. fumigatus (trái) và A. niger (phải). C.
Cấu trúc hộp gắn mũ C trong trung tâm miền α nhỏ cho thấy sự tƣơng tác qua liên
kết hydro ở đầu C của chuỗi xoắn. D. Sơ đồ một cấu trúc hộp gắn mũ C mà C1, C2,
C3 là phần còn lại của đầu C của chuỗi xoắn α và C‟, C‟‟ là phần còn lại chuỗi xoắn
sau đó.

K21-Sinh học thực nghiệm

16

Đặng Thị Kim Anh