Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------------

HOÀNG NHẬT LỆ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FLT3
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN LƠ XEMI CẤP
DÒNG TỦY
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. LÊ XUÂN HẢI
2. GS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội - Năm 2014


LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, TS. Lê Xuân
Hải những người thầy tận tâm đã hướng dẫn, dìu dắt, dành nhiều thời gian quí báu,
tạo mọi điều kiện tốt nhất và tâm huyết giúp đỡ cho em hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn chân thành nhất đến TS. Phạm Bảo Yên, ThS.
Trịnh Lê Phương, ThS. Ngô Kim Toán và cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập
tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và protein đã giúp đỡ và chia
sẻ kinh nghiệm thực tế trong quá trình thực hiện thí nghiệm phân tích đột biến gen.
Tôi cũng xin được cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS. Nguyễn Anh Trí, Viện

trưởng Viện Huyết học- Truyền máu TW, đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành
chương trình học đào tạo của một học viên cao học.
Tôi cũng chân thành cảm ơn Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học và Bộ môn Sinh
lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên đã giúp đỡ tận tình trong thời gian tôi học và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể Khoa H7, Phòng Kế
hoạch tổng hợp, Khoa Huyết thanh học nhóm máu, Khoa Lưu Trữ và Phân phối
máu, Phòng Tổ chức cán bộ và các Khoa phòng trong Viện đã luôn tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi trong suốt những năm tháng tôi học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi đã
đồng hành, động viên về mặt tinh thần cũng như vật chất để tôi có thể yên tâm hoc
tập, công tác và hoàn thành luận văn
Hoàng Nhật Lệ


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AML:

Lơ xê mi cấp dòng tủy (Acute myelogenlous leukemia)

BN:

Bệnh nhân

ddNTP:

Dideoxynucleoside triphosphate

dNTP:

Deoxynucleoside triphosphate

FAB:

French - American - British

FLT3:

FMS related tyrosin kinase

Hb:

Hemoglobin

HC:

Hồng cầu

ITD:

Internal tandem duplication

KLB:

Không lui bệnh

LBHT:

Lui bệnh hoàn toàn

LBMP:

Lui bệnh một phần

LXM:

Lơ xê mi

NCCN:

National Comprehensive Cancer Network

NST:

Nhiễm sắc thể

SLBC:

Số lượng bạch cầu

SLTC:

Số lượng tiểu cầu

WHO:

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

TB:

Tế bào

TBBT:

Tế bào bất thường

TKD:

Tyrosin kinase domain


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về AML ............................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện AML ..................................................................... 3
1.1.2. Phân loại bệnh AML ......................................................................... 4
1.1.3. Phân loại bệnh theo FAB ................................................................... 6
1.2. Tình trạng mắc bệnh AML ............................................................................. 9
1.2.1. Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới ............................................. 9
1.2.2. Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam ............................................ 10
1.3. Một số nguyên nhân gây bệnh AML ............................................................ 11
1.3.1.Yếu tố di truyền ............................................................................... 11
1.3.2. Yếu tố môi trường ........................................................................... 11
1.3.3. Virus .............................................................................................. 12
1.3.4. Bất thường về nhiễm sắc thể ............................................................ 12
1.3.5. Các yếu tố khác ............................................................................... 13
1.3.6. Cơ chế bệnh sinh của AML ............................................................. 13
1.4. Gen FLT3 và các loại đột biến trên gen FLT3 .............................................. 14
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 (hình 1.6 và hình 1.7) .............. 14

1.4.2. Ý nghĩa của xét nghiệm phát hiện đột biến gen FLT3 trong tiên
lượng điều trị AML .......................................................................... 17
1.4.3. Các loại đột biến trên gen FLT3 ....................................................... 18
1.4.4. Phương pháp phát hiện đột biến trên gen FLT3 ................................ 20
Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 22
2.2. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 22
2.3. Các thiết bị máy móc dùng trong nghiên cứu ............................................... 23
2.4. Các phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 24
2.4.1. Đánh giá tình trạng bệnh nhân bằng các tiêu chí lâm sàng ................. 24
2.4.2. Tách chiết và định lượng DNA tổng số ............................................ 25


2.4.3. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp Bibdo .......................... 26
2.4.4. Điện di phân tách DNA trên gel agarose ........................................... 27
2.4.5. Nhân bản gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen FLT3 ...... 27
2.4.6. Nhân dòng gen FLT3 vào E. coli ..................................................... 29
2.4.7. Xác định trình tự gen theo nguyên lý của Sanger và cộng sự ............. 30
2.5. Phân tích, xử lý số liệu theo phương pháp nghiên cứu ................................. 31
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ................................... 32
3.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân AML chọn nghiên cứu sự
có mặt của đột biến gen FLT3 ............................................................................. 32
3.1.1. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo tuổi .................................................... 32
3.1.2. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo giới .................................................... 34
3.1.3. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB .................................... 35
3.1.4. So sánh hiệu quả điều trị lâm sàng giữa nhóm có đột biến và
không có đột biến FLT3-ITD ............................................................ 36
3.2. Phân tích sự có mặt của đột biến gen FLT3 ................................................. 37
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số .................................................................. 37
3.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa FLT3 bằng PCR .................................... 38

3.2.3 Nhân dòng FLT3 vào vector ............................................................. 40
3.2.4. Xác định trình tự gen FLT3 mang gen đột biến ................................. 42
3.2.5. Phân tích kết quả đột biến gen FLT3 - ITD với đột biến nhiễm
sắc thể 43
3.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân có đột biến gen FLT3 44
3.3.1. Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD .................. 44
3.3.2. Đặc điểm lâm sàng liên quan đến tình trạng xuất huyết của bệnh nhân
AML 45
3.3.3. Đặc điểm lâm sàng liên quan đến tình trạng thiếu máu của bệnh
nhân AML 46
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO ................................................... 5
Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lượng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trưởng thành ........... 17
Bảng 1.3. Nhóm tiên lượng theo NCCN 2013 ......................................................... 18
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................ 28
Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả ............................ 32
Bảng 3.2. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB ........................................... 35
Bảng 3.3. Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen FLT3-ITD với đột biến nhiễm sắc thể ........ 43
Bảng 3.4. Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD ........................ 44
Bảng 3.5. So sánh tình trạng thiếu máu của BN giữa hai nhóm .............................. 46


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2 ................................................................... 7
Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3 ................................................................... 7
Hình 1.3. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4 ................................................................... 8
Hình 1.4. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5 ................................................................... 9
Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn .................................. 12
Hình 1.6. Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13 ......................................... 16
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3 ..................................................... 16
Hình 3.1. Phân bố của bệnh AML theo giới ............................................................. 34
Hình 3.2. So sánh kết quả điều trị giữa nhóm có đột biến và không đột biến .......... 36
Hình 3.3. Hình ảnh một số mẫu bệnh nhân AML được tách DNA tổng số ............. 38
Hình 3.4. Sàng lọc mẫu bệnh nhân AML bằng PCR ................................................ 39
Hình 3.5. Hình ảnh tinh sạch băng đột biến FLT3 ................................................... 40
Hình 3.6. Điện di khuẩn lạc sau khi nhân dòng FLT3 .............................................. 41
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự mẫu 146.5 có đột biến 45 bp.................................... 42
Hình 3.8. Tình trạng xuất huyết giữa nhóm có đột biến và không có đột biến ........ 45


ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML-Acute Myelogenic Leukemia) là một bệnh lý
đơn dòng ác tính của tổ chức sinh máu, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh của
các tế bào non (blast) bất thường, chủ yếu ở trong tủy xương và ở máu ngoại vi có
các tế bào non ác tính. Những tế bào này lấn át tế bào bình thường và ức chế quá
trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương
[2,14,21].
Theo các nghiên cứu trên thế giới, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở
bệnh nhân mắc AML xảy ra ở 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine
kinase 3 (FLT3) và CCAAT- enhancer binding protein alpha (CEBPA) [29,30,32,40].
Khoảng 30% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bình
thường bị đột biến gen FLT3, hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ở

trạng thái hoạt động mà không cần dimer hóa, dẫn đến rối loạn quá trình phát triển
và biệt hóa tế bào máu. Nhiều nhóm nghiên cứu FLT3 đã phát hiện ra hai kiểu đột
biến thường gặp nhất trên gen này là lặp đoạn nội phân tử (ITD - internal tandem
duplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amin aspartic ở vị trí 835 thuộc
vùng tyrosine kinase [38,42,49,55].
Tỷ lệ mắc bệnh LXM cấp ở Mỹ năm 2012 khoảng 3-5 trường hợp trong
100.000 dân, chiếm khoảng 3% tổng số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, theo nghiên
cứu của Bạch Quốc Khánh và cộng sự năm 2012 lơ xê mi cấp chiếm tỷ lệ 41,5%
trong các bệnh máu. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới. Tuy nhiên bệnh có xu
hướng gặp nhiều hơn ở trẻ em và người già [7]. Nhóm AML thường gặp ở người
lớn trong khi đó, nhóm LXM cấp dòng lympho chiếm 75-80% LXM cấp ở trẻ em
Trước đây việc chẩn đoán AML chủ yếu dựa vào hình thái học tế bào, hóa học
tế bào kết hợp với triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân do đó việc phân loại AML
còn gặp nhiều khó khăn đối với bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường thì
không phát hiện được những tổn thương trên gen để có định hướng điều trị.
Tuy vậy, hầu như chưa có các nghiên cứu đi sâu phân tích các dạng đột biến
cụ thể gây nên bệnh AML. Chính vì vậy việc áp dụng các phương pháp phân tích

1


DNA để xác định và phát hiện các loại đột biến ở bệnh nhân AML là rất cần thiết và
có ý nghĩa giá trị thực tiễn thiết thực trong chẩn đoán bệnh. Đề tài: ˝Nghiên cứu đột
biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” của chúng tôi
được đặt ra nhằm mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi cấp
dòng tủy.
2. Bƣớc đầu xác định các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các bệnh
nhân có đột biến này.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về AML
Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML) là một trong các loại ung thư máu ác tính nhất
và tiến triển rất nhanh. Nguyên nhân phát sinh bệnh là do các thay đổi bất thường
(đột biến) dẫn đến làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, loại tế bào chịu trách
nhiệm bảo vệ cơ thể thông qua các cơ chế miễn dịch, tạo ra những bạch cầu bất
thường với tốc độ nhanh chóng. Bệnh nhân AML, nếu không được chẩn đoán, điều
trị kịp thời và phát hiện sớm sẽ tử vong [14,19].
1.1.1. Lịch sử phát hiện AML
Năm 1827, bác sỹ Velpeau người Pháp đã mô tả một người bán hoa 63 tuổi
mang một căn bệnh đặc trưng tiến triển bởi sốt, suy nhược, sỏi thận, gan to, lách to.
Velpeau ghi nhận máu của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiện
tượng này là do số lượng bạch cầu rất nhiều ở trong máu bệnh nhân.
Năm 1845, Bennett mô tả một loạt bệnh nhân tử vong có triệu chứng lách to,
máu thay đổi về màu sắc và tăng độ quánh. Ông cũng sử dụng thuật ngữ
„leucocythemia‟ chỉ đặc điểm ở những bệnh nhân này có dày đặc bạch cầu trong
máu ngoại vi.
Năm 1856, thuật ngữ "bệnh bạch cầu" được đặt ra bởi Rudolf Virchow, nhà
bệnh lý học nổi tiếng người Đức, ông cũng là người tiên phong trong việc sử dụng
kính hiển vi quang học để đọc công thức máu của bệnh nhân, Virchow là người đầu
tiên mô tả các bất thường của các tế bào máu trắng ở bệnh nhân có hội chứng lâm
sàng đã được mô tả bởi Velpeau và Bennett. Virchow đã không tìm ra được nguyên
nhân của việc sản sinh quá nhiều tế bào bạch cầu, ông đã sử dụng thuật ngữ mô tả
"bệnh bạch cầu" (tiếng Hy Lạp: "máu trắng") để chỉ tình trạng này.
Năm 1877, Paul Ehricl đã tìm ra phương pháp nhuộm tiêu bản và đưa
phương pháp này vào việc mô tả sự khác thường giữa bạch cầu bình thường và bất

thường ở bệnh nhân.

3


Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đã đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương vào
chẩn đoán đối với những bệnh nhân có triệu chứng xuất huyết và thiếu máu ở trên.
Năm 1889, Wilhelm Ebstein đã dùng thuật ngữ (leukemia-lơ xê mi cấp) với triệu
chứng bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu để chẩn đoán phân biệt với lơ xê mi mạn.
Năm 1900, Naegeli gọi myeloblast là tế bào ác tính trong bệnh lơ xê mi cấp
và chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy (AML) và dòng lympho (ALL).
Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học
tế bào [31].
Năm 2001, WHO đã đưa ra phân loại lơ xê mi cấp để chẩn đoán xác định về
tế bào blast đã giảm xuống còn ≥ 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy được chẩn
đoán xác định so với tiểu chuẩn của FAB (1986) tế bào blast ≥ 30%.
Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn
đoán và đánh giá tiện lượng của bệnh đề ra phương pháp điều trị thích hợp.
1.1.2. Phân loại bệnh AML
AML có nhiều thể loại khác nhau, phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái
học, hóa học tế bào, các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào, các đột biến về mặt di
truyền và gen. Trong bảng phân loại của WHO năm 2001 có nhiều thể bệnh AML
với các rối loạn về di truyền, bất thường trên gen từ đó giúp cho việc chẩn đoán
được tiên lượng về bệnh rõ ràng hơn [31].
Năm 2008 WHO đã đưa ra phân loại mới về AML mở rộng hơn so với phân
loại của WHO năm 2001 với một số bệnh đáng chú ý, trong đó đặc biệt một số gen
được đưa vào để xác định AML (bảng 1.1), gen FLT3 mặc dù chưa được đưa vào
chính thức để áp dụng trong chẩn đoán, nhưng cũng được khuyến cáo nên tiến hành
xét nghiệm trong điều kiện cho phép [56].

4


Bảng 1.1. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO
Phân loại WHO 2008 – AML

Phân loại WHO 2001 – AML
1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay
gặp

1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp
AML có t(8;21)(q22;q21); RUNX1-

AML với t(8;21) (q22;q21);

RUNX1T1

(AML/ETO)

AML inv(16)(p13.1q22) hoặc

AML inv(16)(p13.q22)hoặc

t(16 ;16)(p13.1q22); CBFβ- MYH11

t(16;16)(p13.q22); (CBFβ/MYH11)

APL có t(15;17)(q22;q21) ; PML- RARA

APL có t(15;17)(q22;q21);(PML/

RARa)

AML có t(9;11)(p22;q23); MLLT3- MLL

AML 11q23(MLL)

AML t(6;9)(p23;q34) ; DEK- NUP 214
AML có inv(3)(q21;q26.2)hoặc
t(3;3)(q21;q26.2); RPN1- EV11
AML t(1;22)(p13;q13); RBM15- MKL1
AML có đột biến gen NPM1
AML có đột biến gen CEBPA
2. AML liên quan đến thay đổi rối loạn sinh 2.AML liên quan đến thay đổi rối loạn
tủy
sinh tủy có đột biến đa dòng
3. AML thứ phát sau điều trị các bệnh ác tính 3. AML liên quan đến điều trị
4. AML không phân loại

4. AML không phân loại

AML với sự khác biệt tối thiểu M0

AML với sự khác biệt tối thiểu M0

AML không có sự trưởng thành M1

AML không có sự trưởng thành M1

AML dòng tủy mono M4

AML dòng tủy mono M4

AML dòng mono M5

AML dòng mono M5

AML dòng hồng cầu M6

AML dòng hồng cầu M6

5


Phân loại WHO 2008 – AML

Phân loại WHO 2001 – AML

AML dòng mẫu tiểu cầu M7

AML dòng mẫu tiểu cầu M7

AML dòng bạch cầu ưa baso

AML dòng bạch cầu ưa baso

AML tăng sinh toàn bộ xơ

AML tăng sinh toàn bộ xơ

Myeloid sarcoma (mô liên kết)

Myeloid sarcoma (mô liên kết)

5. Tăng sinh tủy liên quan đến hội chứng
Down
6. Blastics plasmacytoid dendrictic cell
neoplasm

1.1.3. Phân loại bệnh theo FAB
Phân loại AML đã được sử dụng rộng rãi từ năm 1976 cho đến nay và dựa trên
chủ yếu là phân loại bằng hình thái học tế bào và hóa học tế bào. Người ta phân loại
thành 8 thể sau:
* Thể M0: AML thể không biệt hóa trong đó có tế bào non bất thường ≥ 90%,
- Tế bào tiền tủy bào < 3%.
* Thể M1: AML thể chưa trưởng thành (AML without maturation):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≥ 90% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.
* Thể M2: AML thể trưởng thành (AML with maturation, hình 1.1):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≤ 89% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.

6


Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2
* Thể M3: AML thể tiền tuỷ bào (acute promyelocytic leukemia, hình 1.2):

- ≥ 5% blast dương tính với MPO và hoặc Sudan đen.
- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
Đại đa số tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào, có nhiều hạt đặc hiệu trong
bào tương.

Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3
* Thể M4: Lơ xê mi cấp tuỷ - mono (acute myelomonocytic leukemia, hình 1.3):

7


- Các phương pháp nhuộm MPO, Sudan đen, Esterase không đặc hiệu dương
tính với hai quần thể tế bào.
- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≥ 30% là blast, tế bào dòng tuỷ (kể cả blast) chiếm 30 - 80%.
- 5% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu/lympho là bạch cầu ưa acid
thì xếp vào thể M4eo.

Hình 1.3. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4
* Thể M5: Lơ xê mi cấp dòng mono (acute monoblastic leukemia, hình 1.4):
- MPO và Sudan đen âm tính hoặc dương tính yếu. Esterase MPO và Sudan
đen âm tính hoặc dương tính yếu, esterase đặc hiệu dương tính mạnh và không bị ức
chế bởi NaF.
- Trong thể M5 người ta chia thành 2 loại M5a và M5b.
- Trong đó M5a: tế bào blast biệt hóa, trở thành monocyte non, nguyên sinh
chất chiếm tỷ lệ cao.
- M5b: tế bào monocyte chín chiếm tỷ lệ cao trong tủy. Nguyên sinh chất không có
hạt đặc hiệu.

8

Hình 1.4. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5
* Thể M6: Lơ xê mi cấp dòng hồng cầu (acute erythroblastic leukemia):
- PAS có thể dương tính, các phương pháp nhuộm khác ít có giá trị. MPO,
Sudan đen có thể dương tính.
- ≥ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu và thường bị loạn sản.
- ≥ 30% tế bào không thuộc dòng hồng cầu là blast tuỷ.
- Có thể gặp thể Auer.
* Thể M7: Lơ xê mi cấp dòng mẫu tiểu cầu (acute megakaryoblastic leukemia):
- PAS, esterase không đặc hiệu và peroxydase tiểu cầu dương tính.
- MPO và Sudan đen âm tính.
1.2. Tình trạng mắc bệnh AML
1.2.1. Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới
Theo thống kê của Cộng đồng Châu Âu năm 2000-2002 tỷ lệ mắc bệnh AML
ở các nước trong khu vực như sau: Phía Bắc cộng đồng Châu Âu thì tỷ lệ mắc bệnh
AML là 2,95 trong 100,000 dân, trong đó khu vực miền Trung và miền Nam thì tỷ
lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân lần lượt là 2,92 và 2,90 nhưng riêng nước Anh
và Ireland thì tỷ lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân là 3,24.
Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Canada năm 2007 cho đến nay tỷ lệ mắc
bệnh của người dân Canada cứ 1,130 người mắc AML được chẩn đoán mới thì có

9


587 là nam giới và 543 là nữ giới. Tỷ lệ tử vong năm 2009 của AML là 897 trường
hợp trong đó nam giới là 479 người và nữ giới là 418 người [60]. Năm 2008 ước
tính trên toàn thế giới có khoảng 12,7 triệu ca bị ung thư trong đó có 7,6 triệu ca
chết vì ung thư.
Năm 2012 ở Mỹ có 47,150 người được chẩn đoán là lơ xê mi cấp trong đó

AML chiếm khoảng 3% so với các loại ung thư khác, độ tuổi chiếm 15-25% ở trẻ
nhỏ còn người lớn thì tăng theo tuổi cứ trên 67 tuổi thì tỷ lệ mắc bệnh AML ngày
càng tăng. Năm 2013 ở Mỹ có khoảng 48,610 ca được chẩn đoán mới về ung thư,
trong đó AML có khoảng 14,590 ca được chẩn đoán mới và 10,730 ca tử vong hầu
hết là người trưởng thành [61].
Theo Hiệp hội Ung thư thế giới ở các nước khu vực Tây Âu thì tỷ lệ mắc các
bệnh này là 2,07 trong 100,000 dân.
1.2.2. Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam
Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Thị Minh An cho thấy rằng giai đoạn 1974-1990
cho thấy tỷ lệ bệnh nhân đến khám và điều trị lơ xê mi cấp ngày càng tăng [1].
Trong thời gian này chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phân loại hình thái học tế bào
và triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân.
Năm 1997, nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự về tình hình bệnh máu
tại Viện Huyết học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai cho biết tỷ lệ bệnh nhân
được chẩn đoán là bệnh máu ác tính chiếm 32,03% trong đó là AML chiếm tỷ lệ
cao là 64,3% [13].
Theo thống kê của Trần Thị Minh Hương trong 3 năm (1997-1999) tại Viện Huyết
học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai thì tình hình mắc bệnh lơ xê mi cấp ngày càng
tăng, tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp chiếm 38,5% trong các bệnh máu ác tính [5].
Năm 2000-2002, Đỗ Trung Phấn và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nâng cao
chất lượng phân loại lơ xê mi cấp tại Viện Huyết học-Truyền máu-Bệnh viện Bạch
Mai cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp là 32,1% trong số các bệnh máu tới khám
và điều trị tại Viện [15].

10


Năm 2006, Nguyễn Hữu Toàn và cộng sự đã có những báo cáo về tiên lượng
trong bệnh AML nhưng chưa đề cập tới tiên lượng của bệnh nhân có đột biến gen
FLT3 [17].

Năm 2008, Trần Thị Phương Túy và cộng sự khi nghiên cứu giá trị dấu ấn
miễn dịch trong chẩn đoán phân loại lơ xê mi cấp tại Bệnh viện trung ương Huế cho
thấy tỷ lệ mắc bệnh là 38,7% [22].
Năm 2010, Nguyễn Triệu Vân và cộng sự cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp
cũng tăng theo từng năm trong đó AML chiếm là 63,7% trong lơ xê mi cấp [23].
Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu tình hình bệnh máu đến khám và điều
trị tại Viện Huyết học -Truyền máu TW giai đoạn 2010-2012 cho thấy tỷ lệ lơ xê mi cấp
chiếm 41,5% trong tổng số bệnh nhân đến khám mới tại Viện [7].
Các kết quả thống kê trên đây cho thấy có sự gia tăng của tỷ lệ bệnh nhân lơ xê mi
cấp trong những năm gần đây. Một trong các nguyên nhân của sự gia tăng này có thể liên
quan đến việc áp dụng các kỹ thuật cao trong việc chẩn đoán phân loại bệnh AML.
1.3. Một số nguyên nhân gây bệnh AML
Cho đến nay nguyên nhân gây bệnh AML chưa được xác định một cách rõ ràng,
nhưng người ta vẫn đề cập đến một số yếu tố bệnh cảnh có liên quan đến bệnh AML.
1.3.1.Yếu tố di truyền
Yếu tố gia đình: Có rất nhiều thông báo về tình trạng mắc bệnh lơ xê mi cấp
trong một gia đình. Khả năng mắc bệnh ở những gia đình có người bị bệnh ung thư
tăng gấp 3 lần so với gia đình không có người bị bệnh. Nghiên cứu của Phạm
Quang Vinh cũng cho thấy bệnh nhân và con của bệnh nhân cùng mang một loại
đột biến nhiễm sắc thể [25,26].
Yếu tố di truyền: một số thể bệnh bẩm sinh di truyền như hội chứng Down,
Fanconi, Klinefelter… là những nguyên nhân để bệnh nhân mắc tỷ lệ ung thư máu
rất cao. Nguyên nhân có thể là do cấu trúc nhiễm sắc thể không bền vững rất dễ tổn
thương làm cho nhóm đối tượng này dễ phát sinh bệnh AML.
1.3.2. Yếu tố môi trường
- Tiếp xúc với môi trường độc hại như thuốc trừ sâu, dioxin, benzen, hóa chất đột

11

biến gen như ethidium bromide…làm cho nguy cơ xuất hiện lơ xê mi cấp ngày càng tăng.
- Các tia bức xạ ion hóa làm cho đột biến nhiễm sắc thể dẫn đến ung thư máu. Ví
dụ những cư dân Nhật Bản sống sót tại vụ nổ bom Hiroshima và Nagazaki mắc ung thư
cao gấp nhiều lần so với người khác. Tương tự như vậy vụ nổ nhà máy điện tử hạt nhân
Chernobyl tại Nga cũng là nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh về ung thư.
1.3.3. Virus
Cho tới nay các nhà khoa học chưa tìm thấy được mối liên quan nào giữa virus
và bệnh lơ xê mi cấp. Tuy vậy một số công trình nghiên cứu thực nghiệm cho thấy
có mối liên quan một số virus như Epstein Barr virus (EBV) gây ung thư vòm họng,
Human Papilloma virus (HPV) gây ung thư tử cung và Human T-Cell
Lymphotrophic virus1, 2 (HTLV-1, 2) gây ung thư lơ xê mi dòng T lympho.
1.3.4. Bất thường về nhiễm sắc thể
Trong lơ xê mi thường gặp hiện tượng chuyển đoạn từ một nhiễm sắc thể này
tới một nhiễm sắc thể khác tạo nên một sự sắp xếp mới, chuyển phần promoter của
gen này nối với phần cấu trúc của gen khác làm cho gen được phiên mã, đảo đoạn
có thể trong cùng một nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể khác, mất đoạn, lặp đoạn
đấy là những nguyên nhân thường gặp (hình 1.5).

Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn

12


1.3.5. Các yếu tố khác
Như chúng ta đã biết mỗi một chủng tộc khác nhau cũng có gen và yếu tố đặc
trưng về di truyền khác nhau ví dụ như tỷ lệ mắc bệnh AML ở phía Tây Âu khác với tỷ
lệ mắc bệnh ở Bắc Âu là do các yếu tố chủng tộc cũng là nguyên nhân gây bệnh AML.
1.3.6. Cơ chế bệnh sinh của AML
Cơ chế bệnh sinh của AML còn nhiều vấn đề chưa được rõ ràng. Đa số các
nhà khoa học cho rằng AML là do đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen: gen tiền

ung thư mất khả năng kiểm soát tạo ra gen ung thư. Cơ chế thứ hai gen làm nhiệm
vụ ức chế ung thư, chức năng chính của chúng tác động đến quá t nh của tế bào như
sự phát triển, biệt hóa, tự tái sinh, khả năng chống chịu, kiểm soát chu trình tế bào,
cơ chế tự sửa chữa DNA và vai trò giữ ổn định vật chất di truyền.
Cơ chế xuất hiện gen ung thư thường gặp trong AML là do sự đột biến gen
bình thường. Các gen bình thường mất kiểm soát hoặc không hoạt động dẫn đến tế
bào tăng sinh mạnh, không bị chết bởi chương trình và lấn át những tế bào bình
thường khác. Điều này làm cho tế bào ung thư càng phát triển mạnh.
Có rất nhiều bất thường di truyền được phát hiện trong AML như t(15;17) hay
gặp trong bệnh M3, t(8;21) và inv(16)…Trong AML, thường gặp khoảng 50% bất
thường về di truyền và những bất thường này được chia nhóm như sau:
- Nhóm một bao gồm gen hoạt động liên quan truyền tín hiệu kích thích phát
triển tế bào. Thông qua các receptor tyrosin kinase làm kích hoạt quá trình
phosphoryl hóa dẫn đến sự tăng sinh tế bào vượt qua khả năng kiểm soát. Các gen
đóng vai trò trong hoạt động này là BCR-ABL, FLT3, c-Kit…
- Nhóm hai gồm những gen ảnh hưởng đến quá trình phiên mã. Các gen thay
đổi do sự đảo đoạn, mất đoạn của nhiễm sắc thể [10, 21].
- Nhóm ba bao gồm các gen liên quan đến sự chết theo chương trình của tế
bào. Bình thường các tế bào có thời gian sống nhất định, sau quá trình phân chia
biệt hóa tế bào sẽ chết dù không có tác động gì, như vậy gọi là chết theo chu trình tế

13


bào. Bình thường các tế bào bạch cầu tồn tại một thời gian nhất định ở máu ngoại vi
và phân chia dưới sự kiểm soát của quá trình theo cơ chế nhất định, nhưng tế bào
ung thư lại có tính chất tăng sinh mạnh và không chết theo chương trình.
- Nhóm bốn bao gồm các gen tác động vào quá trình tái tạo của tế bào, bình
thường tế bào biệt hóa và phát triển theo một dòng của tế bào, nhưng trong lơ xê mi
cấp các tế bào đều có khả năng tự tái tạo.

- Nhóm năm bao gồm gen chống ung thư, các gen này bình thường có khả
năng ngăn chặn sự phát triển khối u nhưng ở đây chúng mất chức năng này.
1.4. Gen FLT3 và các loại đột biến trên gen FLT3
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3 (hình 1.6 và hình 1.7)
- FLT3 (FMS-like Tyrosine kinase-3) hoặc CD135 là một thụ thể của cytokine
do gen FLT3 mã hóa, thuộc phân lớp thứ 3 của họ tyrosin kinase. Gen FLT3 được
biết đến đóng một vai trò quan trọng trong việc tế bào gốc tạo máu và điều hòa việc
tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc đa tiềm năng, các tế bào đầu dòng và các
lympho trưởng thành thông qua truyền dẫn các tín hiệu bằng việc gắn với FLT3.
- Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13q12 và có 24 exon. Nó mã hóa tổng hợp
protein màng tế bào gồm 993 acid amin gồm 2 phần: phần glycogyl hóa có khối
lượng phân tử 158-160 kda, phần bị glycogyl hóa với khối lượng phân tử 130-143
kda. Phân tử protein FLT3 gồm có 5 phần cấu trúc như globulin miễn dịch: phần
ngoài màng, phần xuyên màng, phần cận màng và 2 cấu trúc TK1 và TK2. FLT3
được tìm thấy ở hầu hết các mô trong cơ thể: ở cơ quan tạo máu (lách, tuyến ức, tủy
xương, tế bào máu ngoại vi), tuyến tiền liệt, tinh hoàn, thận, buồng trứng, phổi,
ruột, tim, nhau thai, nồng độ cao nhất ở tế bào đơn nhân máu ngoại vi [48].
- Nakao và cộng sự phát hiện đột biến FLT3 vào năm 1996. Đột biến là do
xuất hiện quá trình tự sao chép, một đoạn DNA tự nhân lên chèn vào đoạn giữa của
gen tạo thành hai đoạn giống nhau vì vậy gọi là lặp đoạn nội phân tử (ITD). Sau đó
nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ngoài vùng đột biến này người ta còn bắt gặp đột

14


biến vùng tyrosin kinase (TKD) và những vùng đột biến khác, nhưng tỷ lệ cao gặp
chủ yếu FLT3-ITD và FLT3-TKD [41].
- Tỷ lệ đột biến FLT3 khoảng 30% AML, đây là gen có tỷ lệ đột biến cao trong
các loại đột biến ở bệnh AML. Mặc dầu phân loại của WHO 2008 chưa đưa gen
FLT3 vào tiêu chuẩn chẩn đoán, nhưng gen này được khuyến cáo nên làm cho bệnh

nhân AML vì có giá trị trong việc tiên lượng, chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.
- Trong tủy xương bình thường FLT3 ít có biểu hiện ở tế bào gốc nhưng lại
biểu hiện cao ở tế bào máu ác tính. FLT3 có vai trò quan trọng trong việc kích thích
sự phát triển của tế bào gốc tạo máu cả hai dòng tủy và lympho. Để nghiên cứu vai
trò của FLT3 các nhà khoa học đã tổng hợp chất gắn với FLT3 (FLT3 ligand-FL) để
kích hoạt tyrosine kinase làm tăng sinh tế bào gốc tạo máu ở tủy và máu ngoại vi.
Chất gắn có vai trò trong các phản ứng miễn dịch thông qua tế bào tua gai (tế bào
trình diện kháng nguyên) và vai trò ức chế khối u thông qua tế bào giết tự nhiên
(NK). Nhưng ở bệnh nhân AML-chất gắn phối hợp cùng các yếu tố tăng trưởng
khác kích thích sự tăng sinh của tế bào ung thư. Khi có sự kết hợp giữa chất gắn và
thụ thể của FLT3, thụ thể sẽ trải qua sự biến đổi hình thái, làm cho thụ thể mở ra để
bộc lộ khu vực dimer hóa, tạo điều kiện cho việc dimer hóa giữa 2 thụ thể với nhau.
Sự dimer hóa này là khởi đầu cho việc hoạt hóa enzyme tyrosine kinase, dẫn đến sự
phosphoryl hóa nhiều vị trí khác nhau của vùng nội bào. Thụ thể đã hoạt hóa sẽ lôi
kéo một số protein ở bào tương đến để tạo nên một phức hợp protein ở vùng nội
bào. SHC, growth factor receptor 2 (GRB2), GAB2-GRB2- associated binding
protein, SH2-containing Inosito (SHIP), Casitas B-Lineage Lymphoma và CBL
proto-oncogen B là một số ít trong rất nhiều các protein có tương tác với receptor
của FLT3. Mỗi protein gắn với phức hợp sẽ tiếp tục được hoạt hóa tạo nên dãy phản
ứng phosphoryl hóa, dẫn đến sự hoạt hóa một số chất trung gian truyền tin thứ cấp
như MAP kinase, STAT và AKT/PI3 kinase. Một khi được hoạt hóa, các chất trung
gian này sẽ được đi kèm bởi HSP90 đến kỳ giữa của nhân để truyền tin đến nhân. Ở
nhân, các chất trung gian này sẽ kích hoạt một loạt các phản ứng để điều hòa sự biệt
hóa, tăng sinh, chết theo chương trình và sự tồn tại của tế bào [52].

15


Hình 1.6. Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3
Sự kết hợp giữa chất gắn của FLT3 với các yếu tố tăng trưởng khác sẽ kích thích
tăng sinh các tế bào tiền thân tạo máu cũng như các tế bào đầu dòng tủy và lympho.

16


1.4.2. Ý nghĩa của xét nghiệm phát hiện đột biến gen FLT3 trong tiên lượng điều
trị AML
Mặc dù xếp loại WHO năm 2008 không đưa xét nghiệm phát hiện đột biến
FLT3 vào bảng phân loại, nhưng thực tế cho thấy việc triển khai xét nghiệm sàng
lọc FLT3 đối với bệnh nhân được chẩn đoán AML là cần thiết và có giá trị trong
việc định hướng điều trị và tiên lượng của bệnh. Theo tổng kết của Gilliland D.G và
Griffin.J.D dựa trên kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy bệnh nhân AML
có đột biến FLT3-ITD đấy là một tiên lượng xấu trong điều trị (bảng 1.2) [35].
Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lƣợng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trƣởng thành
Kiểu hình
Các
AML ở
trƣờng Tỷ lệ bệnh nhân đột
STT
ngƣời
hợp
biến
trƣởng
NC
thành

1

AML

81

2

AML

140

3

AML

160

4

5

6

AML ở
82
bệnh nhân<
60 tuổi
AML
188

AML

713

Ý nghĩa
tiên lƣợng(p)

Tài liệu
tham khảo

18/81 trường hợp có - Thời gian lui bệnh thấp Rombouts
đột biến FLT3- ITD (p=0.03).
và cộng sự
tỷ lệ (22%)
-Thời gian tái phát cao 2000 [45]
(p=0.01)
- Thời gian sống không
bệnh thấp >60 tuổi
(p=0.003)
47/140 trường hợp - Không phát hiện tiên Stirewalt và
có đột biến FLT3- lượng xấu ở bệnh nhân cộng sự
ITD tỷ lệ (34%) >60 tuổi
2001[52]
14/103 trường hợp -Thời gian sống toàn bộ thấp Abu-Duhier
và cộng sự
có đột biến FLT3- (p=0.0002)
2000 [28]
ITD tỷ lệ (13.2%)
23/82 trường hợp có -Thời gian sống không
Whitman và
đột biến FLT3-ITD bệnh thấp (p=0.0017)

cộng sự
tỷ lệ (28%)
2001 [59]
49/188 trường hợp - Không có sự khác biệt Frohling và
có đột biến FLT3- giữa thời gian sống cộng sự
ITD tỷ lệ (26%) không bệnh và thời gian 2001 [33]
sống toàn bộ
202/713 trường hợp -Thời gian sống không Thiede và
có đột biến FLT3- bệnh thấp
cộng sự
ITD tỷ lệ (25.3%) -Thời gian sống toàn bộ 2001[53]
thấp

17


Tương tự như vậy theo nghiên cứu của National Comprehensive Cancer
Network (NCCN) năm 2013 yếu tố để tiên lượng bệnh nhân AML cũng dựa vào
việc tổn thương gen để phân loại bệnh nhân trong việc chẩn đoán và dùng phác đồ
điều trị thích hợp (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Nhóm tiên lƣợng theo NCCN 2013 [44]
Tiên

Bất thƣờng nhiễm sắc thể và gen

lƣợng
Tốt

t(15;17)(q22;q12-21) – PML/RARA
t(8;21)(q22;q22) - AML1/ETO

inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) – CBFB/MYH11
Đột biến gen NPM1 không kèm đột biến FLT3-ITD
Đột biến gen CEBPA không kèm đột biến FLT3-ITD

Trung bình Không phát hiện nhiễm sắc thể bất thường
t(9;11)(p22;q23) – MLL/AF9, del(7q), del(9q), del(11q), del(20q),
-Y, +8, +11, +13, +21, +22
Xấu

Bất thường nhiễm sắc thể phức tạp ( ≥ 3 bất thường không liên
quan nhau); bất thường 3q, ngoại trừ t(3;5)(q21-25;q31-35);
inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26);
t(6;9)(p23;q34); t(6;11)(q27;q23); t(11;19)(q23;p13.1); del(5q); -5;
-7 ; -17; bất thường17p kết hợp với những đột biến FLT3.

1.4.3. Các loại đột biến trên gen FLT3
Các công trình nghiên cứu về đột biến gen FLT3 ở thế kỷ 20 đã chỉ ra có hai
loại đột biến chính: lặp đoạn nội phân tử (FLT3-ITD) và đột biến điểm (FLT3TKD) [12,24,32,33].

18