Nghiên cứu giá trị của GP73 trong chẩn đoán ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG
CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG
CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B
Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Lê Hữu Song

PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội - 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự được thực hiện dưới sự hướng
dẫn khoa học của PGS.TS Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108, PGS.TS Hoàng
Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Các số liệu, những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này trung
thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào.

Tôi xin chịu trách nhiệm về các kết quả nghiên cứu của mình.

Học viên

Trần Thị Thanh Huyền


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS. Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108; PGS.TS. Hoàng Thị
Mỹ Nhung – Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện

đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. BS. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện
để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân
đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội
108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Sinh học Tế bào và lãnh
đạo Khoa Sinh học đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,
giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Học viên

Trần Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tình hình dịch tễ học bệnh ung thƣ gan. ......................................... 3
1.1.1. Dịch tễ học trên thế giới. ................................................................ 3
1.1.2. Dịch tễ học tại Việt Nam. ............................................................... 4
1.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ gan. .................... 5
1.3. Mối liên quan giữa nhiễm HBV với ung thƣ gan. ........................... 7

1.4. Chẩn đoán ung thƣ biểu mô tế bào gan. .......................................... 8
1.4.1. Khám lâm sàng. .............................................................................. 8
1.4.2. Xét nghiệm cận lâm sàng. .............................................................. 9
1.4.3. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh ........................................... 9
1.4.4. Chọc hút tế bào và sinh thiết khối u ............................................. 11
1.5. Tổng quan về GP73. ......................................................................... 11
1.5.1. Đặc điểm sinh học của GP73. ...................................................... 11
1.5.2. Mức độ biểu hiện protein GP73. .................................................. 13
1.5.3. Điều hòa biểu hiện gen GP73....................................................... 14
1.5.4. Ý nghĩa của GP73 trong chẩn đoán HCC. ................................... 15
1.6. Tình hình nghiên cứu các dấu ấn phân tử về HCC. ..................... 16
1.7. Các phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen hiện nay. ....... 18
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 21
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................... 21
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ................................................... 21
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ....................................................................... 22
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................................ 22
2.2.1. Các hoá chất, sinh phẩm. .............................................................. 22
2.2.2. Các máy và thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu. .................. 23


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. ................................................................ 23
2.3.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm ........................................................... 23
2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................ 24
2.3.3. Xác định mức độ biểu hiện gen mARN GP73. .......................... 24
2.3.4. Định lượng protein GP73 bằng kỹ thuật ELISA. ....................... 29
2.3.5. Các phương pháp định lượng AFP, sinh hoá, hoá nghiệm ......... 31
2.3.6. Xét nghiệm định lượng HBV-ADN............................................ 32
2.3.7. Phân tích và xử lý số liệu. ........................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 33

3.1. Đặc điểm các nhóm nghiên cứu. ..................................................... 33
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới. ............................................................ 33
3.1.2. Đặc điểm về một số chỉ số cận lâm sàng thông thường. ............ 33
3.2. So sánh nồng độ HBV–ADN giữa các nhóm nghiên cứu. ............ 36
3.3. Xác định mức độ biểu hiện GP73. .................................................. 38
3.3.1. Xác định mức độ biểu hiện gen mARN GP73. .......................... 43
3.3.2. Xác định mức độ biểu hiện gen protein GP73............................ 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một số bệnh ung
thư điển hình trên thế giới (Globocan – 2012). ...........................................................3
Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một số bệnh ung
thư điển hình ở Việt Nam (Globocan – 2012). ...........................................................4
Hình 1.3: Các nguyên nhân gây ung thư ....................................................................5
Hình 1.4: Cấu trúc của GP73 và sGP73 ...................................................................12
Hình 2.1: Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman ..........28
Hình 3.1: So sánh nồng độ HBV-ADN giữa các nhóm bệnh gan............................36
Hình 3.2: Kết quả giải trình tự gen GP73 ................................................................44
Hình 3.3: Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang trong Realtime PCR của gen GP73 và gen
nội chuẩn ABL. .........................................................................................................44
Hình 3.4: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và
nhóm người khỏe mạnh.............................................................................................46
Hình 3.5: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
...................................................................................................................................47
Hình 3.6: Đường cong ROC của mARN GP73 và AFP ..........................................47
Hình 3.7: Nồng độ protein GP73. ............................................................................49
Hình 3.8: So sánh mức độ biểu hiện của protein GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và

nhóm người khỏe mạnh.............................................................................................50
Hình 3.9: So sánh mức độ biểu hiện của protein GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
...................................................................................................................................51
Hình 3.10: Đường cong ROC của protein GP73 và AFP ........................................52


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..................................22
Bảng 2.2: Danh mục các thiết bị ..............................................................................23
Bảng 3.1: Đặc điểm về tuổi và giới giữa các nhóm nghiên cứu. .............................33
Bảng 3.2: Đặc điểm về các chỉ số cận lâm sàng giữa các nhóm nghiên cứu. ..........33
Bảng 3.3: So sánh nồng độ AFP giữa các nhóm nghiên cứu ...................................34
Bảng 3.4: Tính chất khối U gan và phân loại mức độ bệnh theo Barcelona Clinic
Liver Cancer (BCLC) ................................................................................................35
Bảng 3.5: So sánh nồng độ HBV–ADN giữa các nhóm nghiên cứu .......................36
Bảng 3. 6: Nồng độ đo OD và độ sạch của ARN .....................................................44
Bảng 3.7: Kết quả định lượng tương đối mARN .....................................................45
Bảng 3.8: So sánh mức độ biểu hiện mARN GP73 giữa nhóm bệnh gan và nhóm
người khỏe mạnh .......................................................................................................45
Bảng 3.9: So sánh mức độ biểu hiện gen mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu
...................................................................................................................................46
Bảng 3.10: Nồng độ đo OD của protein GP73 .........................................................49
Bảng 3.11: So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm bệnh gan và
nhóm người khỏe mạnh.............................................................................................50
Bảng 3.12: So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm nghiên cứu ....51


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFP

: Alpha Feto Protein

bp

: base pair

cADN

: complementary ADN

dNTP

: deoxyribonucleotide triphosphate

ADN

: Acid deoxyribonucleic

ABL

: Abelson

ARN

: Acid ribonucleic

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn

dịch gắn men)

GOLM1

: Golgi Membrane Protein 1

GP73

: Golgi protein 73

HBsAg

: Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt

virus viêm gan B)
HBV

: Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HCC

: Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào gan nguyên
phát)

CHB

: Chronic hepatitis (Viêm gan B mạn tính)

CH

: Healthy control (Nhóm người khỏe mạnh)

LC

: Liver cirrhosis (Xơ gan)

M-MLV

: Moloney Murine Leukemia Virus

mARN

: Messenger ARN

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Real Time PCR

: Real Time Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp tính theo thời gian thực)

RT- PCR

: Reverse transcriptase Polymerase chain Reaction (Phản
ứng chuỗi trùng hợp sử dụng enzyme phiên mã ngược)

RT

: Reverse transcription (Quá trình phiên mã ngược)


ROC curve

: Receiver operating characteristic curve – đường cong
ROC

VGM

: Viêm gan mạn

VRVGB

: Virus viêm gan B


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư gan là một trong những nguyên nhân gây tử vong phổ biến trên thế
giới, đứng hàng thứ 5 đối với nam giới và hàng thứ 9 đối với nữ giới. Theo thống kê
của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), riêng năm 2012 trên thế giới có 789.000 trường
hợp mắc mới và 746.000 trường hợp tử vong. Ung thư gan là nguyên nhân đứng
hàng thứ 2 chỉ sau ung thư phổi cả về tỷ lệ mắc mới và tử vong do các bệnh ung thư
ở Việt Nam.
Kết quả các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm virus viêm gan B
(HBV) là nguyên nhân chủ yếu gây ung thư gan. Tuy nhiên không phải tất cả các
bệnh nhân nhiễm HBV đều tiến triển thành ung thư gan. Nhiễm HBV có thể gây ra
viêm gan cấp tính tự hồi phục, người mang HBV mạn tính không triệu chứng hoặc
tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ gan, viêm gan ác tính, và ung thư gan.
Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới với tỷ lệ

HBsAg (+) ở người lớn khoẻ mạnh từ 10 – 20% có nơi lên tới 26%. Như vậy, với
dân số hơn 90 triệu người, ước tính có hơn 10 triệu người đang mang HBV mạn
tính ở nước ta và nguy cơ phát sinh ung thư gan ở những người này là rất lớn.
Ung thư gan thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn. Nguyên nhân
chẩn đoán ung thư gan muộn là do sự hạn chế về các phương pháp phát hiện hiện
nay. Các phương pháp chẩn đoán và sàng lọc ung thư gan hiện chủ yếu dựa vào xét
nghiệm định lượng AFP trong máu, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner),
chụp cộng hưởng từ. Tuy nhiên, AFP chỉ có độ nhạy 60-70%, trong khi đó siêu âm
chỉ có khả năng phát hiện được khối u gan có kích thước từ 2cm trở lên. Điều này
có nghĩa cần tiếp tục tìm kiếm các công cụ mới hỗ trợ cho phương pháp chẩn đoán
đang có.
GP73 (Golgi protein 73 hay còn được gọi là GOLM1- Golgi Membrane
Protein 1) là một protein xuyên màng golgi type II, có trọng lượng phân tử bằng 73
kDa. Chức năng của nó cho đến nay chưa được xác định rõ ràng. Các nghiên cứu
gần đây cho thấy, GP73 là một marker có tiềm năng hỗ trợ cho chẩn đoán sớm và
sàng lọc. Thậm chí khi so sánh giá trị của GP73 với AFP trong chẩn đoán ung thư

1


gan, một số tác giả còn cho thấy, mặc dù có độ đặc hiệu thấp hơn nhưng GP73 lại
có độ nhạy cao hơn so với AFP. Đặc biệt, khi so sánh đường cong ROC cho thấy
GP73 có giá trị tiên lượng HCC tốt hơn AFP. Với các lý do đó chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài ”Nghiên cứu giá trị của GP73 trong chẩn đoán ung thƣ tế bào
gan trên bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B” với các mục tiêu như sau:
1. Xác định mức độ biểu hiện gen của GP73 trên các nhóm bệnh nhân bệnh
gan do HBV: ung thư gan, xơ gan, viêm gan B mãn tính, và nhóm người khỏe
mạnh.
2. So sánh giá trị chẩn đoán ung thư gan của nồng độ GP73 và AFP huyết
tương.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình dịch tễ học bệnh ung thƣ gan.
1.1.1. Dịch tễ học trên thế giới.
Ung thư gan là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên thế giới, tập trung
chủ yếu ở các nước kém phát triển. Ung thư gan là bệnh có tỷ lệ mắc mới và tử
vong đứng hàng thứ 5 trong số các bệnh lý ác tính. Hàng năm có khoảng 782.000 ca
bệnh mới phát hiện, và tử vong khoảng 746.000 người [28].

Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một
số bệnh ung thƣ điển hình trên thế giới (Globocan – 2012).
Ung thư gan thường tăng theo tuổi, tỷ lệ xuất hiện ung thư thường gặp nhất
là sau tuổi 65. Mặc dù ung thư gan thường ít gặp ở tuổi dưới 50 ở Bắc Mỹ và Tây
Âu, nhưng số liệu gần đây cũng cho thấy tuổi mắc ung thư có xu hướng trẻ hơn
trong khoảng 2 thập kỷ qua [8]. Ở các nước phương Tây ung thư gan cũng thường

3


xuyên xảy ra trên các bệnh nhân xơ gan trên 90%, trong khi đó tại các nước châu Á
và châu Phi thì ung thư gan gặp nhiều hơn trên các bệnh nhân không có xơ gan [8].
1.1.2. Dịch tễ học tại Việt Nam.
Theo WHO, ung thư gan là một trong các loại ung thư thường gặp nhất ở
Việt Nam, đứng hàng thứ 2 trong số các bệnh lý ác tính về tỷ lệ mắc mới và tỷ lệ tử
vong. Hàng năm có khoảng 21.997 ca bệnh mới phát hiện, và tử vong khoảng
20.920 người. Theo “Ghi nhận ung thư quần thể” tại thành phố Hồ Chí Minh năm
2006, ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với tần suất là 24,2/100.000 dân và

đứng hàng thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2/100.000 dân.

Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một
số bệnh ung thƣ điển hình ở Việt Nam (Globocan – 2012).
Tại Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm tiếp nhận khoảng
500 ca ung thư gan mới. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến
10.000 ca mắc bệnh mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan

4


hàng đầu thế giới. Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn muộn
nên việc chữa trị không còn hiệu quả [51].
Do ung thư gan thường đa ổ và đa vị trí nên ngay trong những trường hợp ung
thư gan khu trú có phẫu thuật, chỉ khoảng 30-40% bệnh nhân sống được thêm 5
năm, còn trung bình là khoảng 3 năm.
Một nghiên cứu gần đây dựa trên các số liệu hiện có và sử dụng các thuật
toán để tính toán tiên lượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tăng từ 6,4 triệu
người năm 1990 lên khoảng 8,4 triệu năm 2005 và tiên lượng đến năm 2025 là 8
triệu. Đó là kết quả của chương trình tiêm chủng để phòng nhiễm HBV. Trong khi
đó tỷ lệ xơ gan và ung thư gan do HBV lại có xu hướng tăng cao: năm 1990 là
21.900 đối với xơ gan, 9.400 đối với ung thư gan thì đến năm 2025 các số liệu
tương ứng là 58.650 và 25.000. Tỷ lệ tử vong do HBV tăng từ 12.600 năm 1990 và
có thể lên tới 40.000 ở năm 2025 [51].
1.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ gan.
Hình thành khối ung thư tế bào gan là một quá trình gồm nhiều giai đoạn và bị
tác động bởi nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
một số yếu tố khiến một người có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn những người
khác.

Hình 1.3: Các nguyên nhân gây ung thƣ

5


Viêm gan B: Viêm gan B là bệnh nhiễm trùng do virus tấn công gan, có thể
gây viêm gan cấp tính và mãn tính. Virus viêm gan B lây truyền qua đường máu
hoặc các dịch cơ thể của người mang virus. WHO cho biết hiện nay trên thế giới có
khoảng 240 triệu người mắc viêm gan B mãn tính (được định nghĩa là có kháng
nguyên viêm gan B bề mặt dương tính trong vòng ít nhất 6 tháng) [59]. Trong các
yếu tố nguy cơ gây ung thư gan thì nhiễm HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu (người
mang HBV mạn tính có nguy cơ phát triển ung thư gan cao gấp 100 - 200 lần so với
người không nhiễm loại virus này) [19, 34], là nguyên nhân gây ra 50 - 60% các ca
ung thư gan trên toàn thế giới [22]. Khi đó, ung thư gan là biến chứng muộn của
viêm gan B mãn tính, thường xảy ra vào độ tuổi 40-50 đặc biệt là khi các bệnh nhân
lớn tuổi hoặc bị xơ gan phát triển [19]. Tuy nhiên, không phải tất cả các bệnh nhân
nhiễm HBV đều tiến triển thành ung thư gan. Nhiễm HBV có thể chỉ là người mang
HBV mạn tính không triệu chứng nhưng cũng có thể gây viêm gan cấp tính tự hồi
phục, viêm gan ác tính hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ gan và thậm chí
ung thư gan. Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt đó được nhiều nghiên cứu chứng
minh là có liên quan chặt chẽ đến kiểu gen, đột biến gen của HBV, tính chất di
truyền học của bệnh nhân cũng như quá trình tương tác giữa bộ gen của virus và
ADN của tế bào gan.
Viêm gan C: cũng giống như viêm gan B, viêm gan C là một bệnh truyền
nhiễm bởi virus, có thể gây nên cả viêm gan cấp và mãn tính.. Hiện nay trên thế giới
có 130-150 triệu người mắc viêm gan C mãn tính và có khoảng 500 nghìn người tử
vong vì các bệnh liên quan đến viêm gan C mỗi năm [60]. Đặc biệt, bệnh nhân
dương tính với viêm gan C có nguy cơ mắc ung thư gan cao gấp 17 lần những
người âm tính [14]. Bên cạnh đó, nguy cơ phát triển thành ung thư gan của những
người đã mắc viêm gan C tăng từ 2-6% qua mỗi năm [54]. Trong khi viêm gan B là

nguyên nhân chủ yếu gây ung thư gan tại các nước châu Á và châu Phi thì viêm gan
C lại là nguyên nhân chính gây ung thư gan tại Mỹ, Anh, Canada và Úc [23, 41].
Xơ gan: Xơ gan là bệnh mãn tính của gan, gây hủy hoại các tế bào gan và
thay thế bằng các tổ chức xơ hóa, các mô sẹo (scar tissue), khiến các tế bào mô gan

6


không thể thực hiện chức năng vốn có của nó. Hình thành xơ gan đã được chứng
minh là một phần quan trọng trong việc phát triển thành ung thư gan [40, 36]. Hầu
hết (80-90%) những người tiến triển thành ung thư gan đều đã xuất hiện các triệu
chứng của xơ gan [21]. Xơ gan có thể do các nguyên nhân chủ yếu như lạm dụng
rượu bia, viêm gan B, viêm gan C mãn tính, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu.
Các nguyên nhân này cũng là các yếu tố liên quan mật thiết đến hình thành khối u
tại gan.
Lạm dụng rượu bia: Sử dụng rượu là một nguy cơ đã được chứng minh làm
gia tăng nguy cơ gây ung thư gan [25, 5]. Một nghiên cứu tổng quan hệ thống và
phân tích gộp thực hiện trên 19 nghiên cứu thuần tập chỉ ra rằng những người uống
3 cốc rượu mỗi ngày có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn 16% những người không
uống rượu, còn với những người uống trên 6 cốc rượu mỗi ngày thì tỷ lệ này lên đến
22% [4].
Bên cạnh đó, thuốc lá cũng được chỉ ra là một nguyên nhân trực tiếp dẫn tới
ung thư gan. Trên nhiều nghiên cứu, nguy cơ tương đối giữa hút thuốc lá và ung thư
gan, giữa những người đang hút thuốc lá so với người không hút thuốc vào khoảng
1,2 đến 2 lần. Nguy cơ tương đối này thậm chí còn cao hơn khi so sánh giữa người
nghiện thuốc lá nặng so với người hút ít [11]. Ngoài ra, sử dụng thực phẩm chứa
aflatoxins [38], lạm dụng anabolic steroids [2], có bệnh nhiễm sắc tố sắt mô
(Hemochromatosis) [3], béo phì và tiểu đường [37, 58] là những yếu tố nguy cơ
khác có thể gây ung thư gan; các chất mốc trong lạc, đậu cũng đã được chứng minh
có mối liên quan mật thiết với hình thành ung thư gan.

1.3. Mối liên quan giữa nhiễm HBV với ung thƣ gan.
Từ đầu những năm 1970, viêm gan B mãn tính đã được cho là có liên quan
tới sự phát triển của ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) [55]. Nhiễm virus viêm gan
B là nguyên nhân gây ung thư gan, có đến 80% bệnh nhân HCC bị nhiễm virus
viêm gan B [16]. Trên thế giới có khoảng 5% dân số nhiễm HBV mãn tính, trong đó
châu Á chiếm 75% [49], ở các nước Tây Âu chiếm tỷ lệ ít hơn.

7


Cơ chế bệnh sinh của HBV liên quan đến HCC bao gồm rất nhiều các con
đường phức tạp và nhiều các chất sinh ung thư đã được đưa ra. Những quá trình gây
nên những tổn thương gan mãn tính, xơ gan và khi các tế bào gan tái sinh sẽ gây
nên các đột biến gây ung thư.
Viêm gan B mạn tính là yếu tố nguy cơ lớn nhất gây HCC ở châu Phi và
châu Á. 80% ung thư gan được tìm thấy trên nền gan xơ. Những người mang virus
viêm gan B mãn tính có nguy cơ tăng gấp 100 lần so với quần thể khỏe mạnh không
bị nhiễm. Những nghiên cứu từ Đài Loan chỉ ra mối liên kết trực tiếp giữa việc
mang virus viêm gan B (HBV) và nguy cơ phát triển ung thư gan trong vòng 10
năm [9, 27]. Nguy cơ bị HCC tăng lên rõ rệt khi HBV có số lượng vượt quá 10.000
copies/ml bất kể mức độ viêm gan.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự tương tác qua lại giữa gen HBV và gen
người làm thay đổi dòng tín hiệu nội, ngoại bào, từ đó có thể phát sinh ung thư.
Người ta nhận thấy gen HBx của HBV có một đoạn tương đồng với gen P53. Khi
HBx tích hợp vào bộ gen người sẽ gắn kết và làm bất hoạt gen P53, dẫn đến thay
đổi làm chết tế bào theo chương trình và khối u không bị ức chế. Bằng công nghệ
giải trình tự gen thế hệ mới đã phát hiện ra một vài kiểu gắn kết của gen virus với
gen tế bào gan như gắn kết theo trình tự sắp xếp nucleotide lặp lại phân bố rải rác
trong hệ gan.
1.4. Chẩn đoán ung thƣ biểu mô tế bào gan.

Chẩn đoán ung thư gan hiện nay bao gồm các khám xét lâm sàng, các xét
nghiệm cận lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh và mô bệnh học.
1.4.1. Khám lâm sàng.
Triệu chứng lâm sàng của ung thư gan thường nghèo nàn và không đặc hiệu.
Các triệu chứng này có thể không phát hiện được khi khối u còn nhỏ. Ung thư gan
thường gặp trên nền xơ gan nên có thể có những triệu chứng của xơ gan như chán
ăn, sợ mỡ, mệt mỏi. Bệnh nhân có thể gầy sút, vàng da, rối loạn tiêu hóa… Khi u đã
to, có thể xuất hiện các dấu hiệu như tức hay đau hạ sườn phải, xuất huyết dưới da,

8


phù, cổ trướng… Tuy nhiên, khi đã có những triệu chứng lâm sàng thì bệnh đã vào
giai đoạn muộn.
1.4.2. Xét nghiệm cận lâm sàng.
Một số các xét nghiệm chức năng đông máu, men gan, bilirubin máu,
protein, albumin máu… là những xét nghiệm không đặc hiệu chỉ có giá trị trong
đánh giá chức năng gan.
AFP (alpha-fetoprotein): là một protein trong huyết thanh, xuất hiện ở thời kỳ
bào thai và chỉ tồn tại sau khi trẻ ra đời khoảng 3 đến 4 tuần. Đối với người lớn,
bình thường nồng độ của AFP trong máu thấp dưới 10ng/ml. Khi bệnh nhân bị
HCC, lượng AFP tăng cao. Tuy nhiên, sự tăng nồng độ AFP trong máu phải đạt đến
mức có ý nghĩa là trên 400ng/ml. Ở mức 200 ng/ml độ nhạy của nó giảm đáng kể
(22%). Đối với những khối u nhỏ dưới 3cm đường kính thì AFP có độ nhạy thấp chỉ
đạt 25% [47]. Ngoài ra, AFP có thể tăng lên trong ung thư đường mật trong gan và
một số di căn từ ống tiêu hóa. Với những lý do này, AFP không còn phải là một dấu
hiệu hữu ích cho chẩn đoán HCC đặc biệt là với việc sàng lọc[18] [29].
1.4.3. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh

 Siêu âm

Là một phương pháp tốt, rẻ tiền dễ thực hiện để xác định vị trí và kích thước
tổn thương. Tuy nhiên, độ đặc hiệu không cao vì tỉ lệ dương tính giả cao. Siêu âm
không phân biệt được các nốt tân tạo của xơ gan với các khối u nhỏ. Đối với khối u
dưới 3cm thì độ nhạy 84%. Siêu âm cho phép đánh giá sự lan tràn của tổn thương
như huyết khối tĩnh mạch cửa, hạch ổ bụng, cổ trướng và phần nhu mô gan lành còn
lại.
 Chụp cắt lớp vi tính (CT scanner)
CT scanner là một phương pháp chẩn đoán tốt, có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu
cao và có thể phát hiện được 82% những khối u có đường kính nhỏ hơn 3cm, cho
phép chẩn đoán phân biệt giữa HCC với một số tổn thương u khác ở gan như u máu
(Hemangioma), tăng sản nốt vùng (FNH: Focal Nodular Hyperpasia), u tuyến gan
(Adenoma). Thăm khám u gan cần thực hiện đầy đủ các thì trước tiêm và sau tiêm

9


thuốc cản quang với thì động mạch (25-30 giây từ khi bắt đầu tiêm thuốc), thì tĩnh
mạch cửa (ở giây 60 đến 70) và thì muộn thực hiện sau khoảng 5 phút.
Hình ảnh của HCC được thể hiện như sau:
- Thì trước tiêm: Thường là khối giảm tỉ trọng so với nhu mô gan, có thể một khối,
nhiều khối hoặc lan tỏa. Khối có thể có tỉ trọng không đồng đều do hoại tử, chảy
máu trong khối. Chảy máu trong khối được biểu hiện bằng hình ảnh tăng tỉ trọng tự
nhiên. Khối có thể đẩy lồi bao gan làm biến đổi đường bờ của gan. Có thể có vôi
hóa trong khối 10%.
- Thì động mạch: Khối ngấm thuốc nhanh, dẫn đến hình ảnh khối tăng tỉ trọng hơn
nhu mô gan. Có thể khối bắt thuốc không đồng đều do hoại tử và chảy máu trong
khối như đã nêu trên.
- Thì tĩnh mạch cửa: Để đánh giá sự xâm lấn vào tĩnh mạch cửa.
- Thì muộn: Khối thoát thuốc nhanh nên tỉ trọng của khối sẽ thấp hơn tỉ trọng của
nhu mô gan.

Chụp cắt lớp vi tính tuy có những ưu điểm đáng kể trong chẩn đoán HCC như
độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện những u nhỏ, đánh giá sự lan
tràn của khối u nhưng giá thành cao, độc hại do tia xạ và phải sử dụng thuốc cản
quang nên có thể gây ra tai biến khi sử dụng thuốc, đồng thời phương tiện thiết bị
phải tốt để chụp được đúng các thì.
 Chụp cộng hưởng từ (MRI)
Phương pháp này cho phép phát hiện được các khối u nhỏ hơn 2cm với độ
nhạy 81%. Sau tiêm đối quang từ (Gadolinium, Ferrit) có thể đánh giá được huyết
động của khối u.
Hình ảnh của HCC trên MRI:
- Khối u giảm tín hiệu trên T1 và tăng tín hiệu trên T2, có thể thấy đồng tín hiệu
trên T1 hoặc tăng tín hiệu trên T1 do chảy máu trong khối.
- Sau tiêm thuốc: tăng tín hiệu trên cả T1 và T2, thải thuốc nhanh.
- Có giả vỏ và có các vách xơ trong khối.

10


MRI còn giúp đánh giá được mạch máu của gan, các liên quan giữa tổn thương
với mạch máu trên các mặt phẳng khác nhau. MRI là một phương pháp tốt để chẩn
đoán, là phương pháp an toàn vì không sử dụng tia X. Tuy nhiên, nhược điểm vẫn là
phương tiện chẩn đoán có giá thành cao nên chưa được áp dụng rộng rãi trong điều
kiện Việt Nam ta hiện nay.
 Chụp động mạch gan
Hiện nay ít dùng để chẩn đoán HCC, thường được tiến hành cùng với nút hóa
chất động mạch gan để điều trị.
 Chụp nhấp nháy phóng xạ (Scintigraphy)
Sử dụng đồng vị phóng xạ có thể đánh giá được huyết động và ghi lại độ tập
trung của nó ở gan. Trong HCC là hình khuyết thuốc (ổ lạnh) nếu dùng 99mTc Sulfur
Colloid và hình tăng giữ thuốc nếu dùng

75

Se,

67

Ga-Citrate. Người ta còn sử dụng

kháng thể đơn dòng kháng nguyên của khối u như AFP, CEA gắn với đồng vị
phóng xạ để ghi hình khối u.
1.4.4. Chọc hút tế bào và sinh thiết khối u
Là phương pháp chẩn đoán rất có giá trị (đây là tiêu chuẩn vàng của chẩn
đoán). Đặc biệt là sinh thiết khối u, cho phép thấy được hình ảnh mô bệnh học của
tế bào và tổ chức ung thư. Phương pháp chọc hút tế bào bằng kim nhỏ và sinh thiết
được tiến hành dưới sự hướng dẫn của các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như
siêu âm, chụp cắt lớp vi tính. Mặc dù là tiêu chuẩn vàng nhưng không phải trường
hợp nào cũng cần thiết phải làm. Hạn chế của phương pháp này là gây chảy máu và
khó khăn với những khối u nhỏ, ở sâu.
Phân loại mô học, theo WHO hình ảnh vi thể HCC gồm 5 loại cấu trúc cơ bản:
dạng bè, dạng đặc, dạng giả tuyến, dạng sợi mảnh, dạng xơ hóa [1].
1.5. Tổng quan về GP73.
1.5.1. Đặc điểm sinh học của GP73.
GP73 là một protein xuyên màng golgi type II, có trọng lượng phân tử 73 kDa.
Chức năng của nó cho đến nay chưa được xác định rõ ràng. Gen mã hóa cho GP73
nằm trên cánh lớn nhiễm sắc thể số 9, cách tâm động 21.33 cM. Kích thước của gen

11

là 3042bp, 400 amino acid, khu trú trong phạm vi phức hệ Golgi. GP73 được biểu
hiện trong các tế bào biểu mô người. mARN của GP73 được phát hiện lần đầu tiên
năm 2000 khi người ta khảo sát mức độ biểu hiện gen trên một bệnh nhân viêm gan
dạng tế bào khổng lồ (hợp bào) [31]. Tiếp theo đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
GP73 có biểu hiện ở mức độ thấp trên các tế bào gan bình thường, trong khi đó tăng
rất cao trên các bệnh nhân viêm gan cấp tính, mạn tính và xơ gan [45].
GP73 là một protein được khu trú trong tế bào tuy nhiên nó được biểu hiện
mạnh mẽ trên các mô ngoại bào và gen mã hóa của nó tăng điều hòa trong các bệnh
gan không ác tính. Tuy nhiên, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cho thấy GP73 là
một dấu ấn phân tử có giá trị cao trong chẩn đoán ung thư gan. [45]

.

Hình 1.4: Cấu trúc của GP73 và sGP73
GP73 chứa một đầu tận cùng Nitơ ở trong nội bào với một vùng dịch mã cố
định (myristoylation) tiếp theo là vùng xuyên màng và một vùng ngoại bào có
đầu tận cùng Cacbon có kích thước lớn. Đầu tận cùng Nitơ chứa 2 đoạn xoắn
dạng lò xo và được nitơ hóa. Đầu tận cùng Cacbon có tính axit cao và chưa
rõ chức năng [17].

12


Hiện nay, vai trò sinh học và chức năng sinh hóa của GP73 vẫn chưa được
xác định rõ ràng. Có lẽ GP73 có vai trò cấu trúc trong phức hệ Golgi hoặc tham gia
vào con đường vận chuyển và biến đổi các sản phẩm tiết của nó. Thực tế, phân tích
trình tự của protein này cho thấy chúng không có cấu trúc chức năng đặc biệt.
Luminal coiled-coil domain (phần trình tự đầu N-tận cùng) của nó là cần và đủ cho
sự thu hồi của nó trong phức hệ Golgi, tuy vậy hoạt tính acid ở đầu tận cùng C cho
đến nay vẫn chưa rõ về mặt chức năng [48, 17]. Các nghiên cứu gần đây về gen

knock-down trong các tế bào HepG2.2.15 đã chứng minh rằng ức chế GP73 có liên
quan đến việc giảm diện tích bề mặt của phức hệ Golgi. Do vậy, một số nhà nghiên
cứu cho rằng mức độ biểu hiện của GP73 có thể tham gia vào trong việc duy trì toàn
vẹn cấu trúc của phức hệ Golgi trong việc gây tác động vào tế bào [26, 62].
mARN và protein GP73 biểu hiện cao trong các tế bào HepG2 sau khi nhiễm
adenovirus trong in vitro. Iftikhar và cộng sự nghiên cứu cho thấy GP73 có mặt
trong các tế bào gan của bệnh nhân xơ gan mất bù, do đó họ cho rằng GP73 có thể
hoạt động trong quá trình xử lý của các protein virus trong bộ máy Golgi hoặc trong
việc hình thành các hạt virus lây nhiễm, có thể là cơ hội để virus xâm nhiễm. Ngoài
ra, GP73 có thể là một phần của đáp ứng kháng virus của tế bào chủ [26, 62].
1.5.2. Mức độ biểu hiện protein GP73.
GP73 được biểu hiện trên các tế bào biểu mô người, nó có mặt trong các tế
bào biểu mô đường mật trong gan bình thường ở mức độ thấp. Tuy nhiên, GP73 lại
biểu hiện mạnh trong các tế bào gan và trong các mẫu huyết tương của những bệnh
nhân bị bệnh gan và biểu hiện cao nhất trên bệnh nhân HCC [31, 43]. Theo Kladney
và cộng sự nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện của GP73 trong gan bình thường,
thường chủ yếu từ các tế bào mô đường mật. Ngược lại, mức độ biểu hiện của GP73
lại biểu hiện cao trong các tế bào gan bị bệnh. GP73 không biểu hiện trên các tế bào
viêm hoặc các tế bào trong vách gan xơ. Dựa trên tỉ lệ phần trăm của các tế bào gan
so với các tế bào khác trong bệnh nhân xơ gan, mức độ biểu hiện của GP73 có thể
tăng 36 – 72 lần ở toàn bộ mô. Với mức độ biểu hiện này cho thấy rằng có thể GP73
tham gia vào quá trình chuyển hóa tế bào quan trọng của bệnh gan [32, 33].

13


Theo các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ biểu hiện của GP73 ở những
bệnh nhân ung thư gan rất cao. Đặc biệt là với những bệnh nhân ung thư gan nhưng
xét nghiệm AFP <5..…[24], [45]. Theo nghiên cứu của Mao Y và cộng sự nghiên
cứu trên 4.217 người, trong đó 1.690 người khỏe mạnh, 337 người mang HBV, 512

bệnh nhân bị xơ gan, 789 bệnh nhân bị HCC, 61 bệnh nhân có tổn thương gan ác
tính khác và 622 bệnh nhân mang 14 loại ung thư khác nhau, tác giả đã cho thấy
rằng biểu hiện của GP73 trong huyết tương của bệnh nhân HCC nhiễm HBV cao
hơn đáng kể so với nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, nhóm bệnh nhân không
bị bệnh về gan và nhóm người khỏe mạnh với độ nhạy và độ đặc hiệu của GP73 là
76,9% và 97,4% so với AFP là 58,2% và 85,3%. Biểu hiện của GP73 tăng lên đáng
kể ở nhóm bệnh nhân HCC so với nhóm người khỏe mạnh, và biểu hiện của GP73
giảm xuống đối với những bệnh nhân HCC sau khi đã phẫu thuật cắt bỏ khối u và
nó lại tăng lên đối với trường hợp khối u tái phát [46, 65].
1.5.3. Điều hòa biểu hiện gen GP73.
Dựa trên mô hình nhiễm adenovirus in vitro và trên các nghiên cứu sơ bộ ở
các mẫu sinh thiết của bệnh nhân viêm gan dạng tế bào khổng lồ, một số nghiên cứu
đã chỉ ra rằng gan của các bệnh nhân này GP73 biểu hiện mạnh ở các tế bào đa
nhân [26, 31]. Nghiên cứu của Kladney và cộng sự cho thấy ở những bệnh nhân
viêm gan cấp mức độ biểu hiện của GP73 tăng, nó được thấy trên cả bệnh nhân
viêm gan cấp nhiễm virus viêm gan và bệnh nhân không nhiễm virus viêm gan [32].
Kladney cũng đã nghiên cứu và quan sát trên mô hình nhiễm Adenovirus gây ra
mức độ biểu hiện của GP73 trong các tế bào gan HepG2 và HepG3B. GP73 được
biểu hiện nhanh chóng trong mô hình nghiên cứu này, dựa trên sự có mặt của
protein E1A Adenovirus, điều đó gợi ý cho việc điều hòa ở mức độ phiên mã. Các
tế bào HepG2 2.2.15 ban đầu được chuyển ổn định ở toàn bộ hệ gen HBV vào trong
các tế bào HepG2. Chúng được biểu hiện ở mức độ mARN, và hỗ trợ hình thành
các hạt nhiễm HBV trong in vitro. GP73 biểu hiện mạnh trong các tế bào HepG2
2.2.15, trong khi đó các tế bào HepG2 và HepG2T14 không hỗ trợ hình thành hạt
nhiễm HBV thì GP73 lại không biểu hiện [33].

14


1.5.4. Ý nghĩa của GP73 trong chẩn đoán HCC.

Mức độ biểu hiện cao của GP73 trên bệnh nhân HCC so với bệnh nhân không
ung thư gan đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đánh giá. Vì vậy, nhiều nhà nghiên
cứu cho rằng mức độ biểu hiện của GP73 trong huyết thanh của bệnh nhân HCC
cao hơn hẳn, điều đó đưa đến gợi ý rằng GP73 có thể là một dấu ấn sinh học trong
chẩn đoán sớm ung thư gan [24, 61].
Nghiên cứu của Marrero và cộng sự cho thấy mức độ biểu hiện của GP73
trong huyết thanh cao hơn đáng kể ở bệnh nhân HCC so với bệnh nhân xơ gan. Với
độ nhạy và độ đặc hiệu của GP73 là 69% và 75%, trong khi đó của AFP là 30% và
96%. Nồng độ của GP73 bệnh nhân HCC trên bệnh nhân HCC là 62 và 71% trong
khi đó AFP chỉ dưới 20 và 100ng/ml, điều đó cho thấy ý nghĩa của GP73 trong chẩn
đoán HCC ở những bệnh nhân bình thường và những bệnh nhân có AFP tăng nhẹ
[48].
Mao Y và cộng sự cho rằng mức độ biểu hiện mạnh của GP73 trên bệnh nhân
HCC có HBV dương tính cao hơn so với nhóm người mang virus viêm gan B,
nhóm người không phải bệnh gan và nhóm người khỏe mạnh. Không có sự khác
biệt giữa nhóm người khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân không bị bệnh gan. Với độ
nhạy và độ đặc hiệu của GP73 để chẩn đoán HCC là 76,9% và 92,9% cao hơn đáng
kể so với AFP là 48,6% và 75%. Trong nghiên cứu tác giả cho thấy có đến gần
35,1% bệnh nhân HCC có AFP dưới 25ng/ml [46].
Hu và cộng sự đã nghiên cứu và so sánh các bệnh nhân HCC ở Trung Quốc và
cho rằng độ nhạy và độ đặc hiệu cho chẩn đoán HCC của GP73 là 77,4% và 83,9%
so với AFP là 48,4% và 96,8%. Điều đó gợi ý rằng là GP73 có thể là một trong
những dấu ấn hữu ích ghóp phần để phát hiện sớm bệnh nhân bị HCC. Tác giả cũng
cho thấy có khoảng 49,1% bệnh nhân HCC có AFP dưới 25ng/ml. Sau khi so sánh
GP73 và AFP trên bệnh nhân HCC, tác giả cho rằng GP73 có thể là một trong
những dấu ấn phân tử để chẩn đoán HCC ở quần thể người Trung Quốc [24].
GP73 là một protein xuyên màng type II, nó có mặt trong các tế bào biểu mô
của người. Chức năng sinh hóa và điều hòa biểu hiện của GP73 hiện nay vẫn chưa

15