Phản ứng sinh hóa kiểm nghiệm vi sinh vật

Các th nghi m sinh hóaử ệ
Các th nghi m sinh hóaử ệ
GV: Nguy n Văn H nhễ ạ
Ch ng 4ươ

Phân l p khu n l c thu n khi t là c n ậ ẩ ạ ầ ế ầ
thi t cho đ nh danh VSVế ị

Vi c đ nh danh d a ch y u vào đ c ệ ị ự ủ ế ặ
đi m ki u hình đ c bi t là các ph n ng ể ể ặ ệ ả ứ
sinh hóa.

Có 3 cách s d ng các th nghi m sinh ử ụ ử ệ
hóa đ đ nh danh VSV:ể ị
◦
Cách truy n th ngề ố
◦
S d ng các b KITử ụ ộ
◦
S d ng các thi t b t đ ngử ụ ế ị ự ộ

Th nghi m kh năng lên menử ệ ả
Th nghi m kh năng lên menử ệ ả

Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các
nguồn CH của các VSV

Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid 
giảm pH môi trường

Các loại carbonhydrate

◦
Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
◦
Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
◦
Các loại đường rượu: chứa chức -OH
Phenol Red Carbohydrate Broth
Phenol Red Carbohydrate Broth
H p 115ấ ở
o
C trong 15 phút
Trang 104
Th nghi m kh năng lên menử ệ ả
Th nghi m kh năng lên menử ệ ả

Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường
cần thử nghiệm

VSV sử dụng được nguồn
đường trong môi trường sẽ
làm giảm pH  thay đổi màu
chất chỉ thị phenolred

Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng

Phản ứng (-): môi trường có

màu đỏ
Th nghi m Citrateử ệ
Th nghi m Citrateử ệ

Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử
dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy
nhất.

Cở sở sinh hóa:
◦
VSV sử dụng citrate, sinh ra CO
2
làm kiềm
hóa MT
◦
VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm
duy nhất tạo ra NH
3
làm kiềm hóa MT
Th nghi m Citrateử ệ
Th nghi m Citrateử ệ
Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105)
Ammonium dihydrogen phosphate1.0g
Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO
4
0,2g
Bromothymol blue 0,08g

Agar 13g
Th nghi m Citrateử ệ
Th nghi m Citrateử ệ

Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng đi kèm
Đ i ch ng tr ngố ứ ắ
P âm tínhứ P d ng tínhứ ươ
Th nghi m Ureaseử ệ
Th nghi m Ureaseử ệ

Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease

Cơ sở sinh hoá:
(NH
2
)
2
CO + H
2
O  2 NH
3
+ CO
2
 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)

Môi trường sử dụng:
◦
Urea Broth (Rustigian – Stuart)

◦
Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
Môi tr ng Urea Brothườ
Môi tr ng Urea Brothườ

Thực hiện
◦
Chuẩn bị môi trường
◦
Cấy VSV vào 5ml môi
trường
◦
ủ 37
o
C/24 giờ
◦
Quan sát
Th nghi m Ureaseử ệ
Th nghi m Ureaseử ệ
Thử nghiệm khả năng sinh H
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
2
S
S

Mục đích: phát hiện khả năng sinh H
2
S


Cơ sở sinh hóa:
Acid amin chứa S H
2
S
Thiosulfate H
2
S

H
2
S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì
tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)
desulfohydrase
thiosulfate reductase
Thử nghiệm khả năng sinh H
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
2
S
S

Để phân biệt các loài thuộc họ
Enterobacteriaceae
và giống
Proteus

Môi trường sử dụng:
◦
KIA, TSI (thạch nghiêng)
◦

SIM, PIA (thạch sâu)
◦
BSA (thạch đĩa)
Cấy vsv lên môi trường Ủ (37
o
C, 24 – 48h)
Thử nghiệm khả năng sinh H
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
2
S
S

Đọc kết quả:
Xuất hiện màu đen trong
môi trường
Không xuất hiện màu đen
trong môi trường
(+)
(-)
(+)ĐC
Thử nghiệm khả năng sinh H
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
2
S
S
(+)
(+)
(-)

Pancreatic digest of casein
(casitone)
20.0 g
Peptic digest of animal
tissue (beef extract)
6.1 g
Ferrous ammonium
sulfate
0.2 g
Sodium thiosulfate 0.2 g
Agar 3.5 g
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các
VSV có hệ emzym tryptophanase
Chủng VSV
Chủng VSV
MT canh trypton
MT canh trypton
Thu c th ố ử
Kovac’s
Pứ dương tính
Pứ dương tính
Pứ âm tính
Pứ âm tính
37
o
C / 24h

Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Là phản ứng giúp phân biệt
◦
E. coli
(+) với
Klebsiella
(-)
◦
Proteus

mirabilis
(-) với
Proteus
khác (+)
◦
Bacillus

alvei
(+) với
Bacillus
khác (-)
…

Đối chứng (+)
Proteus

rettgeri
(-)

Serratia

marcescens
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI

KIA: Kligler iron agar (trang 99)
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI

TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
Phenol red 0,025g

Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI

Mục đích: phát hiện khả năng
◦
sử dụng các nguồn cacbonhydrate
◦
sinh H
2
S
◦
tạo hơi (gas)
Ủ 37oC/24 giờ
Ủ 37oC/24 giờ
Quan sát:
Phần nghiêng / phần sâu / hơi /
H
2
S
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm KIA/TSI
1
1
2
2
3
3
4

4
5
5
6
6
7
7
8
8
10
10
9
9
11
11
ĐC
Th nghi m MR (Methyl red)ử ệ
Th nghi m MR (Methyl red)ử ệ

M c đíchụ
:
xác đ nh vi sinh v t s n xu t và duy trì ị ậ ả ấ
các acid b n trong quá trình lên men glucose.ề

C s sinh hóa:ơ ở
◦
Ch t ch th pH: ấ ỉ ị methyl red
◦
MR (+) – càng kéo dài th i gian nuôi c y – môi tr ng ờ ấ ườ
càng acid

◦
MR (-) – càng kéo dài th i gian nuôi c y – các ch t có tính ờ ấ ấ
acid b chuy n hóa – môi tr ng ị ể ườ
d n trung tínhầ
 Th i gian 2 – 5 ngày 37ờ ủ ở
o
C
dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0
Th nghi m MR (Methyl red)ử ệ
Th nghi m MR (Methyl red)ử ệ

Môi tr ng: Glucose Phosphate (MR-VP broth)ườ
Ch ng VSVủ
Ch ng VSVủ
2 – 5 ngàyủ
37
o
C
P âm tínhứ
P âm tínhứ
P d ng tínhứ ươ
P d ng tínhứ ươ
ĐC
ĐC
MR-VP broth
MR-VP broth
Th nghi m VP (Voges – Proskauer)ử ệ
Th nghi m VP (Voges – Proskauer)ử ệ

M c đích:ụ

Phát hi n vsv t o s n ph m trung ệ ạ ả ẩ
tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose

C s sinh hóa:ở ở
Acetoin đ c t o ra trong ượ ạ
đi u ki n y m khí hoàn toàn.ề ệ ế
2 pyruvate acetoin + 2 CO
2