Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp bằng kĩ thuật nuôi vấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ THẢO
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG
LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO
Thái Nguyên, năm 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ THẢO
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG
LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH: SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm
Thái Nguyên, năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm là giáo viên hướng dẫn, cô đã hướng dẫn tận tình và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Trần Thị Hồng – kĩ thuật viên phòng Công
nghệ tế bào – Vi sinh và toàn thể các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN đã giúp đỡ
tôi rất nhiều trong suốt thời gian làm đề tài.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, đã luôn
ở bên cạnh động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.
Trong qua trình thực hiện khóa luận, khó tránh khỏi những sai sót. Vì vậy,
tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè.
Xin cảm ơn thầy cô và các bạn!

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2014
Sinh viên
Phạm Thị Thảo
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ i
LỜI CẢM ƠN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 3
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium 3
1.1.2. Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 4
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật 5
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế
bào 5
1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính 6
1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro 7
1.2.4. Một số thành tựu của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trong lĩnh vực nhân giống
cây trồng 9
1.3. Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam 11
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 13
2.1. Vật liệu thực vật 13
2.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu 13
2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 14

2.3.2. Thăm dò môi trường nuôi cấy 15
2.4. Tính toán kết quả 16
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự sinh trưởng và phát triển của lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) 18
3.2. Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 21
3.3. Ảnh hưởng của α- NAA đến sự phát sinh rễ của lan Phi Điệp 26
(Dendrobium anosmum) 26
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường PM 13
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) 19
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm của lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) 23
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 24
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ α- NAA đến sự ra rễ ở lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 27
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) 29
CT 29
Số rễ/ chồi 30
Chiều dài rễ 30
(cm) 30
Màu sắc lá 30

Sau 4 tuần 30
1,88±0,15 30
1,33±0,09 30
2,65±0,12 30
1,95±0,05 30
2,36±0,04 30
1,84±0,17 30
2,27±0,08 30
1,71±0,03 30
Sau 6 tuần 30
1,95±0,06 30
1,46±0,11 30
2,88±0,07 30
2,45±0,04 30
2,52±0,06 30
1,96±0,08 30
2,48±0,15 30
1,87±0,09 30
Sau 8 tuần 30
2,11±0,03 30
1,58±0,07 30
3,15±0,04 30
2,76±0,05 30
2,73±0,09 30
2,21±0,02 30
2,67±0,08 30
1,96±0,05 30
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của kinetin và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) 32
DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum 5
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) sau 8 tuần nuôi cấy 21
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan
Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần 25
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP 0,7 mg/l và kinetin 1mg/l lên sự sinh trưởng và phát triển
của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 25
Hình 3.4. Ảnh hưởng của α – NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum)
sau 8 tuần nuôi cấy 28
Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích
nghi với thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị
dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Đây là giai đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình
nhân giống in vitro. Các loại giá thể gồm: than hoa, dớn, xơ dừa. Theo dõi sự phát triển của
cây lan trong giai đoạn đầu ngoài môi trường nuôi cấy, tôi tiến hành trồng 30 cây con trên
các giá thể than hoa, dớn, xơ dừa, than củi + xơ dừa, than củi + dớn và xơ dừa + dớn. Kết
quả thu được thể hiện trong bảng 3.10 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐC Đối chứng
CT Công thức
KTST Chất kích thích sinh trưởng
PM Môi trường Phytamax
MS Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
BAP 6 – benzyl amino purin
α – NAA α – Naphthalene acetic acid
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hoa lan là một trong những loài hoa đẹp nhất, tinh khiết, vương giả cao sang,
cùng với vẻ đẹp rực rỡ về màu sắc, quyến rũ về hình dáng, hoa lan còn có công

dụng làm thuốc chữa bệnh mà từ ngàn xưa các danh y đã dùng để cứu người. Hoa
lan đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới.
Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩu
lên đến hàng trăm triệu USD. Vì vậy, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học trong việc
nhân nhanh các giống hoa lan ngày càng phát triển [19].
Hiện nay, trên thế giới ngành công nghệ sinh học phát triển rất mạnh mẽ,
việc ứng dụng các công nghệ cao như: hệ thống fermenter, bioreactor, quang tự
dưỡng…, với mục đích nhân nhanh các giống cây trồng. Việc ứng dụng kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật đã thu được những thành công rực rỡ trong việc nhân
giống cây trồng. Ở nước ta trong những năm gần đây công nghệ này đã được thực
hiện ở một số phòng thí nghiệm của một số trường Đại học, Viện nghiên cứu hoặc
Trung tâm Công nghệ Sinh học. Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng
dụng rất khả quan trên một số đối tượng như: khoai tây, chuối, mía, hoa lan, các cây
thuốc… [1], [6].
Dendrobium anosmum là một giống lan thường mọc ở các quốc gia thuộc
vùng Đông Nam Á, nhưng nay phổ biến trên khắp thế giới bởi vì khá dễ trồng,
nhiều hoa và hương thơm ngào ngạt [19]. Ngoài giá trị làm cảnh, cây còn được
dùng trong y học với tên gọi Thạch hộc. Thạch hộc có vị ngọt nhạt, hơi mặn, không
độc, tính lạnh, có tác dụng tư âm bổ thận, trừ phiền chỉ khát, ích vị sinh tân, bổ
dưỡng thanh nhiệt, chỉ khát, sinh tân dịch chữa lao lực, gầy yếu, ho, sốt nóng,
miệng khô khát, mồ hôi trộm, thiểu năng sinh dục ở nam giới, chân tay và lưng đau
nhức, nóng trong, đau dạ dày, viêm ruột [24].
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, là môi trường thuận lợi cho việc
nuôi trồng và phát triển hoa lan. Việt Nam có tới trên 1100 loài lan, trong đó có
nhiều loài lan rừng quý hiếm được thế giới biết đến. Tuy nhiên, loài lan rừng đang
trong tình trạng báo động vì tình trạng khai thác bừa bãi của con người [10].
1
Hiện nay, ngày càng có nhiều cở sở kinh doanh hoa lan mọc lên, với nhiều
chủng loại, nhưng để có số lượng lớn cây giống, đồng đều và sạch bệnh là một vấn
đề khó. Do đó, để góp phần vào việc nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tạo ra

hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh và đáp ứng giá cả, chúng tôi
chọn đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm.
Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây lan Phi Điệp Dendrobium
anosmum từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin đến sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong
ống nghiệm.
- Thăm dò ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến sự ra
rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm.
- Thăm dò ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum) trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây lan Phi Điệp (xơ
dừa, rong biển, than củi …).
2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và lan Phi Điệp (Dendrobium
anosmum)
1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium
Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc
cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết. Họ phong lan (Orchidaceae)
với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành
hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm [5].
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay,

chi này bao gồm hơn 1200 loài được chia thành 40 nhóm thuộc dòng Dendrobiinae.
Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông
Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Autralia, NewZealand, riêng ở Việt Nam có
trên 110 loài [21].
Về đặc điểm hình thái bên ngoài của chi Dendrobium:
Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc
bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn
ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp
không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp [5]. Rễ của lan
Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục
nát và cây bị chết [5].
Thân lan Dendrobium thuộc loài đa thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò
dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. Thân có dạng mọc thẳng hoặc
rũ xuống [5].
Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày
làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô
hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể
quang hợp được [8]. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu,
thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [6].
3
Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, có
màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng
hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình
chữ V [5]. Các loài thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa khô hạn. Sau
đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2].
Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có
những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống.
Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 lá
đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [2].
Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra

chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh gốc. Ở một số loài khi chín quả không nứt ra nên
hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát [5].
Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ
nên phôi hạt chưa phân hóa. Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [5].
1.1.2. Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum)
Lan Phi Điệp có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc họ Hoàng thảo
(Dendrobium). Lan Phi Điệp còn có tên gọi khác như: Giả hạc, Hoàng thảo đùi gà,
Hoàng thảo dẹt, Huỳnh thảo, Co vàng sao (Thái). Cây được dùng trong y học cổ
truyền với tên thuốc là Thạch hộc hay Kẹp thảo [19]. Cây thường dùng chữa miệng
khô táo khát, phổi kết hạch, đau dạ dày ợ chua, không muốn ăn, di tinh, sau khi khỏi
bệnh bị hư nhược, đổ mồ hôi trộm, lưng gối đau mỏi, nhiệt bệnh thương tổn đến tân
dịch. Liều dùng 8-10g, dạng thuốc sắc. Thạch hộc thường dùng trong các bệnh như
ho khan, khô cổ, háo người, dùng cho các bệnh nhân nam giới sinh hoạt không điều
độ bị đau lưng mỏi gối, bệnh nhân bị thiểu năng sinh dục. Dùng riêng hoặc phối
hợp với các vị thuốc khác: chữa ho thì phối hợp với Mạch môn, vỏ Quýt khô; chữa
đau lưng mỏi gối, gia thêm Câu kỷ, Ngưu tất [24].
Thân dài tới 1,2m buông rũ xuống. Lá mọc đối cách dài 8cm – 12cm, rộng từ
4cm – 7cm. Hoa to tới 10cm mọc từ 1 – 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa
xuân. Dendrobium anosmum có hai màu sắc chính là tím hồng và trắng. Tuy nhiên
khá nhiều biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím, nhưng rất dễ
4
nhầm lẫn với Dendrobium parishii thân ngắn chỉ chừng 30cm –40cm và hoa tím sẫm
hơn nhiều. Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (3 – 4 tuần). Nhiều hoa trên một
phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [20]. Sau khi hoa tàn,
những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nảy sinh ra những cây con.

Hình 1.1. Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum
Giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) được trồng nhiều nhất vì nó tương
đối dễ trồng, khả năng chịu nóng, lạnh tương đối tốt. Loài lan này cần nhiều ánh sáng,
nuôi trồng trong điều kiện nhiệt độ là 8 – 25

0
C, độ ẩm khoảng 60 – 70% [22].
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật
nuôi cấy mô - tế bào
Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào
thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc các mô phân
sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi
mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước
nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1].
5
Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống, đó là: (1) Duy trì và nhân nhanh
các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và nhân nhanh
các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) Nhân
nhanh với điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh cho
cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài tự nhiên có đặc điểm tốt vào
sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập
đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1].
Ngành công nghiệp nuôi cấy mô – tế bào phát triển và mở rộng trong những
năm gần đây do yêu cầu về chất lượng cây giống tăng lên nhanh chóng trên toàn thế
giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm,
thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các
ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sản
xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ
nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây [8];
(2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch bệnh
cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển và
bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận hành trong
bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [17].

1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính
1.2.2.1. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách đúng từ
đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh
trưởng [1]. Trong thực tế, mẫu nuôi cấy được tách với kích thước đó chỉ khi
người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch bệnh cây trồng, do đó phải
kết hợp các yếu tố tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi
cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ
phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Xét về nguồn gốc của cây có ba khả năng:
- Cây phát triển từ chồi đỉnh
6
- Cây phát triển từ chồi nách
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh
Ở lan có sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành, cùng một lúc đỉnh sinh trưởng
tạo hàng loạt protocrom lại tiếp tục phân chia cho ra các protocrom mới hay các
chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh.
1.2.2.2. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công,
các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô –
tế bào [17]. Như các đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ.
1.2.2.3. Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn
chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà
các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô
nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo
khi cấy nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền [17].
Một phương hướng nhân giống vô tính nữa là tạo phôi soma từ tế bào mô
sẹo. phương pháp này đã thành công ở hai đối tượng: Cà rốt (Daucus carota) và
thuốc lá (Nicotiana tabacum).

1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Đỗ Năng Vịnh (2002) quy trình nhân giống mô – tế bào gồm các giai
đoạn sau [17]:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây giống
Vì trong nuôi cấy cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng của cây mẹ
ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường là
cây tốt có giá trị kinh tế cao. Sau đó, chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non,
đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non…
Mô chọn để nuôi cấy thường có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi
cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý báu của cây mẹ, ít có nguy cơ
biến dị, tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
7
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn
này được tiến hành theo các bước: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các mẫu
nuôi cấy. Tiếp theo cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy
có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro). Các mẫu nuôi
cấy nếu không bị nhiễm nấm, virut sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện
nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định từ mẫu nuôi cấy đã xuất
hiện các cụm tế bào, các cơ quan hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này yêu cầu từ 2
– 12 tháng hoặc ít hơn 4 lần cấy các mảnh [17].
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống, quyết định hiệu quả của quy trình
nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi mẫu cấy
sạch đã được tạo ra và từ đó nhân được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh
trưởng tốt trong quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người ta cần tạo
ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện
nuôi cấy cần tối ưu hóa nhằm đạt mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để
nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 – 2 tháng tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh
khoảng 2 – 8 lần sau mỗi lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài

từ 10 – 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo
dài quá lâu. Ví dụ: từ đỉnh sinh trưởng của một cây chối chọn lọc ban đầu người ta
chỉ nhân lên 2000 – 3000 chồi sau 7 – 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma. Đối
với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau một năm có thể nhân lên
1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu [13].
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi được hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh,
nhưng thông thường các chồi này phải chuyển sang một môi trường khác để kích
thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì các chồi tạo rễ trước khi chuyển trực tiếp ra đất,
thông thường giai đoạn này cần 2 – 8 tuần [17].
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí
nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng
8
của quy trình nhân giống mô – tế bào. Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đất
khi chưa có rễ, nhưng với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã tạo rễ và
tạo cây hoàn chỉnh thì mới được chuyển ra ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi
với điều kiện bên ngoài của cây được yêu cầu chăm sóc đặc biệt. Vì vậy được
chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó
khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây con bằng nilon bao phủ
và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm làm mát cây. Giá thể trồng cây có thể là
đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… giai
đoạn này thường đòi hỏi 4 đến 16 tuần [17].
1.2.4. Một số thành tựu của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trong lĩnh vực nhân
giống cây trồng
Nuôi cấy mô – tế bào là một thành tựu khoa học lớn của loài người. Vào đầu
những năm 1960, kỹ nghệ nuôi cấy mô trong nhân giống phong lan trong ống
nghiệm đã được áp dụng thành công. Những cây thược dược (dahlia) sạch virut
được tạo ra bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Hiện có hơn 22 chi phong
lan được nhân giống phổ biến thông qua con đường nuôi cấy mô. Công ty sản xuất

hạt lai Mỹ - Ấn ở Bangalore (Ấn Độ) đã đầu tư trang thiết bị để nhân giống in vitro
và xuất khẩu được hàng triệu cây con sang châu Âu, đã bán hàng trăm ngàn cây
dứa, cây bạch đậu khấu (cardamon) cho nông dân Ấn Độ. Năm 1989, hơn 100.000
cây cà phê con vô tính được nhân giống để cung cấp cho các nước Châu Mỹ latinh
[16].
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã được tiến hành trên 20 năm ở nước ta.
Hiện nay trên cả nước có trên 50 phòng nuôi cây mô – tế bào nằm ở các trường Đại
học, Viện nghiên cứu, trung tâm Công nghệ Sinh học. Quy trình công nghệ nhân
giống đã được nhiều viện nghiên cứu và các trường đại học nghiên cứu hoàn thiện ở
nhiều giống cây trồng khác nhau như: mía, cà phê, hoa lan, cây cảnh và nhân nhanh
các giống cây ăn quả sạch bệnh như đu đủ, dâu tây… [17].
Nhân nhanh chuối (2 triệu cây/năm), nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân
nhanh các giống mía nhập nội (trong vài năm đã tạo ra 5.330 ha mía giống K84-
2000 từ một ngọn mía nhập nội từ Thái Lan); nhân nhanh các giống bạch đàn chọn
9
lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm. Quy trình nhân nhanh giống chuối và giống mía
đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận và áp dụng để chuyển
gen kháng sâu đục thân [13].
Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho cây
ăn quả nhiệt đới phát triển. Hiện nay nước ta có rất nhiều vùng chuyên canh cây ăn
quả được mở rộng, phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu, nhu cầu của công
nghiệp chế biến hoa quả bằng công nghệ nuôi cấy mô đã có nhiều công trình được
công bố trên các đối tượng khác nhau như: đu đủ, dưa hấu, mía,… .
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2003) đã tiến hành vi nhân giống cây đu đủ
(Carica papaya linn), từ chồi đỉnh sinh trưởng của cây trưởng thành có kích thước
1cm – 1,5cm được khử trùng và cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất
kích thích sinh trưởng. Kết quả đã đưa được quy trình nuôi cấy in vitro là 30 ngày,
cây con sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài môi trường tự nhiên [15].
Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các
giống hoa Lilium spp. Trên đối tượng giống hoa Lili nhập từ Mĩ được cấy trên môi

trường cơ bản MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã đưa ra được quy
trình nhân giống củ in vitro các giống hoa Lilium spp [4].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra được môi trường thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l,
agar 8g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/l. Môi trường nhân nhanh protocorm tốt
nhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và BAP
2,0mg/l. Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, than hoạt
tính 1,0g/l, nước dừa 15%, BAP 2,0mg/l và NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho tái
sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường MS cơ bản, bổ
sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho
tạo rễ của chồi in vitro [11].
Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium
fimbriatum (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định
môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường
10
MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; môi trường nhân
nhanh protocorm tốt nhất là môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l,
saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; môi trường MS, bổ sung nước dừa
100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân
nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE (Robert
Ernst), bổ sung saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [12].
Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi
trồng giống lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cứu
cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ
sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ
sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất. Các kết
quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 -
4cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [3].
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in

vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii), kết quả cho thấy, môi trường KC là
phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro. Thể chồi 8 tuần tuổi từ
phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong
môi trường thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l
+ nước dừa 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l + agar 7,0g/l
+ than hoạt tính 0,5g/l [9].
1.3. Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam
Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc
tế. Ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông,… đều
nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nước xuất khẩu phong lan nhiều nhất
Đông Nam Á. Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu
phong lan [22].
Lan Việt Nam đẹp vẻ đẹp thanh cao lại chứa đựng thật nhiều ý nghĩa. Cùng
với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa cao quý này
không chỉ làm đẹp hơn hình ảnh Việt Nam trong con mắt của du khách đến với đất
nước xứ sở nhiệt đới này mà con mang lại hiệu quả kinh tế cao.
11
Trước những năm 1986, nghề trồng hoa của Việt Nam chỉ tập trung ở một
vài làng nghề ở Hà Nội, Hải Phòng, TP. HCM, Đà Lạt và một vài tỉnh miền Tây
Nam bộ. Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo số liệu thống kê năm 1993 chỉ
chiếm 0,02% tổng diện tích đất nông nghiệp. Trong thập niên 80, ngành trồng hoa ở
Việt Nam chỉ là ngành kinh doanh nhỏ của các nhà vườn nhỏ cung cấp cho thị
trường nội địa là chính. Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo thống kê năm 1993
như sau: Hà Nội 500 ha, Hải Phòng 320 ha, TP. HCM 200 ha, Đà Lạt 75 ha, các
tỉnh khác 490 ha. Tổng cộng diện tích trồng hoa của Việt Nam là 1.585 ha. Hà Nội
có các vùng trồng hoa là: Ngọc Hà, Quang Ân, Nhật Tân, Tây Tựu và làng Vĩnh
Tuy. Hải Phòng có vùng Đặng Hải, An Hải. TP. HCM có quận Gò Vấp, Quận 12,
Củ Chi, Bình Chánh tập trung ở quận 11 và 12 và Đà Lạt nổi tiếng như là một thành
phố hoa. Trồng hoa cho thu nhập gấp 10 – 12 lần hơn gạo nên mức sống của người
dân ở những nơi trồng hoa thường cao hơn mức sống của vùng nông nghiệp khác

[23].
Tuy nhiên, trong số các loại hoa được trồng nhiều ở Việt Nam như hoa
hồng, cúc, lay-ơn hoa lan chỉ chiếm xấp xỉ 10%. Hầu hết hoa được trồng trên
những mảnh vườn mở không có lưới và các phương tiện phòng chống mưa, bão, lụt
rất thô sơ nên chất lượng và thời vụ thu hoạch bị ảnh hưởng rất nhiều. Hoa lan tuy
cũng được trồng trong vườn có lưới che mát nhưng cũng không có các phương tiện
bảo vệ tránh gió mưa, bão gây hại cho hoa.
Đà Lạt hiện nay đang trở thành điểm thu hút các nhà đầu tư kinh doanh hoa do sự
thành công của các công ty nước ngoài đầu tư vào cách đây hơn 10 năm như Dalat
Hasfarm chuyên trồng hoa ôn đới; công ty Lâm Thăng Đài Loan chuyên về lan
Phalaenopsis. Vùng Sapa, Tam Đảo rất thích hợp cho việc trồng hoa ôn đới như hồng,
Lyly, lay ơn Riêng hoa lan nhiệt đới, qua các năm từ 2003- 2005 đã tăng từ 20 ha lên 50
ha (tăng 150%). Xu hướng tiêu dùng hoa lan đã tăng lên đáng kể và dự đoán sẽ tăng mạnh
trong thập niên tới do Việt Nam đã là thành viên của tổ chức thương mại thế giới WTO sẽ
là yếu tố tăng mạnh đầu tư nước ngoài làm tăng các dịch vụ du lịch, tổ chức hội nghị quốc
tế [23].
12
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
2.1. Vật liệu thực vật
Giống Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) do phòng Công nghệ tế bào
thực vật – Viện Công nghệ sinh học (Institute of Biotechnology, IBT) cung cấp.
2.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất
Các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin, thạch agar,
đường D – glucose, than hoạt tính, ngoài ra còn bổ sung nước dừa, khoai tây, chuối.
Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường PM (phytamax).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường PM
Thành phần Nồng độ
(mg/l)

Thành phần Nồng độ
(mg/l)
PM1 CaCl
2
166,0 CoCl
2
.6H
2
O 0,0125
PM2 KH
2
PO
4
85,5 CuSO
4
.5H
2
O 0,0125
KNO
3
950,0 Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,125
MgSO
4
.7H

2
O 90,35 PM4 FeSO
4
.7H
2
O 27,8
NH
4
NO
3
825,0 Na
2
EDTA 37,26
PM3 H
3
PO
3
31 PM5 Thiamine HCl 0,10
KI 0,415 Pyridoxine HCl 0,50
MnSO
4
.4H
2
O 8,45 Nicotinic acid 0,50
ZnSO
4
.7H
2
O 5,3 Myo-inositol 100
Dụng cụ

Bình tam giác; pipetman; máy xay sinh tố; cốc thủy tinh định mức; bông;
giấy làm nút; giấy thấm; bình tam giác 250 ml. Bộ đồ cấy gồm: dao cấy; que cấy;
đĩa cấy; buồng cấy vô trùng; nồi khứ trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật); tủ
sấy; cân điện tử của Đức và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:
13
Mẫu giống
Tạo protocorm Tạo đa chồi
Tạo rễ
Tạo đa chồi
Cây hoàn chỉnh
Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm
2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy
Nguyên tắc
Pha môi trường đặc với thành phần, nồng độ và các chất phù hợp. Môi
trường cơ bản là PM, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin, tất cả các
hóa chất tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ
không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng môi trường
trong nồi áp suất ở 120
0
C, áp suất 1,2 atm trong thời gian 20 phút.
Các bước pha môi trường nuôi cấy
Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích hóa chất cần sử
dụng trong môi trường cần nuôi cấy. Ví dụ pha 1 lít môi trường nhân phong lan có
công thức: PM + đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + than hoạt tính 1g + nước
dừa 100ml + khoai tây 40g + chuối 40g pha trong 1 lít môi trường.
Đong khoảng 0,75 lít nước cất đun sôi trên bếp điện. Dùng ống đong lấy
dung dịch PM đã pha vào cốc thủy tinh. Cân đường D-glucose 30g, agar 8,5g, than

hoạt tính 1g, khoai tây 40g, chuối chín 40g. Cho khoai tây, chuối chín vào máy xay,
xay nhuyễn.
14
Khi nước sôi khoảng 50 – 70
0
C thì đổ agar khuấy đến khi nước trong rồi cho
đường, than, khoai tây, chuối chín vào rồi khuấy đều cho tan hết. Bổ sung dung
dịch hóa chất vào cốc thủy tinh. Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cất
cho đủ 1 lít. Chuẩn độ pH của hỗn hợp dung dịch khoảng 5,5 – 5,8.
Chia đều hỗn hợp nuôi cấy vào các bình tam giác đã chuẩn bị sau khi đã sấy
khô. Đậy bình bằng nút bông đã hấp trùng và bên ngoài có đậy bằng nắp giấy, đậy
kín. Sau đó đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 120
0
C, áp suất 1,2 atm trong thời gian
20 phút. Sau khi hấp xong để 2 – 3 ngày cho môi trường ổn định rồi tiến hành cấy.
Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng tia UV trong khoảng
60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội.
2.3.2. Thăm dò môi trường nuôi cấy
Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân chồi và ra rễ ở Lan Phi Điệp
(Dendrobium anosmum), chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi
cấy. Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường PM +
đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + than hoạt tính 1g + nước dừa 100ml +
khoai tây 40g + chuối 40g và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (α – NAA ,
BAP, kinetin).
(1) Môi trường nhân chồi
Các chồi giống được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với các
nồng độ 0,5mg/l – 0,7mg/l – 0,9mg/l – 1,0mg/l hoặc kinetin với các nồng độ
0,5mg/l – 0,7mg/l – 0,9mg/l – 1,0 mg/l – 1,2mg/l; so sánh với môi trường đối chứng
(ĐC) không có BAP hoặc kinetin. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30
mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4 – 6 – 8 tuần nuôi cấy.

(2) Môi trường ra rễ
Môi trường PM bổ sung α - NAA với các nồng độ 0,1mg/l – 0,3mg/l -
0,5mg/l; so sánh với môi trường ĐC không có α - NAA. Mỗi công thức thí nghiệm
được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây
thông qua sự phát sinh rễ, kích thước rễ, sau 4 – 6 – 8 tuần nuôi cấy.
2.3.3. Phương pháp ra cây
15
Khi cây con có rễ dài trung bình từ 2,0cm đến 2,5cm, hoặc lá với chiều dài
trung bình từ 2,0cm đến 3,0cm, bộ rễ khỏe, lá xanh tốt được tiến hành huấn luyện
đưa cây trồng ngoài tự nhiên bằng cách để các bình cây ra nơi có ánh sáng khuếch
tán 2-3 ngày trước khi đưa cây ra khỏi bình.
Khả năng sống của cây khi chuyển từ trong ống nghiệm ra vườn ươm quyết
định hiệu quả kinh tế của phương pháp nhân giống in vitro. Do đó, một quy trình ra
cây đạt hiểu quả cao có ý nghĩa rất lớn.
2.3.3.1. Đưa cây ra ngoài môi trường
Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm 10-15 phút, sau đó lắc nhẹ
cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, cố gắng để
cây được nguyên vẹn không bị dập nát.
Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho hết
thạch bám vào bộ rễ của cây.
Chuẩn bị giá thể trồng cây gồm than hoa, xơ dừa, dớn… Giá thể được đựng
vào khay trồng với bề dày 10cm.
Khay ra cây có thể là khay nhựa hoặc khay gỗ có kích thước vừa phải để có
thể dễ dàng di chuyển vị trí hoặc che đậy, độ sâu khoảng 10-15cm. khay nhựa phải
có lỗ dưới đáy để thoát nước dễ dàng, khay gỗ chỉ có tính chất là một khung, sau đó
lót lưới nhựa cho có độ thông thoáng tốt.
2.3.3.2. Chăm sóc cây con
Cây lan con sau khi chuyển từ hộp nuôi cấy mô chỉ phun nước ngày 2 lần
trong vòng 2 tuần đầu tiên. Tuần lễ thứ 3 phun Vitamin B1 với nồng độ 1ml/lít
nước (2 lần/tuần). Các tuần thứ 4 trở đi có thể phun phân NPK 30-10-10 kết hợp

phân hữu cơ sinh học BiO-1 và Vitamin B1 phun luân phiên từ 1 - 2 lần/tuần. Nồng
độ phân tưới cho lan con như sau: Phân NPK 30-10-10 dùng 0.5 – 1 g/lít nước.
Phân hữu cơ sinh học BiO-1 dùng 1 – 2 ml/lít nước.Vitamin B1 dùng 0.5 - 1ml/lít
nước. Sau 3-4 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra vườn ươm.
2.4. Tính toán kết quả
16
Các số liệu về tỉ lệ sống, tỉ lệ tạo chồi, số chồi trung bình/1 mô, chiều cao
trung bình của chồi, số rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ, số lá/cây, chiều dài trung
bình của lá… của mỗi công thức thí nghiệm được chúng tôi tính toán bằng phần
mềm excell theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn (2000) [7].
17