nghiên cứu phân lập, tinh chế acid salvianolic b từ rễ đan sâm để làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BẠCH THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ
ACID SALVIANOLIC B TỪ RỄ ĐAN SÂM ĐỂ
LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BẠCH THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ
ACID SALVIANOLIC B TỪ RỄ ĐAN SÂM ĐỂ
LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI 2020


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới giáo viên
hướng dẫn PGS.TS Đoàn Cao Sơn -Viện trưởng, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương, Bộ Y tế, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm
huyết giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào
tạo sau đại học, bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy
cô đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng
như trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS. Nguyễn Tuấn Anh, ThS. Trần Thị Thu
Trang là những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp tại Khoa Kiểm
nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã hết sức
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện và hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp một cách thuận lợi.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động viên
tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Hà Nội, ngày 26 tháng 3 năm 2020
Học viên

Bạch Thị Thắm


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................................3
1.1.1. Tổng quan về dược liệu Đan sâm ...............................................................3
1.1.2. Tổng quan về acid salvianolic B ................................................................5
1.2. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn) .................................................................6
1.3. Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế ..................................7
1.3.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu ...................................................................7
1.3.2. Vài nét về phân lập và tinh chế ..................................................................7
1.4. Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid Salvianolic B .............................8
1.4.1. Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B trên thế giới ...............................8
1.4.2. Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B trong nước ...............................10
1.5.Vài nét về phân tích định tính, định lượng acid salvianolic B ............................12
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................14
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................14
2.2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................14
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................14
2.2.2. Dung môi, hóa chất, chất chuẩn ..............................................................15
2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................16
2.3.1. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm...............................................16
2.3.2. Phân lập và tinh chế acid salvianolic B ...................................................16
2.3.3. Xác định cấu trúc, định danh và xác định hàm lượng ..............................16
2.3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định tính, định lượng acid
salvianolic B .......................................................................................................16
2.3.5. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC xác định giới hạn tạp chất
liên quan của acid salvianolic B ........................................................................16
2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................16


2.4.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm .........................16

2.4.2. Phân lập và tinh chế acid salvianolic B ...................................................16
2.4.3. Xác định cấu trúc của chất tinh chế được ................................................18
2.4.4 Xác định hàm lượng của acid salvianolic B tinh chế được.......................18
2.4.5. Xác định giới hạn tạp chất liên quan của acid salvianolic B tinh chế được
............................................................................................................................20
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................21
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...........................................................22
3.1. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Đan sâm .........................................................22
3.1.1. Mô tả.........................................................................................................22
3.1.2. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................22
3.1.3. Định tính, định lượng acid salvianolic B bằng phương pháp HPLC.......23
3.2. Xây dựng quy trình phân lập, tinh chế AS-B từ dược liệu Đan sâm .................25
3.2.1. Xây dựng quy trình chiết xuất AS-B từ dược liệu Đan sâm ....................25
3.2.2. Xây dựng quy trình chiết lỏng-lỏng ..........................................................25
3.2.3. Xây dựng quy trình phân lập acid salvianolic B ......................................27
3.2.4. Tinh chế ....................................................................................................36
3.3. Xác định cấu trúc và nhận dạng chất tinh chế được ..........................................39
3.3.1. Tính chất ...................................................................................................39
3.3.2. Phổ hồng ngoại ........................................................................................39
3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ....................................................................40
3.3.4. Phổ khối ....................................................................................................44
3.4. Xác định độ tinh khiết AS-B tinh chế được .......................................................46
3.4.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng AS-B tinh chế
được bằng HPLC ................................................................................................46
3.4.2. Xác định giới hạn tạp chất liên quan của acid salvianolic B tinh chế được
............................................................................................................................56


CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN ....................................................................................63
4.1. Về quy trình chiết xuất, phân lập acid salvianolic B từ dược liệu Đan sâm ......63

4.2. Về xác định cấu trúc và nhận dạng chất tinh chế được ......................................64
4.3. Về định tính, định lượng, giới hạn tạp chất liên quan của acid salvianolic B tinh
chế được bằng phương pháp HPLC ..........................................................................64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................67


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

AS-B

Acid salvianolic B

BuOH

Butanol

BP

Dược điển Anh

13

13-Carbon nuclear magnetic resonance (Phổ carbon)

C-NMR

CHCl3

Cloroform

C18

Octadecyl silance silica

CP

Chinese Pharmacopeia (Dược điển Trung Quốc)

DAD

Diod Array Detector

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DMSO

Dimethyl sulfoxide

EtOAc

Ethyl acetat

1

HLPC

Proton nuclear magnetic resonance (Phổ hydro)
High Performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IR

Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

LC-MS

Liquid chromatography - Mass Spectometry (Sắc ký lỏng khối phổ)

LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng)

MeOH

Methanol

NMR
PA

nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân)
Pure Analysis (Đạt tinh khiết phân tích)

RP

Reversed phase (Pha đảo)

RSD

Realative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SKĐ

Sắc ký đồ

TLC

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

USP

United State Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)

UV-VIS

Tử ngoại – khả kiến

VKNTTW

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

H-NMR

WHO


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Một số điều kiện định tính acid salvianolic B bằng TLC

12

Bảng 1.2: Một số điều kiện định tính và định lượng acid salvianolic B bằng

13

HPLC
Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài

15

Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng trong đề tài

15

Bảng 2.3: Các phương pháp phân tích AS-B sử dụng trong đề tài

18

Bảng 3.1: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn AS-B

24

Bảng 3.2: Kết quả tính thích hợp hệ thống định lượng AS-B trong dược liệu

24

Bảng 3.3: Kết quả định lượng AS-B trong dược liệu

25

Bảng 3.4: Kết quả định lượng AS-B trong mẫu thử (cắn A)

34

Bảng 3.5: Kết quả định lượng AS-B trong mẫu thử (cắn B)

35

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra khả năng lặp lại của quy trình phân lập

36

Bảng 3.7: Độ lặp lại của quá trình tinh chế

38

Bảng 3.8: Tổng hợp các kết quả đo phổ 1H-NMR

43

Bảng 3.9: Thời gian lưu acid salvianolic B độ đặc hiệu

49

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống

50

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

51

Bảng 3.12: Kết quả độ đúng

52

Bảng 3.13: Kết quả độ lặp lại

53

Bảng 3.14: Kết quả độ ổn định hệ thống của độ chính xác trung gian

53

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian

54

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ chính xác

54

Bảng 3.17: Kết quả xác định hàm lượng AS-B tinh chế được

55

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

58

Bảng 3.19: Kết quả xác định LOD

60

Bảng 3.20: Kết quả các giá trị đáp ứng của mẫu thử nồng độ LOD

61

Bảng 3.21: Kết quả xác định hàm lượng tạp chất

62


DANH MỤC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm

3

Hình 1.2: Cấu trúc một số diterpenoid

4

Hình 1.3: Cấu trúc một số acid phenolic

4

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của acid salvianolic B

5

Hình 1.5: Sơ đồ dự kiến phân lập và tinh chế acid salvianolic B

11

Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm (mẫu nghiên cứu)

22

Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Đan sâm

22

Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b), kết quả chồng phổ

23

DAD (c)
Hình 3.4: Hình ảnh TLC khảo sát phân bố AS-B trong các pha dung môi

26

Hình 3.5: Hình ảnh TLC khảo sát điểm pH acid hóa dung dịch chiết nước

27

Hình 3.6: Hình ảnh TLC khảo sát dung môi sắc ký cột pha thuận

28

Hình 3.7: Hình ảnh TLC khảo sát tỷ lệ dung môi cho sắc ký cột pha đảo

29

Hình 3.8: Sắc ký đồ phân đoạn không phát hiện sự có mặt của AS-B

30

Hình 3.9: Sắc ký đồ phân đoạn có xuất hiện vết AS-B

31

Hình 3.10: Sắc ký đồ TLC so sánh F1, F2, F3

31

Hình 3.11: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của AS-B trong phân lập tinh

33

Hình 3.12: Sắc ký đồ HPLC cắn A và dung dịch chuẩn acid salvianolic B

34

Hình 3.13: Sắc ký đồ HPLC cắn B và dung dịch chuẩn acid salvianolic B

35

Hình 3.14: Hình ảnh TLC khảo sát dung môi rửa giải qua cột pha đảo

36

Hình 3.15: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của AS-B trong các lọ giai đoạn

37

tinh chế
Hình 3.16: Sơ đồ tóm tắt quá trình chiết xuất và phân lập AS-B của đề tài

39

Hình 3.17: Phổ IR của mẫu thử và mẫu chuẩn acid salvianolic B

40

Hình 3.18: Phổ 1H-NMR của acid salvianolic B chuẩn (MeOH-d4,

41

500Mhz)


Tên hình
Hình 3.19: Phổ 13C-NMR của acid salvianolic B chuẩn (MeOH-d4,

Trang
41

125Mhz)
Hình 3.20: Phổ 1H – NMR của chất tinh chế được (MeOH-d4, 500Mhz)

42

Hình 3.21: Phổ 13C – NMR của chất tinh chế được (MeOH-d4, 125Mhz)

42

Hình 3.22: Công thức cấu tạo phân tử của acid salvianolic B

44

Hình 3.23: Phổ khối của mẫu chuẩn acid salvianolic B và chất tinh chế

45

được
Hình 3.24: Sắc ký đồ độ đặc hiệu của phương pháp định lượng AS-B

48

Hình 3.25: Kết quả so phổ cắn tinh chế với chuẩn acid salvianolic B

49

Hình 3.26: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp

58

Hình 3.27: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện

59

tích pic AS-B
Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu thử tạp chất liên quan

61


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, xu hướng sử dụng dược liệu và các chế phẩm có nguồn gốc dược
liệu để phòng và trị bệnh ngày càng phổ biến tại Việt Nam và Thế giới. Vì vậy, việc
sản xuất kinh doanh, lưu thông và sử dụng thuốc y học cổ truyền ngày càng phát
triển. Theo đó thị trường dược liệu cũng sôi động, đa dạng về chủng loại, phong phú
về nguồn gốc. Trong khi đó, công tác quản lý chất lượng dược liệu còn gặp không ít

khó khăn do nhiều nguyên nhân, một trong những nguyên nhân về kỹ thuật là thiếu
chuẩn bao gồm dược liệu chuẩn và chất đối chiếu hóa học.
Dược liệu Đan Sâm là rễ và thân rễ phơi hoặc sấy khô của cây Đan sâm
(Salvia miltiorrhiza Bunge) họ bạc hà (Lamiaceae) [4]. Đan sâm có tác dụng giãn
tĩnh mạch, hoạt huyết, tăng cường tuần hoàn máu, làm hết ứ máu… Vì vậy, Đan
sâm hay được kết hợp với các vị dược liệu khác trong điều trị cho các bệnh nhân
mắc bệnh tim mạch như giúp tiêu huyết khối, chống rối loạn nhịp tim, tăng huyết áp
và thiếu máu cơ tim. Chính vì vậy, hiện nay Đan sâm là một trong các vị thuốc
được sử dụng rộng rãi kết hợp với các vị dược liệu khác trong điều trị tim mạch,
được đầu tư nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên thế giới [9],[21],23].
Trong DĐVN V, CP 2015 và Hong Kong Chinese Materia Medica Standards,
USP 42,... dùng acid salvianolic B để kiểm tra chất lượng dược liệu Đan sâm
[4],[17],[18][19]. Tuy nhiên tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện kiểm
nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh chưa sản xuất và cung ứng được chất chuẩn trên cho
hệ thống kiểm nghiệm, vì vậy việc mua chất chuẩn phục vụ công tác kiểm tra chất
lượng Đan sâm và các chế phẩm chứa Đan sâm trên thị trường gặp rất nhiều khó
khăn như: Giá thành cao, thời gian cung cấp bị kéo dài, không đáp ứng kịp thời nhu
cầu kiểm nghiệm.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào
quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lý chất lượng dược liệu
Đan sâm, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu phân lập, tinh chế acid salvianolic B từ rễ Đan sâm để làm
nguyên liệu thiết lập chuẩn”.
với các mục tiêu:

1


- Phân lập và tinh chế acid salvianolic B từ dược liệu Đan sâm để làm
nguyên liệu thiết lập chuẩn.

- Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng acid salvianolic B
tinh chế được.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về dược liệu Đan sâm
Dược liệu Đan sâm là rễ và thân rễ phơi hoặc sấy khô của cây Đan sâm (Salvia
miltiorrhiza Bunge) họ bạc hà (Lamiaceae) [4].

Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu Đan sâm
S. miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn
Quốc… [21],[23]. Cây Đan sâm trồng tại Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc
được viện Dược liệu trồng ở trại thuốc Sa Pa, Tam đảo…[11],[14].
Dược liệu Đan sâm có hai nhóm hợp chất quan trọng là diterpenoid và các acid
phenolic. Các chất khác như baicalin, beta-sitosterol, acid ursolic, vitamin E, các
tanin... đã được phân lập và xác định cấu trúc [21].
Nhóm diterpenoid tan trong lipid bao gồm 7 nhóm chính: Các dẫn chất
phenanthro furan quinon, các phenanthren, spiro ketal lacton, dẫn chất
phenalenofuran

diterpen,

dẫn

chất

phenanthropyrandion,

dẫn

chất

furonaphthopyrane và phenathro [1,2-b] furan-10,11-dion. Bao gồm trên 40 nhóm
hợp chất: tanshinon IIA, tanshinon IIB, przewaquinon A, cryptotanshinon, .... .

3


Hình 1.2: Cấu trúc một số diterpenoid
Nhóm acid phenolic tan được trong nước, có các hợp chất như: acid
protocatechuic, danshensu, acid acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid
salvianolic C,....

Hình 1.3: Cấu trúc một số acid phenolic

4


Đan sâm có vị đắng, tính hàn, quy vào hai kinh tâm, can. Có tác dụng hoạt
huyết, trục huyết ứ, bổ huyết, bổ can tỳ, dưỡng tâm, an thần, giải độc, ngăn ngừa
xơ vữa động mạch, chống oxy hóa, chống viêm,.... Dùng để trị vô kinh, hành kinh
không đều, đau bụng kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng, các
bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu
đường [9]. Đan sâm hay được kết hợp với các vị dược liệu khác để giúp tiêu huyết
khối, chống rối loạn nhịp tim. Ngoài ra Đan sâm còn được dùng chữa phong thấp
các khớp sưng đau, thần kinh suy nhược, nhức đầu, mất ngủ,...[9],[21],[23].
1.1.2. Tổng quan về acid salvianolic B

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Mỹ, Anh
và Việt Nam, acid salvianolic B là chất chuẩn được dùng để định tính, định lượng
dược liệu Đan sâm và cao Đan sâm.
Acid salvianolic B thuộc nhóm các acid phenolic tan trong nước.
Đặc điểm và tính chất của acid Salvianolic B
- Công thức phân tử: C36H30O16
- Phân tử lượng: 719 g/mol
- Tên khoa học: Acid (2R)-2-[[(2E)-3-[(2S,3S)-3-[[(1R)-1- Carboxy-2-(3,4dihydroxyphenyl) ethoxy] carbonyl]-2-(3,4- dihydroxyphenyl) -7-hydroxy-2,3dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic.
- Công thức hóa học:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của acid salvianolic B

5


- Tính chất lý hóa:
+ Bột hoặc chất rắn dạng tinh thể màu trắng hoặc hơi xám.
+ Độ tan:

Độ tan

Dung môi

-

Ethanol

Khoảng 10 mg/mL

DMSO

Khoảng 20 mg/mL

DMF

Khoảng 20 mg/mL

Nước

Khoảng 20 mg/mL

Đệm phosphat pH 7,2

Khoảng 1 mg/mL

Tác dụng dược lý:
Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng acid salvianolic B có tác dụng ức chế sự

peroxy hóa lipid, giảm sản sinh gốc tự do anion superoxyd [10]. Acid phenolic có
tác dụng chống oxy hóa, chống loãng xương, chống xơ vữa động mạch, chống tiểu
đường, tăng huyết áp, tác dụng bảo vệ thần kinh và có tiềm năng trong nghiên cứu
chống virus [21],[23].
1.2. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn)
Các chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong
các phép thử đã được qui định về hoá học, vật lý, sinh học. Trong các phép thử đó
các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử.
Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Các chỉ tiêu
chung của chất đối chiếu bao gồm: Định tính, định lượng, mất khối lượng do làm
khô, tạp chất liên quan, độ tinh khiết [12],[13].
Chất đối chiếu được sử dụng trong các phép thử định tính, định lượng, xác

định tạp sử dụng các kỹ thuật: Sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ
hồng ngoại, quang phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang...
Trong những năm gần đây, có một số chất chuẩn đối chiếu hóa học từ dược
liệu đạt mức độ tinh khiết nhất định đã được sản xuất trên thế giới như Mỹ, Anh,

6


Đức, Canada, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản…dùng cho kiểm nghiệm dược liệu
và thuốc đông dược. Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu
Âu (EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được
thiết lập với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới.
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế
1.3.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu
Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các
chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh
khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị.
Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ
chiết và phương pháp chiết [2]
Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác
nhau:
- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội.
- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp
chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục.
- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết ngược
dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng.
- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất
khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phương pháp
chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)
- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp

ngấm kiệt
- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm;
Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy
1.3.2. Vài nét về phân lập và tinh chế
Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau:
- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa
lẫn nhau.

7


- Tách bằng sắc ký cột: chất hấp phụ là polyamid, cellulose, silica gel, C18,
sephadex LH-20,...
- Kết tinh lại trong dung môi thích hợp.
- Tách bằng sắc ký lỏng điều chế.
1.4. Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid Salvianolic B
1.4.1. Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B trên thế giới
Cùng với tanshinon IIA, acid salvianolic B là một trong các chất được dùng
để đánh giá chất lượng của dược liệu Đan sâm. Khác với tanshinon IIA là một chất
ít phân cực, acid salvianolic B với cấu trúc chứa nhiều nhóm carboxylic và nhiều
nhóm OH phenol thể hiện tính phân cực khá rõ ràng, việc chiết xuất acid salvianolic
B từ dược liệu vì thế mà cũng thường sử dụng các dung môi có độ phân cực nhất
định như: nước, methanol, ethanol, hỗn hợp methanol – nước… Để tăng tốc độ và
hiệu suất chiết, quá trình chiết thường là chiết nóng. Quá trình loại tạp chất sau khi
chiết thường được thực hiện bằng phương pháp chuyển pha (nhiều lần). Chiết xuất
chứa acid salvianolic B thường được phân tán vào nước, acid hóa đến pH khoảng
2,0 – 3,0 để chuyển acid salvianolic B sang dạng không ion hóa là chủ yếu, dạng
này được chiết vào các dung môi hữu cơ như ethyl acetat, butanol… để loại bớt các
tạp chất tan trong nước. Sau đó dịch chiết thu được trong dung môi hữu cơ lại có thể
tiếp tục được kiềm hóa để chuyển acid salvianolic B sang dạng ion hóa rồi chiết lại

về pha nước, để lại các tạp chất thân dầu bị giữ lại ở pha dung môi hữu cơ [14],[23].
Quá trình phân lập và tinh chế acid salvianolic B từ hỗn hợp chiết được có
thể được thực hiện bằng phương pháp sắc ký: sắc ký ngược dòng tốc độ cao (Highspeed counter-current chromatography (HSCCC)), sắc ký với nhựa hấp phụ, sắc ký
cột pha đảo, sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao… Ngoài ra còn có thể có thêm sự
hỗ trợ của các quá trình biến đổi sinh học để loại bớt các tạp chất [22].
Năm 2009, Yinshi Sun và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế acid
salvianolic A và acid salvianolic B từ rễ Đan sâm bằng phương pháp sắc ký ngược
dòng tốc độ cao (HSCCC). Rễ Đan sâm được chiết nóng bằng ethanol ở 800 C. Hệ
dung môi được sử dụng trong HSCCC là n-hexane–ethyl acetate–methanol–water
(3:6:6:10, tt/tt/tt/tt). Khối lượng acid salvianolic A và acid salvianolic B thu được từ

8


260 mg mẫu thô là 4,27 mg và 32,09 mg, độ tinh khiết tương ứng là 96,67% và
97,43% [22].
Năm 2009, Shidong Kan và cộng sự nghiên cứu phân lập và tinh chế acid
salvianolic B từ rễ đan sâm bằng phương pháp biến đổi sinh học kết hợp với sắc ký
trên vi cầu nhựa (microsphere resin). Đầu tiên, rễ Đan sâm được chiết với nước
nóng (90 0C), dịch chiết nước sau đó được cô đặc và acid hóa đến pH 2,0, chiết lại
acid salvianolic B ở dạng không ion hóa sang dung môi hữu cơ bằng ethyl acetat.
Chiết xuất sau đó được biến đổi sinh học bởi vi sinh vật Fusarium graminearum để
biến đổi acid rosmarinic, một chất khó bị loại đi bởi quá trình sắc ký thông thường,
thành danshensu và acid caffeic, đây là các sản phẩm dễ dàng loại đi hơn. Sau đó
acid salvianolic B được tinh chế bằng sắc ký với vi cầu nhựa, các tác giả so sánh 2
loại dung môi rửa giải là dung dịch methanol trong nước và nước tinh khiết. Độ tinh
khiết của acid salvianolic B lên tới 95% với hiệu suất đạt 62% khi rửa giải với dung
dịch methanol nồng độ 45% và 55%. Khi rửa giải bằng nước tinh khiết, độ tinh
khiết của acid salvianolic B lên tới 99% với hiệu suất đạt 90%. Tổng cả quá trình
biến đổi sinh học và sắc ký với vi cầu nhựa, chọn nước tinh khiết làm dung môi rửa

giải cho hiệu suất thu acid salvianolic B lên tới 75% với độ tinh khiết lên tới 99%.
Phương pháp này cũng được các tác giả đề xuất có thể ứng dụng ở quy mô lớn hoặc
để phân lập và tinh chế các hoạt chất tan trong nước khác [19].
Năm 2010, Hyoung Jae Lee nghiên cứu phân lập và tinh chế acid salvianolic
B từ rễ Đan sâm ở quy mô 200 gam rễ đan sâm/lần chiết. Đầu tiên rễ Đan sâm được
chiết với methanol bằng cách ngâm lạnh (ở nhiệt độ phòng), cao khô sau đó được
phân tán trong nước và loại tạp bằng cách chiết phân bố với cloroform. Acid hóa
pha nước đến pH 3,0 (để chuyển acid salvianolic B về dạng không ion hóa), sau đó
chiết lại acid salvianolic B bằng ethyl acetat. Phân lập acid salvianolic B trong dịch
chiết ethyl acetat bằng phương pháp sắc ký cột với cột Sephadex LH-20, dung môi
rửa giải là hỗn hợp H2O/MeOH (8:2, tt/tt). Cuối cùng tinh chế bằng sắc ký lỏng
điều chế hiệu năng cao với pha tĩnh là cột C18, thu được acid salvianolic B với tỷ lệ
thu hồi là 75% và độ tinh khiết đạt trên 99,2% [17].

9


Năm 2011, Min Zhang và cộng sự nghiên cứu phương pháp đồng thời chiết
xuất và phân lập in situ acid salvianolic B từ rễ Đan sâm. Đan sâm được chiết trong
cột chiết xuất bằng nước sôi, dịch chiết liên tục được tuần hoàn qua cột hấp phụ
chứa nhựa HZ 818 macroporous, trong quá trình đó, các acid salvianolic được hấp
phụ vào cột hấp phụ. Cột hấp thụ sau đó được rửa giải với nước và ethanol 50%, thu
được hỗn hợp các acid salvianolic, trong đó acid salvianolic B chiếm tỷ lệ 55,7%, tỷ
lệ thu hồi là 88,0%. Các thông số của quá trình chiết xuất và phân lập in situ bao
gồm: kích thước dược liệu thô đem chiết, thể tích dung môi chiết, thời gian chiết, tỷ
lệ trương nở của nhựa hấp phụ và các thông số của quá trình rửa giải gồm có: loại
pha động, thể tích pha động, tốc độ rửa giải cũng đã được nghiên cứu tối ưu hóa.
Kết quả của nghiên cứu cho thấy phương pháp đồng thời chiết xuất và phân lập in
situ là phương pháp thu acid salvianolic B tốt hơn so với phương pháp chiết xuất và
phân lập cổ điển gồm nhiều bước. Tuy nhiên, nghiên cứu mới dừng lại ở việc phân

lập ra hỗn hợp các acid salvianolic chưa phân lập và tinh chế được acid salvianolic
B tinh khiết [21].
Năm 2019, Tiantian Ye và cộng sự nghiên cứu điều chế muối dinatri của
acid salvianolic B. Đầu tiên rễ đan sâm được chiết với nước, dịch chiết sau đó được
acid hóa và chiết lại dạng acid không ion hóa sang dung môi hữu cơ là butanol, dịch
chiết butanol sau đó lại được kiềm hóa là chiết lại acid ở dạng ion hóa về lại pha
nước. Acid salvianolic B được tinh chế bằng phương pháp sắc ký, kết quả nghiên
cứu cho thấy nhựa AMBERCHROW CG161M là chất hấp phụ tốt nhất cho acid
salvianolic B trong trường hợp này. Các thông số của quá trình chiết xuất là nhiệt
độ, pH chiết, pH chiết lại và các thông số của quá trình sắc ký cũng đã được tối ưu
hóa [23].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu acid salvianolic B trong nước
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào chiết xuất, phân lập acid
salvianolic B. Qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi dự kiến đưa ra quy trình
phân lập, tinh chế acid salvianolic B như sau:
Giai đoạn 1- Tạo cao từ dƣợc liệu: Dịch chiết nước dược liệu Đan sâm được
đem cô đến cao lỏng rồi thêm ethanol đến nồng độ thích hợp để loại tạp.

10


Giai đoạn 2-Loại tạp bằng phƣơng pháp chiết lỏng lỏng: Cao đặc sau khi
chiết giai đoạn 1 được hòa với nước, lắc loại tạp với n-hexan, dịch chiết nước được
acid hóa đến pH thích hợp và chiết với ethyl acetat.
Giai đoạn 3- Chiết xuất qua cột pha thuận: Cắn cho qua cột silica gel pha
thuận, rửa giải bằng dung môi thích hợp.
Giai đoạn 4-Chiết xuất qua cột pha đảo: Cắn sau chiết pha thuận được cho
qua cột silica gel RP 18, rửa giải bằng dung môi thích hợp.
Giai đoạn 5- Tinh chế: Cắn sau giai đoạn 4 được tinh chế bằng phương pháp
sắc ký cột pha đảo thu được chất có độ tinh khiết cao hơn.

Hình 1.5: Sơ đồ dự kiến phân lập và tinh chế acid salvianolic B

11


1.5. Vài nét về phân tích định tính, định lƣợng acid salvianolic B
Hiện nay có nhiều bài báo cũng như dược điển đưa ra phương pháp phân tích
xác định sự có mặt của acid salvianolic B trong dược liệu, các chế phẩm đông dược
cũng như trong các dịch sinh học. Các kỹ thuật phân tích đã được áp dụng để xác
định sự có mặt của acid salvianolic B cũng rất đa dạng từ những kỹ thuật đơn giản
như sắc ký lớp mỏng đến các kỹ thuật phức tạp hơn như HPLC-DAD, UPLC-MS,
LC-MS… Tuy nhiên một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến hiện
nay là phương pháp TLC và HPLC. Đây là kỹ thuật phân tích cho phép xác định sự
có mặt của acid salvianolic B một cách chính xác, lượng mẫu phân tích không cần
nhiều và đặc biệt có thể áp dụng ở hầu hết các phòng kiểm nghiệm. Sau đây là một
số chương trình sắc ký để phân tích acid salvianolic B mà chúng tôi tham khảo
được:
Bảng 1.1: Một số điều kiện định tính acid salvianolic B bằng TLC
Tài liệu/
Tác giả
DĐVN V

Pha tĩnh
Silica gel G

Pha động
Cloroform - ethyl acetat – toluen -

Phát hiện

UV 254 nm

acid formic – methanol (3:4:2:2:0,5)
CP 2015

Silica gel G

Cloroform - ethyl acetat – toluen -

UV 366 nm

acid formic – methanol (3:4:2:2:0,5)
USP 42

Hyoung Jae

silica gel G

Cloroform - ethyl acetat – toluen -

UV 254 nm và

(HPTLC plates) acid formic – methanol (3:4:2:2:0,5)

366 nm

Silica gel 60F254 Butanol – acid acetic – nước (4:1:2)

Dung dịch 1,1-

Lee, Ki.Lee

diphenyl-2-

[14]

picryhydrazyl
0,2M trong
ethanol

12


Bảng 1.2: Một số điều kiện định tính và định lượng acid salvianolic B bằng HPLC
Tài liệu/ Tác giả
DĐVN V

Pha động

Cột sắc ký

C18 (25cm×4,6mm, 5µm )

Tốc độ Detector

Methanol – acetonitril – acid formic – nước
(30 :10 :1 :59)

CP 2015 [P.402]

C18 (25cm×4,6mm, 5µm )

Acetonitril – acid phosphoric 0,1% (22:78)

1,0

286 nm

độ cột

1,2

286 nm

20°C

286 nm

30°C

286 nm

30°C

ml/phút
C18 (25cm×4,6mm, 5µm )

Acetonitrile

Acid phosphoric 0,05%

1,0

(%)

(%)

ml/phút

0 → 15

10 → 20

90 → 80

15 → 35

20 → 25

80 → 75

35 → 45

25 → 30

75→ 70

45 → 55

30 → 90

70→ 10

55 → 70

90

10

Thời gian
(phút)

Min Zhang, etc
[21]

UV, 

ml/phút

và USP 42
CP 2015 [P.521]

dòng

Nhiệt

C18 (25cm×4,6mm, 5µm )

Acid formic 0,3 %

Methanol

1,0

(%)

(%)

ml/phút

0 → 30

80 → 55

20 → 45

30 → 40

55

45

Thời gian
(phút)

13


CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Dược liệu Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) được mua Nhà
Thuốc YHCT Nguyễn Thị Sáu (46 Lãn Ông - Hoàn Kiếm - Hà Nội).
Kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo chuyên luận Đan sâm – Dược điển Việt
Nam V các chỉ tiêu hình thức, định tính bằng phương pháp TLC, định tính, định lượng
acid salvianolic B bằng phương pháp HPLC.
2.2. Nguyên vật liệu
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ được
quản lý theo hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP
tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Hóa Học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam gồm:
- Máy HPLC SHIMADZU UFLC
- Máy HPLC HITACHI DAD
- Máy sắc ký lỏng khối phổ SCIEX QTRAP 6500+ (Mỹ)
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER-500MHz
- Máy đo phổ hồng ngoại NILOLET iS50 NIR (Thermo)
- Cân kỹ thuật SARTORIUS BSA 224S
- Cân phân tích METTLER TOLEDO
- Tủ sấy MEMMERT UL 40
- Tủ bảo quản lạnh TOSHIBA
- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100
- Cột sắc ký Inertsil RP 18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)
- Bản mỏng Silicagel 60 GF254 (Merck).
- Bản mỏng Silicagel 60 RP - 18 GF254 (Merck).
- Silicagel nhồi cột cỡ hạt 40-63 µm (Merck)
- Silicagel RP-18 nhồi cột cỡ hạt 150 µm (YMC)
- Nồi cách thủy, bộ cất quay chân không BÜCHI V-850
- Tủ hốt
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45μm
- Bộ dụng cụ sinh hàn.

- Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

14


2.2.2. Dung môi, hóa chất, chất chuẩn
Hóa chất, thuốc thử đáp ứng yêu cầu sử dụng trong phòng thí nghiệm đạt chứng
nhận về hệ thống quản lý chất lượng theo ISO/IEC 17025 và GLP.
Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài
TT

Tên dung môi, hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Merck

Dùng cho HPLC

Scharlau

Tinh khiết phân tích

1

Acetonitril

2

Aceton

3

Acid formic

Merck

Tinh khiết phân tích

4

Acid hydrocloric

Fisher

Tinh khiết phân tích

5

Butanol

Merck

Tinh khiết phân tích

6

Cloroform

Merck

Tinh khiết phân tích

7

Dichloromethan

Merck

Tinh khiết phân tích

8

Ethanol tuyệt đối

Việt Nam

Tinh khiết phân tích

9

Ethyl acetat

Merck

Tinh khiết phân tích

10 Methanol

Merck

Dùng cho HPLC

11 Methanol

Prolabo

Tinh khiết phân tích

12 n- Hexan

Merck

Dùng cho GC

13 Nước cất

NIDQC

Dùng cho HPLC

14 Toluen

Merck

Dùng cho HPLC

Chuẩn sử dụng trong đề tài bao gồm chuẩn dược liệu và chất chuẩn hóa học

Bảng 2.2: Các chuẩn sử dụng trong đề tài
STT

Chuẩn

Hàm lƣợng

Nguồn gốc

Số lô

VKNTTW

CV 0116016.01

-

(nguyên trạng)

1

Đan sâm

2

Acid salvianolic B

USP

FOM013

0,95 mg/mg

3

Acid salvianolic B

NIFDC-PCR

111562-201716

94,1 %

15